專利名稱：乳腺癌檢測標記物及其檢測方法、試劑盒和生物芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及人血清/血漿中微小核糖核酸分子的分離、定性和定量分析，同時也涉及乳腺癌的各種臨床指征。具體來說，本發(fā)明是一種利用乳腺癌病人 血清/血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸作為乳腺癌的檢測標記物以及檢測該標記物 的方法、相關試劑盒及生物芯片，通過乳腺癌病人血清/血漿中微小核糖核酸的變化，在體 外診斷乳腺癌，判斷乳腺癌發(fā)病過程，預測乳腺癌并發(fā)癥的發(fā)生和乳腺癌復發(fā)的幾率、以及 乳腺癌的預后，并分析藥效和療效。
背景技術：
乳腺癌已成全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全世界每年約有120萬婦女患乳腺 癌，50萬人死于乳腺癌。僅約1-2%的乳腺患者是男性。中國在過去10年內(nèi)的乳腺癌發(fā)病 率暴增47 %，每年有20余萬乳腺癌新發(fā)病例。乳腺癌是治療效果較好的惡性癌癥之一，但前提是及早發(fā)現(xiàn)、及早治療。目前乳腺 癌早期診斷(微小癌和TO期)在沒有明顯體表特征情況下診出率不高。目前乳腺癌主要診斷方法包括乳腺鉬靶攝像、CT、核磁共振和活組織病理檢查。 同時輔助的檢測手段還包括癌的免疫學反應、體內(nèi)特殊化學成分的測定及酶反應等。血液 中如CAi5-3抗原，癌胚抗原(CEA)，泌乳素(PRL)等檢測都可以對乳腺癌的診斷提供參考， 但這些檢查假陽性與假陰性均較高，特異性不強。盡管越來越多的疾病標記物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應用于臨床疾病的普查、診斷和療效的 監(jiān)控，但是它們的臨床應用效果還存在著明顯不足。例如，腫瘤標記物、乳酸脫氫酶、癌胚抗 原等已被廣泛應用于臨床，但是這些疾病標記物還遠遠不能滿足對癌癥早期診斷的需要， 其主要原因有兩個方面(1)上述疾病標記物的靈敏度和特異性相對較低，它們的檢測結 果還不能作為疾病確診的指標；(2)疾病的早期診斷率應與治療的效果呈現(xiàn)正相關，而上 述任何一種疾病標記物還難以滿足疾病早期診斷的這種要求。以癌癥為例，由于存在著腫 瘤分化類別特異性過強、腫瘤整體敏感性較低、送檢標本難以反復采取、標本保存要求條件 高等缺陷，同時價格昂貴，因此在現(xiàn)有條件下難以廣泛推廣應用現(xiàn)有的腫瘤標記物。而一 些傳統(tǒng)醫(yī)學手段，如組織細胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當、組織細胞標本材料 不足或人為經(jīng)驗不足等都將導致誤診。其它技術例如影像學雖然已被廣泛應用于疾病的檢 查和診斷，但其在疾病程度的定性上仍存在著很大的局限性。因此目前非常有必要尋找能 夠彌補現(xiàn)有標記物的上述缺陷的新型、靈敏并且應用方便的疾病檢測標記物。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈 小核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發(fā) 育、組織分化、細胞調(diào)亡以及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著 緊密的聯(lián)系。最近的研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核 糖核酸的表達水平均有不同程度的下調(diào)(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比較人月市 癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達時，發(fā)現(xiàn)有若干組織特異性微小核糖核酸的表達水 平相對于正常組織發(fā)生了變化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的 發(fā)生和發(fā)展，并且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關聯(lián)(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。這些實驗結果提示微小核糖核酸表達及特異性變化與疾病發(fā)生 和發(fā)展之間存在著必然聯(lián)系。由于微小核糖核酸在基因轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它 與疾病存在以下的關聯(lián)性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因為疾病的抑制 因子以及促進因子都可能是微小核糖核酸的靶位點，當微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表 達，比如本來抑制疾病促進因子的微小核糖核酸表達量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表達量升高了，其最終結果都會導致下游一系列基因表達的變化以及某些通 路的整體紊亂，進而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結果，這是 因為當疾病(如癌癥)發(fā)生時，會導致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的 劇烈擴增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達量將發(fā)生極其顯著的變 化。