專利名稱：應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種蛋白濃度的檢測方法。
背景技術：
目前腫瘤標志物分為血清/血漿腫瘤標志和組織細胞腫瘤標志。多為蛋白抗原與 組織細胞因子。蛋白類腫瘤標志物現(xiàn)在多應用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA，簡稱酶免)或放射免 疫分析(RIA，簡稱放免)等方法進行檢測。但現(xiàn)有檢測方法的靈敏度多局限于ng/ml (即 nM-pM)水平。相比較而言放免較之酶免的檢測方法靈敏度稍高，但因其具有放射性等因素 使其應用受到一定的局限。對于組織細胞因子類腫瘤標志物的檢測目前多應用分子生物 學、免疫學以及遺傳學等方法。目前的檢測方法尚都難以進行高通量快速檢測，同時靈敏度 有限，檢測費用也較高，多為進行針對性檢測或篩查，尚難以廣泛普及應用于臨床前預防。生物條碼技術目前多應用于科學研究領域。因其具有高靈敏度而得到廣泛認同與 應用。生物條碼技術的本質是將待測靶目標通過納米技術制備的納米粒子及核苷酸加以擴 增。生物條碼技術也不同于分子生物學中的PCR等方法。與PCR相比，具有更高的靈敏度， 同時費用與時間花費也較之為少?，F(xiàn)圍繞PCR生物技術開展的研究日益廣泛。也有將生物 條碼技術與比色、銀染等方法相互結合進行針對蛋白、核苷酸等微量水平的檢測，其靈敏度 在nM-pM之間，但難以進行高通量的檢測。目前的研究多集中于應用生物條碼技術或結合銀染，或結合比色及應用酶學等方 法，對待測蛋白與核酸的微量水平進行檢測。但迄今尚無文獻或專利應用生物條碼并結合 基因芯片技術對蛋白進行微量測定時其靈敏度可達10_15M，即fM水平的報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種高通量、高靈敏度的應用 生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法本發(fā)明的技術方案概述如下應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是由下述步驟組成(1)分別設計合成基因芯片用探針和掃描用生物條碼A.基因芯片用探針的設計合成根據(jù)引物設計原則，設計由55-65個堿基組成的、5’端修飾有氨基或羧基的基因 芯片用探針，并經(jīng)相關網(wǎng)站檢測所述基因芯片用探針的熱力學指標及其Tm值較低；B.掃描用生物條碼的合成合成可與所述基因芯片用探針序列3’端起始的35-45個堿基完全互補配對、5’端 修飾有熒光基團的、3’端修飾有巰基的序列；(2)用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球；(3)用待測蛋白抗原的多克隆抗體與所述掃描用生物條碼標記納米金；(4)基因芯片制備將所述基因芯片用探針固定在芯片片基上制成；
(5)將所述步驟⑵的產(chǎn)物與待測蛋白抗原混合并結合；(6)將步驟(5)的產(chǎn)物與所述步驟(3)的產(chǎn)物混合并結合；磁性分離，除去未與步 驟(5)的產(chǎn)物結合的步驟(3)的產(chǎn)物部分；(7)將三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的水溶液加入步驟(6)的產(chǎn)物中，磁性分離，分離 出上清液；(8)將所述步驟(7)所獲得的上清液與所述步驟(4)制備的基因芯片進行雜交并 檢測。所述步驟(2)中所述磁性微球為Ci-C,間隔臂胺基修飾、粒徑為2-10 y m的。所述步驟(3)中所述納米金的粒徑為10-20nm。所述步驟(4)中基因芯片用探針的點樣濃度為10-50 u M。所述步驟(7)中所述三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽水溶液的濃度為10-100mM。所述步驟(1)所述基因芯片用探針的堿基數(shù)為60個。所述步驟(1)所述基因芯片用探針為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3 所示的序列。所述步驟(1)所述掃描用生物條碼的堿基數(shù)為40個。所述掃描用生物條碼為SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。本發(fā)明的方法已通過實驗證實其可行性與靈敏度、特異性及其高通量。其靈敏度 可達fM水平。本發(fā)明的方法可對蛋白或核酸類靶向標記物進行高靈敏度的測定，同時也可 以應用于更加廣泛的范圍，包括對食品衛(wèi)生、環(huán)境等所需檢測的物質或指標進行高靈敏度 的檢測。


