專利名稱：胃癌檢測標(biāo)記物及其檢測方法、試劑盒和生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人血清/血漿中微小核糖核酸分子的分離、定性 和定量分析，同時(shí)也涉及胃癌的各種臨床指征。具體來說，本發(fā)明是一種利用胃癌病人血清 /血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸作為胃癌的檢測標(biāo)記物以及檢測該標(biāo)記物的方法、 相關(guān)試劑盒及生物芯片，通過胃癌病人血清/血漿中微小核糖核酸的變化，在體外診斷胃 癌與慢性胰腺炎，判斷胃癌發(fā)病過程，預(yù)測胃癌并發(fā)癥的發(fā)生和胃癌復(fù)發(fā)的幾率、以及胃癌 的預(yù)后，并分析藥效和療效。
背景技術(shù)：
胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。在胃的惡 性腫瘤中，腺癌占95%。這也是最常見的消化道惡性腫瘤，乃至名列人類所有惡性腫瘤之前 茅。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀。當(dāng)臨床癥狀明顯時(shí)，病變已屬晚期。我國胃癌死亡率為25. 2/10萬(男性32.8/10萬，女性17. 0/10萬)，占全部惡 性腫瘤死亡的23. 2%,占惡性腫瘤死亡的第一位。胃癌診斷主要依靠X線鋇餐造影、胃鏡和 活組織病理檢查。同時(shí)輔助的檢測手段還包括癌的免疫學(xué)反應(yīng)、體內(nèi)特殊化學(xué)成分的測定 及酶反應(yīng)等。血中如血清胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原I/II之比；CEA，CA19-9，CA125等癌 胚抗原及單克隆抗體的檢測都可以對胃癌的診斷提供參考，但這些檢查假陽性與假陰性均 較高，特異性不強(qiáng)。盡管越來越多的疾病標(biāo)記物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床疾病的普查、診斷和療效的 監(jiān)控，但是它們的臨床應(yīng)用效果還存在著明顯不足。例如，腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白，乳酸脫氫 酶，癌胚抗原等已被廣泛應(yīng)用于臨床，但是這些疾病標(biāo)記物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對癌癥早期診 斷的需要，其主要原因有兩個(gè)方面(1)上述疾病標(biāo)記物的靈敏度和特異性相對較低，它們 的檢測結(jié)果還不能作為疾病確診的指標(biāo)；(2)疾病的早期診斷率應(yīng)與治療的效果呈現(xiàn)正相 關(guān)，而上述任何一種疾病標(biāo)記物還難以滿足疾病早期診斷的這種要求。以癌癥為例，由于存 在著腫瘤分化類別特異性過強(qiáng)、腫瘤整體敏感性較低、送檢標(biāo)本難以反復(fù)采取、標(biāo)本保存要 求條件高等缺陷，同時(shí)價(jià)格昂貴，因此在現(xiàn)有條件下難以廣泛推廣應(yīng)用現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物。 而一些傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)手段，如組織細(xì)胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當(dāng)、組織細(xì)胞標(biāo)本 材料不足或人為經(jīng)驗(yàn)不足等都將導(dǎo)致誤診。其它技術(shù)例如影像學(xué)雖然已被廣泛應(yīng)用于疾病 的檢查和診斷，但其在疾病程度的定性上仍存在著很大的局限性。因此目前非常有必要尋 找能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)記物的上述缺陷的新型、靈敏并且應(yīng)用方便的疾病檢測標(biāo)記物。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 小核糖核酸分子。它們在進(jìn)化上高度保守，并與動物的許多正常生理活動，如生物個(gè)體發(fā) 育、組織分化、細(xì)胞調(diào)亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著 緊密的聯(lián)系。最近的研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核 糖核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比較人月市 癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有若干組織特異性微小核糖核酸的表達(dá)水 平相對于正常組織發(fā)生了變化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的 發(fā)生和發(fā)展，并且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat 1 iver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl—deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)及特異性變化與疾病 發(fā)生和發(fā)展之間存在著必然聯(lián)系。由于微小核糖核酸在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它 與疾病存在以下的關(guān)聯(lián)性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种?