專利名稱：輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法及其專用引物對的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法及其專用引物對。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲病是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，危害3000多種植物。全 球每年因線蟲造成的損失高達(dá)1000多億美元。植物根結(jié)線蟲病害在我國發(fā)生比較廣泛，尤 其在南方地區(qū)危害比較嚴(yán)重，如香蕉根結(jié)線蟲、西瓜根結(jié)線蟲、辣椒根結(jié)線蟲。由于根結(jié)線 蟲種間存在顯著的致病性差異，作物抗性和植物檢疫等成功的應(yīng)用依賴于對根結(jié)線蟲種類 進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，因而，采取可靠的分類鑒定方法是植物線蟲病害防治的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外學(xué)者常利用mtDNA-RFLP、rDNA-ITS及SCAR等方法鑒定根結(jié)線蟲的種 類，然而因其各自的局限性(mtDNA-RFLP耗時(shí)較長、rDNA-ITS精確度不高、SCAR靈敏度不 強(qiáng))而不能達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法及其專用引物對。本發(fā)明保護(hù)序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對乙。 所述引物對乙可用于輔助鑒別南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒別南方根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA ；(2)以基因組DNA為模板，用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 待測根結(jié)線蟲為候選的南方根結(jié)線蟲；如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選 的非南方根結(jié)線蟲。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為400bp-600bp。本發(fā)明還保護(hù)引物對甲和引物對乙組成的專用引物；所述引物對甲由序列表的序 列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物對乙由序列表的序列3所示DNA 和序列表的序列4所示DNA組成。所述專用引物可用于輔助鑒別根結(jié)線蟲。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA ；(2)以基因組DNA為模板，用所述專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的 南方根結(jié)線蟲；如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的非南方根結(jié)線蟲；用所述引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)如果得到1. 6kb-l. 8kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根 結(jié)線蟲為候選的南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲；如果得到1. Okb-1. 2kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待 測根結(jié)線蟲為候選的花生根結(jié)線蟲；如果得到0. 4kb-0. 6kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲 為候選的北方根結(jié)線蟲。用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為400bp_600bp。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對甲。所述引物對甲可用于輔助鑒別根結(jié)線蟲。本發(fā)明提供了另一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA ；(2)以基因組DNA為模板，用所述引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到1. 6kb-l. 8kb 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲；如果得 到1.01Λ-1.21Λ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的花生根結(jié)線蟲；如果得到 0. 4kb-0. 6kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的北方根結(jié)線蟲。以上任一所述輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法中所述待測根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲或北方根結(jié)線 蟲。所述基因組DNA取自成蟲、幼蟲或卵囊。當(dāng)基因組DNA取自成蟲或幼蟲、所述PCR所用的引物對為所述引物對甲時(shí)，所述 PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。當(dāng)基因組DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物對為所述引 物對甲時(shí)，所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin、48°C退火lmin、72°C 延伸2min，進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。當(dāng)基因組DNA取自成蟲或幼蟲、所述PCR所用的引物對為所述引物對乙時(shí)，所述 PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。當(dāng)基因組DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物對為所述引物 對乙時(shí)，所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸 45S，進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫^iin ；以上任一所述方法在均可用于輔助鑒定根結(jié)線蟲染病植物。應(yīng)用本發(fā)明的引物對輔助鑒定時(shí)，基因組DNA既可以取自線蟲成蟲、線蟲幼蟲、線 蟲卵囊，也可以取自感染根結(jié)線蟲的植物的根結(jié)(根瘤)。為了克服現(xiàn)有的方法不能快速、準(zhǔn)確地鑒定根結(jié)線蟲的不足，本專利提供一種鑒 定根結(jié)線蟲的方法，該P(yáng)CR方法不僅能準(zhǔn)確區(qū)分四種常見的根結(jié)線蟲，而且靈敏度高，可利 用單個(gè)卵囊或單條二齡幼蟲鑒定根結(jié)線蟲種類，可以直接從病組織中分離獲得，無需純化 培養(yǎng)，可以大大縮短線蟲純化培養(yǎng)時(shí)間，提高檢測效率。


圖1為實(shí)施例2中采用引物對甲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖2為實(shí)施例2中采用引物對乙的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖3為實(shí)施例5中采用引物對甲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