圖1為用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球(C3_間隔臂胺基磁球)與 c3-間隔臂胺基磁球空白對照的激光共聚焦成像圖。其中1-1為c3-間隔臂胺基磁性微球 與待測蛋白抗原的單克隆抗體復合物；1-2為c3-間隔臂胺基磁性微球作為空白對照。圖2為EDC(1_乙基-3-(3- 二甲氨丙胺)碳化二亞胺鹽酸鹽)做交聯(lián)劑對待測蛋 白抗原的單抗與C3-間隔臂胺基磁性微球偶聯(lián)效果的初步評價。圖3為待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾的磁性微球穩(wěn)定性考察(n = 3)。圖4為納米金顆粒透射電鏡圖像。圖5為用待測蛋白抗原的多克隆抗體與掃描用生物條碼標記納米金的透射電鏡 圖像。圖6為通過將熒光劑異硫氰酸熒光素(FITC)標記于待測蛋白抗原的多克隆抗體， 推算待測蛋白抗原多克隆抗體標記于納米金的平均數(shù)量。圖7為掃描用生物條碼經(jīng)三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)作用從納米金表面解 離率與掃描用生物條碼濃度的關系。圖8為不同濃度掃描用生物條碼與未經(jīng)待測蛋白抗原的多克隆抗體修飾的納米 金的偶聯(lián)率。圖9為不同濃度掃描用生物條碼與經(jīng)待測蛋白抗原的多克隆抗體修飾的納米金 的偶聯(lián)率。
圖10為不同濃度掃描用生物條碼與未經(jīng)待測蛋白抗原的多克隆抗體修飾的納米 金的解離率。圖11為不同濃度掃描用生物條碼與經(jīng)待測蛋白抗原的多克隆抗體修飾的納米金 的解離率。圖12掃描用生物條碼標記于納米金的紫外掃描曲線。圖13為掃描用生物條碼與基因芯片雜交前、后圖像。其中13-1為雜交前制備好 的基因芯片的矩陣；13-2為基因芯片用探針1(IP1)制備的的基因芯片與其相對應的掃描 用生物條碼1(SP1)雜交后的圖像；13-3為基因芯片用探針2(IP2)制備的的基因芯片與其 相對應的掃描用生物條碼2 (SP2)雜交后的圖像；13-4為基因芯片用探針3 (IP3)制備的的 基因芯片與其相對應的掃描用生物條碼3 (SP3)雜交后的圖像。圖14為測定不同濃度待測蛋白抗原與相應芯片雜交后熒光強度值的關系。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1分別設計合成基因芯片用探針和掃描用生物條碼A.基因芯片用探針的設計合成根據(jù)引物設計原則，設計由55-65個堿基組成的、5’端修飾有氨基或羧基的基因 芯片用探針(制備基因芯片的探針5’端標記氨基或羧基，可通過與芯片片基活性酯涂層中 的羧基或氨基有效結合，形成酰胺鍵，可有效并牢固的結合于片基表面，制成基因芯片)，是 要保證其具有良好的特異性，同時減少因自身形成二級結構或局部結構改變而降低雜交反 應的效率。并經(jīng)相關網(wǎng)站http://dinamelt. bioinfo. rpi. edu檢測所述基因芯片用探針的 熱力學指標及其Tm值較低；我們選用了 5’端修飾有氨基的基因芯片用探針的堿基數(shù)是60 個，SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示序列；(還可用5，端修飾有氨基或羧 基的基因芯片用探針的堿基數(shù)是60個，或堿基數(shù)是55-65個中任意數(shù)目的序列。)SEQ ID NO. lgtt gta tga ttg tga tgg ctt Ret act tea ttR acR act RaR tRR aca tRa RaR aRt taaSEQ ID NO. 2act eta cct gat aat eta CRt aca aac tea cca tea a^a aaR crc tea tea eta tct cccSEQ ID NO. 3gtt cgt cag aga ctg ctt Rtt eta tcR eta acc a^a cct cat Rat tRC tac Raa tcR etaSEQ ID NO. 1或SEQ ID N0.2或SEQ ID NO. 3所示的序列為固定探針，分別用IP1、 IP2、IP3表示；探針經(jīng)HPLC純化；熱力學指標及其Tm值IP1 AG = 0.5kcal/mol, AH = -30.Okcal/mol, AS = -98.2e. u.，Tm=32. 2°C