因子以及促進(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表 達(dá)，比如本來抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通 路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結(jié)果，這是 因?yàn)楫?dāng)疾病(如癌癥)發(fā)生時(shí)，會導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇 烈擴(kuò)增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。 因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標(biāo)記物，它的特異性變化必然 與疾病產(chǎn)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。同時(shí)微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，通過抑制疾 病過程中上調(diào)的微小核糖核酸或過表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的 發(fā)生和發(fā)展。國內(nèi)目前已有以微小核糖核酸作為疾病標(biāo)記物的相關(guān)研究，如中國專利申請 CN100999765A和CN101298630A，它們均選取占惡性腫瘤發(fā)病率第4位的結(jié)腸癌作為研究對 象，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸良性息肉發(fā)展成惡性腫瘤期間，一些微小核糖核酸分子都存在著特 異性變化，并據(jù)此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經(jīng)建立起一種更敏感、更精確的 早期確診結(jié)腸癌的方法。然而由于組織標(biāo)本的取材不容易使這種方法在臨床上的廣泛應(yīng)用 受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述缺陷，本申請人將研究目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收 集到的血液。由于血液會循環(huán)至全身所有組織，并向細(xì)胞輸送營養(yǎng)并清除廢物，因此血液能 夠反映出整個(gè)機(jī)體的生理病理狀況，其檢測結(jié)果對人體健康具有指導(dǎo)意義。已知血清/血 漿中存在著多種蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白等，多種脂質(zhì)，如HDL膽固醇、三甘油脂等， 多種糖質(zhì)，色素，電解質(zhì)和無機(jī)鹽，多種酶，如淀粉酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽素脂酶、 醛縮酶等，同時(shí)還匯集了來自全身組織器官的多種信號分子，如細(xì)胞因子，激素等。目前，對 疾病的診斷僅僅局限于血清/血漿中的上述生化指標(biāo)，尚無血清/血漿微小核糖核酸的報(bào) 道。人們傳統(tǒng)觀念中認(rèn)為血清/血漿中沒有核糖核酸分子，即使有也會很快被核糖核酸酶 降解為小分子片段而檢測不到。但是，由于微小核糖核酸分子是由19至23個(gè)核苷酸單元組成，具有結(jié)構(gòu)上的特殊性和相對穩(wěn)定性，它們極有可能存在于血清/血漿中。本申請發(fā)明 人之一張辰宇教授的前期研究已經(jīng)證實(shí)，血清/血漿中穩(wěn)定地存在微小核糖核酸，且每一 種疾病有其特異性的變化圖譜(Chen et al Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008 Oct ；18(10) 997)。為尋找胃癌檢測標(biāo)記物并對其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，本發(fā)明人基于已有的研究成果，進(jìn) 行了以下幾個(gè)方面的研究(1)研究胃癌發(fā)病過程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(2)通過用于檢測血清/血漿微小核糖核酸的生物芯片和測序技術(shù)測定胃癌血清 /血漿微小核糖核酸的變化；(3)將篩選到的在胃癌及正常生理狀態(tài)下表達(dá)差異程度大的一類血清/血漿微小 核糖核酸分子應(yīng)用于血清/血漿微小核糖核酸檢測技術(shù)，制備應(yīng)用于胃癌診斷等領(lǐng)域的生 物芯片和診斷試劑盒。通過上述對血清/血漿微小核糖核酸與胃癌的相關(guān)性的研究，申請人提出了以血 清/血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸作為胃癌檢測標(biāo)記物，建立一種體外檢測血清/ 血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸的方法，通過檢測特定微小核糖核酸的特異性變化來 進(jìn)行胃癌的早期診斷，疾病鑒定和病程監(jiān)控，復(fù)發(fā)及預(yù)后、并發(fā)癥發(fā)生的預(yù)測，同時(shí)可以進(jìn) 一步進(jìn)行藥效判定、用藥指南、個(gè)體化治療、中藥有效成份篩選、種群分類等研究。本發(fā)明的目的首先是提供一種胃癌檢測標(biāo)記物，所述標(biāo)記物包括以下在人體血清 /血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體(Mature microRNA)中的任意一種或一 種以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或21 種)，優(yōu)選任意 兩種或兩種以上miR-20a, miR_34a，miR-25，miR_27a，mi R-I，miR_92a，miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。上述可作為胃癌檢測標(biāo)記物的微小核糖核酸，優(yōu)選以下HiiR-I，miR-20a,， miR-27a, miR_34a或miR-423_5p中的任意一種或一種以上。上述血清/血漿可以來源于人體活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測上述胃癌檢測標(biāo)記物的方法，通過該方法可以進(jìn) 一步評價(jià)人體胃癌的狀態(tài)。