因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標記物，它的特異性變化必 然與疾病產(chǎn)生發(fā)展相關聯(lián)。同時微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點，通過抑制 疾病過程中上調(diào)的微小核糖核酸或過表達下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病 的發(fā)生和發(fā)展。國內(nèi)目前已有以微小核糖核酸作為疾病標記物的相關研究，如中國專利申請 CN100999765A和CN101298630A，它們均選取占惡性腫瘤發(fā)病率第4位的結腸癌作為研究對 象，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在結腸良性息肉發(fā)展成惡性腫瘤期間，一些微小核糖核酸分子都存在著特 異性變化，并據(jù)此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經(jīng)建立起一種更敏感、更精確的 早期確診結腸癌的方法。然而由于組織標本的取材不容易使這種方法在臨床上的廣泛應用 受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述缺陷，本申請人將研究目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收 集到的血液。由于血液會循環(huán)至全身所有組織，并向細胞輸送營養(yǎng)并清除廢物，因此血液能 夠反映出整個機體的生理病理狀況，其檢測結果對人體健康具有指導意義。已知血清/血 漿中存在著多種蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白等，多種脂質(zhì)，如HDL膽固醇、三甘油脂等， 多種糖質(zhì)，色素，電解質(zhì)和無機鹽，多種酶，如淀粉酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽素脂酶、 醛縮酶等，同時還匯集了來自全身組織器官的多種信號分子，如細胞因子，激素等。目前，對 疾病的診斷僅僅局限于血清/血漿中的上述生化指標，尚無血清/血漿微小核糖核酸的報 道。人們傳統(tǒng)觀念中認為血清/血漿中沒有核糖核酸分子，即使有也會很快被核糖核酸酶 降解為小分子片段而檢測不到。但是，由于微小核糖核酸分子是19至23個核苷酸單元組成，具有結構上的特殊性和相對穩(wěn)定性，它們極有可能存在于血清/血漿中。本申請發(fā)明 人之一張辰宇教授的前期研究已經(jīng)證實，血清/血漿中穩(wěn)定地存在微小核糖核酸，且每一 種疾病有其特異性的變化圖譜(Chen et al :Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res. 2008 Oct ；18(10) 997)。為尋找乳腺癌檢測標記物并對其進行準確檢測，申請人人基于已有的研究成果， 進行了以下幾個方面的研究(1)研究乳腺癌發(fā)病過程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(2)通過用于檢測血清/血漿微小核糖核酸的生物芯片和測序技術測定乳腺癌血 清/血漿微小核糖核酸的變化；(3)將篩選到的在乳腺癌及正常生理狀態(tài)下表達差異程度大的一類血清/血漿微 小核糖核酸分子應用于血清/血漿微小核糖核酸檢測技術，制備應用于乳腺癌診斷等領域 的生物芯片和診斷試劑盒。通過對血清/血漿微小核糖核酸與乳腺癌的相關性的研究，申請人提出了以血清 /血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸作為乳腺癌檢測標記物，建立一種體外檢測血清/ 血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸的方法，通過檢測特定微小核糖核酸的特異性變化來 進行乳腺癌的早期診斷，疾病鑒定和病程監(jiān)控，復發(fā)及預后、并發(fā)癥發(fā)生的預測，同時可以 進一步進行藥效判定、用藥指南、個體化治療、中藥有效成份篩選、種群分類等研究。本發(fā)明的目的首先是提供一種乳腺癌檢測標記物，所述標記物包括以下在人體血 清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體(Mature microRNA)中的任意一種或 一種以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種)，優(yōu)選任意兩種或兩種以 上miR-22> miR-23a> miR-25> miR-92a> miR-10a> miR-199b-3p> miR-206> miR-375> miR-378、miR-151_3p、miR-423_3p、miR-409_3p、miR-483_5p、miR-486_5p、miR-629 和 miR-1307,。