圖4為實(shí)施例5中采用引物對乙的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。8個(gè)根結(jié)線蟲種群5個(gè)南方根結(jié)線蟲種群(分離自5個(gè)染病植株)；1個(gè)爪哇根結(jié) 線蟲種群；1個(gè)花生根結(jié)線蟲種群；1個(gè)北方根結(jié)線蟲種群。實(shí)施例1、引物的制備人工合成如下四條引物#C2F3 :5，-GGTCAA TGTCAGAAA TTTGTGG-3‘；序列 1 ；#1108:5' -TACCTTTGACCAA TCACGCT-3‘；序列 2 ；MI-F :5，-GGGCAAGTAAGGATGCTCTGAC-3‘；序列 3 ；MI-R (5 ‘ -CTTTCATAGCCACGTCGCGATC-3 ‘；序列 4。#C2F3和# 1108組成的引物對作為引物對甲，MI-F和MI-R組成的引物對作為引物 對乙。引物對甲針對線粒體DNA(mtDNA)中的CO II和LrRNA間區(qū)域。引物對乙針對食管
腺蛋白基因。實(shí)施例2、應(yīng)用引物對輔助鑒別根結(jié)線蟲(成蟲)一、用引物對甲輔助鑒別根結(jié)線蟲1、提取單條根結(jié)線蟲(成蟲)的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。結(jié)果見圖1。圖1中M 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-5 南方根結(jié)線蟲；6 爪哇根結(jié)線蟲；7 花 生根結(jié)線蟲；8 北方根結(jié)線蟲；9 :CK(不加模板)。條帶大小分析結(jié)果南方根結(jié)線蟲和爪 哇根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1. 7kb(l. 6kb-l. 8kb之間)，花生根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物約為1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之間)，北方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb 之間)。二、用引物對乙輔助鑒別根結(jié)線蟲成蟲1、提取單條根結(jié)線蟲(成蟲)的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。結(jié)果見圖2。圖2中M 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-5:南方根結(jié)線蟲；6:爪哇根結(jié)線蟲；7: 花生根結(jié)線蟲；8 北方根結(jié)線蟲；9 :CK(不加模板)。除了南方根結(jié)線蟲，其它三種根結(jié) 線蟲均沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。條帶大小分析結(jié)果南方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為 500bp (400b-600b 之間)。實(shí)施例3、應(yīng)用引物對輔助鑒別根結(jié)線蟲幼蟲O齡幼蟲)—、用引物對甲輔助鑒別根結(jié)線蟲1、提取單條根結(jié)線蟲O齡幼蟲)的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為
0.5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。條帶大小分析結(jié)果南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為
1.7kb (1. 6kb-l. 8kb之間)，花生根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之間)， 北方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb之間)。二、用引物對乙輔助鑒別根結(jié)線蟲成蟲1、提取單條根結(jié)線蟲O齡幼蟲)的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。除了南方根結(jié)線蟲，其它三種根結(jié)線蟲均沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。條帶大小分析 結(jié)果南方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為500bp (400b-600b之間)。實(shí)施例4、應(yīng)用引物對輔助鑒別根結(jié)線蟲幼蟲(卵囊)—、用引物對甲輔助鑒別根結(jié)線蟲1、提取根結(jié)線蟲卵囊的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。
PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行(含0.5yg/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為
0.5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。條帶大小分析結(jié)果南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為
1.7kb (1. 6kb-l. 8kb之間)，花生根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1. Ikb (1. Okb-1. 2kb之間)， 北方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為0. 5kb (0. 4kb-0. 6kb之間)。二、用引物對乙輔助鑒別根結(jié)線蟲成蟲1、提取根結(jié)線蟲卵囊的基因組DNA。2、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。除了南方根結(jié)線蟲，其它三種根結(jié)線蟲均沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。條帶大小分析 結(jié)果南方根結(jié)線蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為500bp (400b-600b之間)。實(shí)施例5、應(yīng)用引物對檢測染病植物取自海南的染病植物樣本如下香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜、黃瓜。一、用引物對甲檢測染病植物1、取染病植物的根結(jié)(根瘤)，提取總DNA。2、以總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 引物 #C2F3(20yM) ；1 μ 1 引物 #1108 QO μ Μ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 lmin、48°C退火 lmin、72°C延伸 2min， 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。結(jié)果見圖3。圖3中M 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 香蕉；2 番茄；3 辣椒；4 甜瓜；5 序菜； 6 黃瓜。6種染病植物均得到約為1. 7kb (1. 6kb-l. 8kb之間)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。說明6種 植物均為南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲侵染。二、用引物對乙檢測染病植物