IP2 AG = 0.9kcal/mol, AH = -20.3kcal/mol, AS = -68.3e. u.，Tm=24. 0°C
IP3AG =--0. lkcal/mol, AH =-52. 4kcal/mol, AS =-168,.5e.u. ， Tm =
37. 8°C B.掃描用生物條碼的合成
合成可與所述基因芯片用探針序列3’端起始的35-45個堿基完全互補配對、5’端 修飾有熒光基團Cy3的、3’端修飾有巰基的序列；5’端修飾有熒光基團用于雜交后熒光強 度的測定，3’端標記巰基(-SH)用于與納米金表面的共價結合。掃描用生物條碼的所有堿 基與固定于基因芯片的探針3’端起始的40個堿基完全互補，這是芯片雜交檢測的基礎。我 們選用的堿基數(shù)為40個，SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列；(熒光 基團還可以選Cy5等)，分別用SP1、SP2、SP3表示；掃描用生物條碼經(jīng)HPLC純化；熱力學指標及其Tm值SP1 AG =0. 8kcal/mol, AH =-23.7kcal/'mol, AS =-79.Oe. u.，Tm —26. 8°C
SP2 AG =-0. 8kcal/mol, AH =-34.2kcal/W，AS = ■-107,.8e. u.■，Tm —44. 0°C
SP3 AG =-0. lkcal/mol, AH =-24, 5kcal/mol, AS =-78.8e. u.，Tm —37. 7°CSEQ ID NO. 4tta act ctc tea tgt cca ctc agt cgt caa tga agt age aSEQ ID NO. 5ggg aga tag tga tga gcg ctt tct tga tgg tga gtt tgt aSEQ ID NO. 6tag cga ttc gta gca ate atg agg tct ggt tag cga tag aSEQ ID NO. 4 的 5，端與 SEQ ID NO. 1 的 3，端互補配對；SEQ ID NO. 5 的 5，端與 SEQ IDN0. 2的3，端互補配對；SEQ ID NO. 6的5，端與SEQ ID NO. 3的3，端互補配對見表 1 ；表 1
基因芯片用探針和掃描用生物條碼序列實施例2用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球胺基1-乙基-3-(3-二甲氨丙胺)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)路線較短，操作簡便， 效率穩(wěn)定。故采用EDC做交聯(lián)劑進行抗體定量偶聯(lián)。磁性微球可采用各種材質，本發(fā)明采 用的是天津倍思樂的二氧化硅磁性微球；優(yōu)選q-Q間隔臂胺基修飾、粒徑為2-10 u m的磁 性微球；我們采用的是C3間隔臂胺基磁性微球；取100 ill平均粒徑為2-3 u mC3間隔臂胺基磁性微球加入pH為7. 4，0. 05M的磷 酸緩沖液lOOOiil。磁性分離，去除上清。再加入0.2 yg/iil待測蛋白抗原的單克隆抗體 1000 u 1,0. 2u g/u 1 EDC與0. 1 i! g/ ill氮羥基琥珀酰亞胺100 u 1，混懸3h ；磁性分離，再 應用PH為7. 4，0. 05M的磷酸緩沖液100 yl洗滌；重復3次，得到用待測蛋白抗原的單克隆 抗體修飾磁性微球，置于質量濃度為0. 001%的疊氮鈉水溶液中，pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液 中4°C保存?zhèn)溆?。實施?