上述檢測方法選自反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(Real-time PCR)、Northern印跡雜交方法(Northern blotting)、核糖核 酸酶保護(hù)分析方法(RNase protection assay)、Solexa 測序技術(shù)(Solexa sequencing technology)或生物芯片方法。上述RT-PCR方法為優(yōu)選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如使用Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試者的血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA 樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；
3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。上述Real-time PCR方法為另一優(yōu)選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如使用Trizol試劑提取)，通過RNA逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試者的血清/血漿樣本作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備 cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物；3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)檢測并比較血清/血漿樣本相對于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變 化。上述Northern blotting方法包括以下步驟1))提取受試者血清/血漿總RNA(例如使用Trizol試劑提取)；2)進(jìn)行變性PAGE電泳和膜轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)；3)制備同位素標(biāo)記微小核糖核酸探針；4)進(jìn)行膜雜交反應(yīng)；5)同位素信號檢測，如磷屏掃描檢測結(jié)果。上述RNase protection assay方法包括如下步驟1)進(jìn)行反義RNA探針的合成，同位素標(biāo)記與純化；2)提取受試者血清/血漿總RNA (例如使用Trizol試劑提取)；3)將提取后的RNA溶解在雜交緩沖液中并加入反義RNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；4)加入RNase消化液進(jìn)行反應(yīng)；
5)進(jìn)行電泳與放射自顯影；6)分析結(jié)果。上述 Solexa sequencing technology 方法包括如下步驟1)提取受試者血清/血漿總RNA (例如使用Trizol試劑提取)；2)進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；3)將adaptor prime酶聯(lián)在小RNA分子的3’與5’端；4)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后并進(jìn)行測序；5)數(shù)據(jù)分析與處理。上述生物芯片方法包括如下步驟1)將人體血清/血漿中全部一千多種微小核糖核酸成熟體庫點(diǎn)陣并制備生物芯 片；2)提取受試者血清/血漿總RNA (例如使用Trizol試劑提取)；3)通過柱分離來分離微小核糖核酸；4)利用T4RNA連接酶進(jìn)行微小核糖核酸熒光標(biāo)記；5)與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)；6)數(shù)據(jù)檢測與分析。上述方法中所使用的血清/血漿來源于受試者活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明通過上述方法可以分析在胃癌患者血清/血漿中微小核糖核酸的變化趨勢及變化量，以及它們與胃癌的相關(guān)性。因此，以上檢測受試者血清/血漿中21種特定微小 核糖核酸的方法，可以進(jìn)一步評價(jià)人體胃癌的狀態(tài)，進(jìn)而可以為人們提供一種預(yù)測、診斷、 鑒別和/或評價(jià)胃癌的方法，該方法主要通過檢測受試者血清/血漿中21種特定微小核糖 核酸即所謂的胃癌檢測標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明又一目的是提供上述胃癌檢測標(biāo)記物在制備、預(yù)測、診斷、鑒別和/或評價(jià) 胃癌的試劑或工具中的應(yīng)用，包括制備相應(yīng)的試劑盒和生物芯片。本發(fā)明還提供了一種用于檢測胃癌標(biāo)記物的微小核糖核酸探針組合，也即預(yù)測、 診斷和/或評價(jià)胃癌的微小核糖核酸探針組合，所述探針組合包括以下核苷酸序列所示的 探針中的任意一種或一種以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19,20或21種)，優(yōu)選任意兩種或兩種以上miR-20a, miR_34a，miR—25，miR_27a，mi R-I，miR_92a，miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
權(quán)利要求