1、取染病植物的根結(jié)(根瘤)，提取總DNA。2、以總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) 17. 1 μ 1 ddH20 ； 2. 5μ 1 IOXbuffer ；2 μ 1 dNTP (2. 5mM)； 1 μ 1 弓丨物 MI-F (20 μ Μ) ；1 μ 1 引物 ΜΙ-Ι^20μΜ) ；0. 4μ 1 Taq 酶(5U/μ 1) ；1 μ 1 模板。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 % (含0. 5 μ g/mL EB)瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 0. 5XTBE,電壓為80V，電泳約30min。在凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon 4500，天能科技(上海)有 限公司)上照像和保存，并用系統(tǒng)的自帶軟件(天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)；版本4. 00，軟 件注冊號000395 對條帶大小進(jìn)行分析。結(jié)果見圖4。圖4中M 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 香蕉；2 番茄；3 辣椒；4 甜瓜；5 芹菜； 6:黃瓜。香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均得到約為500bp(400b-600b之間)的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，黃瓜沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)合步驟一的結(jié)果，得出結(jié)論如下香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均為南方根結(jié)線 蟲侵染。黃瓜為爪哇根結(jié)線蟲侵染。
權(quán)利要求
1.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對乙。
2.權(quán)利要求1所述引物對乙在輔助鑒別南方根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。
3.一種輔助鑒別南方根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA；(2)以基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的南方根結(jié)線蟲；如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲 為候選的非南方根結(jié)線蟲。
4.引物對甲和引物對乙組成的專用引物；所述引物對甲由序列表的序列1所示DNA和 序列表的序列2所示DNA組成；所述引物對乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列 4所示DNA組成。
5.權(quán)利要求4所述專用引物在輔助鑒別根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。
6.一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA；(2)以基因組DNA為模板，用權(quán)利要求4所述專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)；如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的南方 根結(jié)線蟲；如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的非南方根結(jié)線蟲；用所述引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)；如果得到1. 6kb-l. 8kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線 蟲為候選的南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲；如果得到1. Okb-1. 2kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根 結(jié)線蟲為候選的花生根結(jié)線蟲；如果得到0. 4kb-0. 6kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候 選的北方根結(jié)線蟲。
7.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對甲。
8.一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法，包括如下步驟(1)提取待測根結(jié)線蟲的基因組DNA；(2)以基因組DNA為模板，用權(quán)利要求7所述引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到 1. 6kb-l. 8kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲；如 果得到1.01Λ-1.21Λ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的花生根結(jié)線蟲；如果得到 0. 4kb-0. 6kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測根結(jié)線蟲為候選的北方根結(jié)線蟲。
9.如權(quán)利要求3、6或8所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6或8的步驟(1)中所述待測根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花 生根結(jié)線蟲或北方根結(jié)線蟲；權(quán)利要求3、6或8中所述基因組DNA取自成蟲、幼蟲或卵囊；當(dāng)基因組DNA取自成蟲或幼蟲、所述PCR所用的引物對為所述引物對甲時(shí)，所述PCR的 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，進(jìn)行40個(gè)循 環(huán)；最后72°C保溫5min ；當(dāng)基因組DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物對為所述引物對甲時(shí)，所述PCR的反應(yīng)程 序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin、48°C退火lmin、72°C延伸2min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最 后72°C保溫5min ；當(dāng)基因組DNA取自成蟲或幼蟲、所述PCR所用的引物對為所述引物對乙時(shí)，所述PCR的 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫5min ；當(dāng)基因組DNA取自卵囊、所述PCR所用的引物對為所述引物對乙時(shí)，所述PCR的反應(yīng)程 序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；94°C變性45S、58°C退火45S、72°C延伸45S，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后 72°C 保溫 5min ；用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為400bp-600bp。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法在輔助鑒定根結(jié)線蟲染病植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒別根結(jié)線蟲的方法及其專用引物對。本發(fā)明提供了引物對甲和引物對乙組成的專用引物；所述引物對甲由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物對乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。所述專用引物可用于輔助鑒別根結(jié)線蟲。本發(fā)明提供的方法，不僅能準(zhǔn)確區(qū)分四種常見的根結(jié)線蟲，而且靈敏度高，可利用單個(gè)卵囊或單條二齡幼蟲鑒定根結(jié)線蟲種類，可以直接從病組織中分離獲得，無需純化培養(yǎng)，可以大大縮短線蟲純化培養(yǎng)時(shí)間，提高檢測效率。
文檔編號C12N15/11GK102102100SQ201010175658
公開日2011年6月22日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者吳倫英, 吳 琳, 景曉輝, 朱利林, 楊臘英, 汪軍, 薛玉瀟, 黃俊生 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所