納米金的制備、用待測蛋白抗原的多克隆抗體與掃描用生物條碼標記納米金，納 米金的粒徑為10-20nm，我們使用的是12-13nm ；(1)通過檸檬酸鈉還原法制備納米金顆粒取濃度為0. lmg/ml的氯金酸溶液30ml 加熱回流，然后迅速加入質量濃度為的檸檬酸鈉水溶液600 iU，繼續(xù)加熱回流lOmin， 再攪拌30min，靜置15min后停止加熱，室溫下自然冷卻，4°C，15000rpm，離心30分鐘以進一 步純化，即得到納米金膠體溶液，TEM顯示納米金粒徑約為13nm(見圖4)(2)采用物理吸附法應用待測蛋白抗原的多克隆抗體與掃描用生物條碼標記納米 金標記前需對納米金進行過濾處理；在5ml納米金膠體溶液中加入濃度為lmg/ml的待測 蛋白抗原的多克隆抗體250iU，振蕩5分鐘，再加入250 ill聚乙二醇，室溫下放置2小時， 加入1ml濃度為25 ii M的實施例1制備的掃描用生物條碼，加入0. 3M氯化鈉和pH為8. 2， 濃度為10mM Tris-醋酸500iU，室溫下放置12個小時；在4°C，14000rpm，離心30分鐘，兩 次；離心后的紅色沉淀物經(jīng)過清洗、離心并溶解于pH為8. 0的磷酸緩沖液，4°C保存?zhèn)溆?。實施?基因芯片制備(1)、芯片點樣①用TE溶解的基因芯片用探針(實施例1制備)加入96孔板并置于點樣儀中，點 樣濃度為25 u M，設置相應的參數(shù)，啟動點樣程序將基因芯片用探針點樣于芯片片基上(實 驗證明點樣濃度還可以選10-50 u M中的任意濃度)；②靜置12h使其干燥；③置于掃描儀中掃描，檢查點樣質量，見圖13-1。(2)、芯片的點樣后處理(封閉)①用質量濃度為0. 2%的十二烷基磺酸鈉水溶液清洗芯片2min ；②再用雙蒸水清洗芯片2次，每次2min ；③用0. 3M的氫氧化鈉水溶液清洗芯片5min ；④再用雙蒸水清洗芯片2次，每次2min ；⑤將芯片在沸騰雙蒸水中煮沸2min ；⑥在冷乙醇(無水乙醇4°C )中浸泡3分鐘。用離心法(2000rpm，5min)除去芯片 上的乙醇，干燥，即制得基因芯片。實施例5將用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球與待測蛋白抗原混合并結合；單克隆抗體修飾的磁性微球捕獲待測蛋白抗原(1)取濃度為 Opg/ml、lpg/ml、10pg/ml、100pg/ml、lOOOpg/ml 待測蛋白抗原人 IgG 各200 yl分別加入上述修飾的磁性微球(2) 25°C, 600rpm,振蕩 60min(3)磁性分離，棄上清(4)應用pH為7. 4，濃度為0. 05M磷酸緩沖液500 u 1洗脫三次，棄上清，沉淀用pH 為7. 4磷酸鹽緩沖液200 u 1懸浮4°C保存?zhèn)溆?。實施?實施例5的產(chǎn)物與實施例3的掃描用生物條碼和待測蛋白抗原的多克隆抗體雙標記的納米金通過捕獲的待測蛋白抗原結合(1)取200ia掃描用生物條碼和待測蛋白抗原的多克隆抗體雙標記的納米金加 入實施例5獲得的產(chǎn)物；(2) 25°C, 600rpm,振蕩 60min ；(3)磁性分離后棄上清；(4)沉淀用pH為7. 4磷酸鹽緩沖液懸浮4°C保存?zhèn)溆?。實施?應用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽取代置換標記于納米金表面上的掃描用生物條碼 (因三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽本身具有巰基集團，故可通過取代置換作用將3’端標記巰基 的單鏈DNA從納米金表面解離出來)；(1)取濃度為50mM三(乙-羧乙基)膦鹽酸鹽200 ill加入實施例6的產(chǎn)物中(實 驗證明，三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽水溶液的濃度還可以選10-100mM中任一的濃度)；(2)室溫下放置lh ；(3)磁性分離，棄沉淀，取內(nèi)含游離的掃描用生物條碼的上清液，-20°C保存?zhèn)溆?。因?2-羧乙基)膦鹽酸鹽本身具有巰基集團，故可通過取代置換作用將3’端標 記巰基的單鏈DNA(掃描用生物條碼)從納米金表面解離出來。