上述血清/血漿可以來源于人體活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明的另一個目的是提供檢測上述乳腺癌標記物的方法，通過該方法可以進一 步評價人體乳腺癌的狀態(tài)。上述檢測方法選自反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應方法(RT-PCR)、實時熒光定量聚合酶 鏈式反應方法(Real-time PCR)、Northern印跡雜交方法(Northern blotting)、核糖核 酸酶保護分析方法(RNase protection assay)、Solexa 測序技術(Solexa sequencing technology)或生物芯片方法。上述RT-PCR方法為優(yōu)選方法，包括如下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉(zhuǎn) 錄反應得到cDNA樣品；或者以受試者血清/血漿作為緩沖液進行逆轉(zhuǎn)錄反應來制備cDNA 樣品；2)用微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；3)進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4) EB染色后在紫外燈下觀察結果；
上述Real-time PCR方法為另一優(yōu)選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (如通過Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄 反應得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進行逆 轉(zhuǎn)錄反應來制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物；3)加入熒光探針進行PCR反應；4)檢測并比較血清/血漿樣本相對于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變 化。上述Northern blotting方法包括以下步驟1)提取受試者血清/血漿總RNA (如通過Trizol試劑提取)；2)進行變性PAGE電泳和膜轉(zhuǎn)移實驗；3)制備同位素標記微小核糖核酸探針；4)進行膜雜交反應；5)同位素信號檢測，如磷屏掃描檢測結果。上述RNase protection assay方法包括如下步驟1)進行反義RNA探針的合成，同位素標記與純化；2)提取受試者血清/血漿總RNA (如通過Trizol試劑提取)；3)將提取后的RNA溶解在雜交緩沖液中并加入反義RNA探針進行雜交反應；4)加入RNase消化液進行反應；
5)進行電泳與放射自顯影；6)分析結果。上述 Solexa sequencing technology 方法包括如下步驟1)提取受試者血清/血漿總RNA (如通過Trizol試劑提取)；2)進行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；3)將adaptor prime酶聯(lián)在小RNA分子的3’與5’端；4)進行RT-PCR反應后并進行測序；5)數(shù)據(jù)分析與處理。上述生物芯片方法包括如下步驟1)將人體全部一千多種微小核糖核酸成熟體庫點陣并制備生物芯片；
2)提取受試者血清/血漿總RNA ；3)通過柱分離來分離微小核糖核酸；4)利用T4 RNA連接酶進行微小核糖核酸熒光標記；5)與生物芯片進行雜交反應；6)數(shù)據(jù)檢測與分析。上述方法中所使用的血清/血漿來源于受試者活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明通過上述方法可以分析在乳腺癌患者血清/血漿中微小核糖核酸的變化 趨勢及變化量，以及它們與乳腺癌的相關性。因此，以上檢測受試者血清/血漿中16種特定 微小核糖核酸的方法，可以進一步評價人體乳腺癌的狀態(tài)，進而可以為人們提供一種預測、 診斷、鑒別和/或評價乳腺癌的方法，該方法主要通過檢測受試者血清/血漿中16種特定微小核糖核酸即所謂的乳腺癌檢測標記物來實現(xiàn)。本發(fā)明又一目的是提供上述乳腺癌標記物在制備、預測、診斷、鑒別和/或評價乳 腺癌的試劑或工具中的應用，包括制備相應的試劑盒和生物芯片。本發(fā)明提供了一種用于檢測乳腺癌標記物的微小核糖核酸探針組合，也即預測、 診斷和/或評價乳腺癌的微小核糖核酸探針組合，所述探針組合包括以下核苷酸序列所示 的探針中的任意一種或一種以上，優(yōu)選任意兩種或兩種以上miR-22> miR-23a> miR-25> miR-92a> miR-10a> miR-199b-3p> miR-206> miR-375> miR-378、miR-151_3p、miR-423_3p、miR-409_3p、miR-483_5p、miR-486_5p、miR-629 和 miR-1307。
權利要求
一種乳腺癌檢測標記物，其特征在于所述標記物包括以下在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上miR 22、miR 23a、miR 25、miR 92a、miR 10a、miR 199b 3p、miR 206、miR 375、miR 378、miR 151 3p、miR 423 3p、miR 409 3p、miR 483 5p、miR 486 5p、miR 629或miR 1307。