一種胃癌檢測標(biāo)記物，其特征在于所述標(biāo)記物包括以下在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上miR 20a，miR 34a，miR 25，miR 27a，miR 1，miR 92a，miR 223，miR 320，miR 375，miR 151 3p，miR 324 3p，miR 339 3p，miR 423 5p，miR 451，miR 486 5p，miR 629，miR 652，miR 320b，miR 320c，miR 1224和miR 1307。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述胃癌檢測標(biāo)記物，其特征在于，所述標(biāo)記物包括以下在人體血 清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意兩種或兩種以上miR-20a, miR-34a, miR-25, miR-27a, miR-1, miR-92a, miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胃癌檢測標(biāo)記物，其特征在于所述標(biāo)記物包括以下在人 體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上miR-1, miR-20a,，miR-27a, miR_34a，禾口 miR-423_5p。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胃癌檢測標(biāo)記物，其特征在于所述血清/血漿來源于人 體活體、組織、器官和/或尸體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胃癌檢測標(biāo)記物，其特征在于所述血清/血漿來源于人體活 體、組織、器官和/或尸體。
6.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述標(biāo)記物的檢測方法，其特征在于選自反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 式反應(yīng)方法、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、Northern印跡雜交方法、核糖核酸酶保護(hù) 分析方法、Solexa測序技術(shù)或生物芯片方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法包括 以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4)EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方 法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物；3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)檢測并比較血清/血漿樣本相對于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變化。
9.一種預(yù)測、診斷和/或評價(jià)胃癌的方法，其特征在于，所述方法包括檢測以下人體血 清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上miR-20a, miR-34a, miR-25, miR-27a, miR-1, miR-92a, miR-223, miR-320, miR-375, miR-151-3p, miR-324-3p, miR-339-3p, miR-423-5p, miR-451, miR-486-5p, miR-629, miR-652, miR-320b, miR-320c, miR-1224 和 miR-1307。
10.權(quán)利要求1或2或3所述的檢測標(biāo)記物在制備預(yù)測、診斷、鑒別和/或評價(jià)胃癌的 試劑或工具中的應(yīng)用。
11.一種用于檢測胃癌檢測標(biāo)記物的微小核糖核酸探針組合，其特征在于所述組合包 括以下探針序列中的任意一種或一種以上__
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的探針組合，其特征在于所述組合包括以下核苷酸序列所示 的探針中的任意一種或一種以上
13.一種用于檢測胃癌標(biāo)記物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含檢測權(quán)利要求1 至3中任一項(xiàng)所述標(biāo)記物的工具。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于所述工具包括權(quán)利要求11或12所述 的探針組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于所述工具還包括DNA聚合酶和/或脫 氧核糖核苷酸混合物。
16.一種用于檢測胃癌檢測標(biāo)記物的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含檢測權(quán) 利要求1至3任意一項(xiàng)所述的標(biāo)記物的元件。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片的元件包括權(quán)利要 求11或12所述的探針組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用人體血清/血漿中穩(wěn)定存在的21種特定微小核糖核酸作為胃癌的檢測標(biāo)記物以及檢測該標(biāo)記物的方法、相關(guān)試劑盒及生物芯片。能夠用于胃癌的診斷與鑒別診斷、疾病并發(fā)癥的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測、療效評價(jià)，以及藥物活性成分的篩選、藥效評價(jià)等方面，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優(yōu)點(diǎn)，該方法可廣泛用于胃癌普查等相關(guān)工作，改進(jìn)單一的標(biāo)記物所難以克服的個(gè)體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高胃癌的臨床檢出率，成為早期診斷乳腺癌的有效手段。
文檔編號C12N15/11GK101988059SQ20101023844
公開日2011年3月23日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者劉銳, 巴一, 張辰宇, 曾科, 李海進(jìn) 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司