通過待測蛋白抗原將待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾的磁性微球與待測蛋白抗 原的多克隆抗體和掃描用生物條碼共同標記的納米金相連接，形成巨大的復合物。通過置 換作用，掃描用生物條碼可以從納米金表面解離下來，解離下的掃描用生物條碼的數(shù)量在 與標記時所用的掃描用生物條碼的濃度相關的基礎上也與待測蛋白抗原的濃度相關。不同 濃度的掃描用生物條碼標記后，解離率在12. 4% -22. 3%之間。本實驗過程中選擇的25 y M 的掃描用生物條碼的解離率在15. 2% -21. 6%之間。實施例8將實施例7所獲得的上清液與實施例4制備的基因芯片進行雜交并檢測步驟如下1.雜交(1)將雜交器和基因芯片置于42°C預熱；(2)雜交緩沖液預熱65 °C，3min ；(3)按體積比為2 1的比例，將實施例7得到的含游離的掃描用生物條碼的上清 液與雜交緩沖液混合；(4)取步驟(3)的混合液10iU滴加于基因芯片的微陣列區(qū)，加蓋玻片；(5)在雜交器中加入200 yl的2XSSC用于保持濕度；(SSC為檸檬酸鈉緩沖液)(6)蓋緊雜交器，置于42°C溫箱中雜交12_16h ；注實驗中用的雜交緩沖液是Ambion公司的3X雜交緩沖液。2.雜交后洗脫及檢測(1)分別配制三種洗脫液(在50ml離心管中配制)①洗脫液成分為0. 5XSSC，0. 01% SDS。取雙蒸水 40ml 加入 20XSSC lml, 10% SDS40iU，配置兩組②)洗脫液成分為0. 06XSSC，0. 01% SDS。取雙蒸水 40ml 加入 20XSSC 120 yl，10% SDS40iil，配置一組③洗脫液成分為0. 06XSSC。取雙蒸水40ml加入20 XSSC 120 yl，配置兩組(2)打開雜交器，迅速將基因芯片置于0. 5XSSC，0.01% SDS溶液[(1)_1]中，輕 輕直立基因芯片，使蓋玻片滑落下來(3)將基因芯片移入 0. 5XSSC，0. 01% SDS 溶液[(1)_2]中，60rpm 搖動 5min ；(4)將基因芯片移入 0. 06XSSC，0. 01% SDS 溶液[(2)]中，60rpm 搖動 5min ；(5)將基因芯片移入0. 06XSSC溶液[(3)_1]中，60rpm搖動5min ；(6)將基因芯片移入0. 06XSSC溶液[(3)-2]中，60rpm搖動lmin ；(7)將基因芯片置于干燥的離心管中，2000rpm離心5min ；(8)在掃描儀上進行Cy3的熒光掃描。3.基因芯片數(shù)據(jù)處理將掃描結果用ScanArray Express數(shù)據(jù)分析軟件輸出各個點的強度數(shù)值，軟件自 動對數(shù)值進行標準化處理。將標準化后的數(shù)值作為各點的信號強度值，該數(shù)值與和探針雜 交的DNA含量成正比，從而反映出樣品中DNA的含量豐度差異。見圖(13-2、13-3、13-4)為保證探針制備的基因芯片與掃描用生物條碼雜交的特異性，本發(fā)明選用相互之 間有40個堿基互補配對，所以，掃描用生物條碼設計為40個堿基，基因芯片用探針設計為 60個堿基，上述實施例僅用于說明本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明，在基因芯片雜交中，為保 證雜交的特異性，其相互雜交堿基數(shù)至少在30-50個之間，故基因芯片用探針也可以設計 為55-65個堿基，與其雜交的掃描用生物條碼的堿基數(shù)可為35-45個。本發(fā)明對早期腫瘤標志物進行檢測，其靈敏度高，并可逐步發(fā)展成多項指標譜的 檢測和篩查，從而對腫瘤等疾病的早期診斷更加有效、實用。
權利要求