2.根據(jù)權利要求1所述的乳腺癌檢測標記物，其特征在于，所述標記物包括以下在人 體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意兩種或兩種以上miR-22> miR-23a> miR-25> miR-92a> miR-10a> miR-199b-3p> miR-206> miR-375> miR-378、miR-151_3p、miR-423_3p、miR-409_3p、miR-483_5p、miR-486_5p、miR-629 和 miR-1307。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的乳腺癌檢測標記物，其特征在于所述血清/血漿來源于 人體活體、組織、器官和/或尸體。
4.權利要求1至3任意一項所述檢測標記物的檢測方法，其特征在于選自RT-PCR方 法、實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法、Northern印跡雜交方法、核糖核酸酶保護分析方 法、Solexa測序技術或生物芯片方法。
5.根據(jù)權利要求4所述檢測方法，其特征在于所述RT-PCR方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA樣品；或者收集受 試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進行逆轉(zhuǎn)錄反應來制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；3)進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4)EB染色后在紫外燈下觀察結果。
6.根據(jù)權利要求4所述檢測方法，其特征在于所述Real-timePCR方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA樣品；或者收集受 試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進行逆轉(zhuǎn)錄反應來制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設計引物；3)加入熒光探針進行PCR反應；4)檢測并比較血清/血漿樣本相對于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變化。
7.一種預測、診斷和/或評價乳腺癌的方法，其特征在于所述方法包括檢測以下人體 血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上miR-22> miR-23a> miR-25> miR-92a> miR-10a> miR-199b-3p> miR-206> miR-375> miR-378> miR-151-3p> miR-423-3p> miR-409-3p> miR-483-5p> miR-486-5p> miR-629 miR-1307。
8.權利要求1或2所述的檢測標記物在制備預測、診斷、鑒別和/或評價乳腺癌的試劑 或工具中的應用。
9.一種用于檢測乳腺癌檢測標記物的微小核糖核酸探針組合，其特征在于，所述組合 包括以下探針序列中的任意一種或一種以上
10.一種用于檢測乳腺癌標記物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含檢測權利要求 1或2所述標記物的工具。
11.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述工具包括權利要求9所述的探針組合。
12.根據(jù)權利要求11所述的試劑盒，其特征在于所述工具還包括DNA聚合酶和/或脫 氧核糖核苷酸混合物。
13.一種用于檢測乳腺癌的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含檢測權利要求1 或2中任一項所述的標記物的元件。
14.根據(jù)權利要求13所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的元件包括權利要求 9所述的探針組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用人體血清/血漿中穩(wěn)定存在的16種特定微小核糖核酸作為乳腺癌的檢測標記物以及檢測該標記物的方法、相關試劑盒及生物芯片。能夠用于乳腺癌的診斷與鑒別診斷、疾病并發(fā)癥的發(fā)生和復發(fā)的預測、療效評價，以及藥物活性成分的篩選、藥效評價等方面，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優(yōu)點，該方法可廣泛用于乳腺癌普查等相關工作，改進單一的標記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高乳腺癌的臨床檢出率，成為早期診斷乳腺癌的有效手段。
文檔編號C12Q1/68GK101988061SQ20101023845
公開日2011年3月23日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權日2009年7月30日
發(fā)明者張辰宇, 曾科, 李海進 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司