應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是由下述步驟組成(1)分別設計合成基因芯片用探針和掃描用生物條碼A.基因芯片用探針的設計合成根據(jù)引物設計原則，設計由55-65個堿基組成的、5’端修飾有氨基或羧基的基因芯片用探針，并經(jīng)相關網(wǎng)站檢測所述基因芯片用探針的熱力學指標及其Tm值較低；B.掃描用生物條碼的合成合成可與所述基因芯片用探針序列3’端起始的35-45個堿基完全互補配對、5’端修飾有熒光基團的、3’端修飾有巰基的序列；(2)用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球；(3)用待測蛋白抗原的多克隆抗體與所述掃描用生物條碼標記納米金；(4)基因芯片制備將所述基因芯片用探針固定在芯片片基上制成；(5)將所述步驟(2)的產(chǎn)物與待測蛋白抗原混合并結合；(6)將步驟(5)的產(chǎn)物與所述步驟(3)的產(chǎn)物混合并結合；磁性分離，除去未與步驟(5)的產(chǎn)物結合的步驟(3)的產(chǎn)物部分；(7)將三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的水溶液加入步驟(6)的產(chǎn)物中，磁性分離，分離出上清液；(8)將所述步驟(7)所獲得的上清液與所述步驟(4)制備的基因芯片進行雜交并檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(2)中所述磁性微球為q-Q間隔臂胺基修飾、粒徑為2-10 y m的。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(3)中所述納米金的粒徑為10-20nm。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(4)中基因芯片用探針的點樣濃度為10-50 yM。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(7)中所述三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽水溶液的濃度為10-100mM。
6.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(1)所述基因芯片用探針的堿基數(shù)為60個。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(1)所述基因芯片用探針為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序 列。
8.根據(jù)權利要求1所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述步驟(1)所述掃描用生物條碼的堿基數(shù)為40個。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，其特征是所 述掃描用生物條碼為SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了應用生物條碼與基因芯片檢測蛋白濃度的方法，步驟(1)分別設計合成基因芯片用探針和掃描用生物條碼；(2)用待測蛋白抗原的單克隆抗體修飾磁性微球；(3)用待測蛋白抗原的多克隆抗體與掃描用生物條碼標記納米金；(4)基因芯片制備；(5)將步驟(2)的產(chǎn)物與待測蛋白抗原混合并結合；(6)將步驟(5)的產(chǎn)物與步驟(3)的產(chǎn)物混合并結合；磁性分離，除去未與步驟(5)的產(chǎn)物結合的步驟(3)的產(chǎn)物部分；(7)將三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的水溶液加入步驟(6)的產(chǎn)物中，磁性分離，分離出上清液；(8)將上清液與基因芯片進行雜交并檢測。實驗證實其本發(fā)明方法的可行性、特異性及高通量。其靈敏度可達fM水平。
文檔編號C12Q1/68GK101852808SQ201010175088
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2010年5月18日
發(fā)明者冷希崗, 劉蘭霞, 呂豐, 周波, 宋麗萍, 張海玲, 朱敦皖, 董霞 申請人:中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所