專利名稱：用于分析物檢測的比色生物條形碼擴(kuò)增測定的制作方法
用于分析物檢測的比色生物條形碼擴(kuò)增測定
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求2005年9月16日申請的U.S.臨時專利申請 No. 60/717, 851的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，在此以其整體通過引用并入本文，用 于所有的目的。
政府支持聲明
本發(fā)明在依據(jù)合同No. DE-AC02-05CH11231在Lawrence Berkeley 國家實驗室得到U. S.能源部支持的工作進(jìn)行過程中完成。政府在本發(fā) 明中享有一定的權(quán)利。
對序列表的參考 本申請將所附的紙件和電子形式的序列表通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種靈敏的篩選方法，用于檢測樣品中 一種或多種目 標(biāo)分析物的存在或不存在。特別地，本發(fā)明涉及利用報告寡核苷酸作 為生化條形碼用于檢測溶液中的一種或多種分析物的方法。
相關(guān)技術(shù)
已經(jīng)研發(fā)了多種高靈敏度的生物分子檢測方法，但是很少實現(xiàn)了 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的靈敏度。生物條形碼擴(kuò)增測定是對于蛋白質(zhì) 和核酸目標(biāo)物具有PCR-樣靈敏度而不需要酶擴(kuò)增的唯一生物檢測方 法。然而，目前的生物條形碼檢測方案仍然需要玻璃芯片上基于微陣 列的寡核苷酸固定，表面鈍化化學(xué)來最小化非特異性結(jié)合，芯片上固
4定的金納米顆粒的銀加強(qiáng)，光散射測量和定量步驟。發(fā)明人之一和其
他人在US專利申請No. 10/877, 750,公開為US20050037397; U. S.專 利申請No. 10/788, 414 ，公開為US20050009206和U. S.專利申請 No. 10/108211,授權(quán)為U. S,專利No. 6， 974， 666中已經(jīng)描述了這樣的 篩選方法和檢測方案，在此將所有通過引用并入本文，用于所有的目 的。
重要地，復(fù)雜精密的設(shè)備如微陣列和芯片-顯像工具限制了輕便 性，并且測定成本必定是昂貴的。如果可以避免或最小化上述需求而
沒有犧牲生物條形碼測定的';吵(io—18)摩爾靈敏度，將是有利的。 本領(lǐng)域中的其他人已經(jīng)描述了使用加蓋寡核苷酸的金納米顆粒探
針的比色觀'J定，包括Robert Elghanian等，Selective Colorimetric Detection of Polynucleotides Based on the Distance-Dependent Optical Properties of Gold Nanoparticles， Sc/e/zce 1997年8月 22日；277: 1078-1081 (在報告中)；James J. Storhoff等，One-Pot Colorimetric Differentiation of Polynucleotides with Single Base Imperfections Using Gold Nanoparticle Probes ， /. j瓜 C力e邁.&c.;(文章)1998; 120(9); 1959-1964。然而，基于金納米 顆粒的比色檢測方法的典型檢測極限是~ nM 。
生物條形碼擴(kuò)增測定已經(jīng)成為檢測整個樣品中數(shù)十個至數(shù)百個生 物目標(biāo)物如蛋白質(zhì)和核酸的強(qiáng)有力工具。然而，目前的生物條形碼檢 測方案仍然需要許多實驗步驟，包括玻璃芯片上基于微陣列的寡核苷 酸固定，芯片上固定的金納米顆粒的銀加強(qiáng)和光散射測量。因此，需 要研發(fā)一種能夠最小化上述需求而獲得渺摩爾靈敏度的生物條形碼測 定。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了檢測樣品中分析物的方法。在一個實施方案中，該 方法包括提供懷疑含有目標(biāo)分析物的樣品，將多孔顆粒探針和磁性探 針顆粒與樣品接觸，并使多孔顆粒探針和磁性探針顆粒兩者結(jié)合目標(biāo)分析物。多孔微粒探針包括特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的第一配體和生物 條形碼寡核苷酸。磁性納米顆粒探針包括也特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的 第二配體。如果樣品中存在目標(biāo)分析物，在目標(biāo)分析物、多孔微粒探 針和磁性納米顆粒探針之間形成復(fù)合物。從樣品分離出復(fù)合物，從復(fù) 合物釋放并收集條形碼寡核苷酸，并檢測條形碼寡核苷酸。
在一些實施方案中，目標(biāo)分析物是核酸，蛋白質(zhì)，肽，金屬離子， 半抗原，藥物，代謝物，殺蟲劑或污染物。
在一些實施方案中，目標(biāo)分析物是細(xì)胞因子。
在一些實施方案中，目標(biāo)分析物是趨化因子。
在一些實施方案中，多孔微粒探針由包括聚苯乙烯，纖維素，硅 石，氧化鐵，聚丙烯酰胺，或各種多糖，葡聚糖，瓊脂糖，纖維素， 及其衍生物和組合的材料組成。
在一些實施方案中，用胺修飾多孔微粒探針。
在一些實施方案中，微粒具有約0. l微米至約5000微米的大小， 優(yōu)選約0. 5微米至約IO微米的大小，和更優(yōu)選約3微米至約5微米的 大小。
在一些實施方案中，多孔微粒探針具有約50埃至約150埃的孔徑 大小，更優(yōu)選約90埃至約IIO埃。
在一些實施方案中，多孔微粒探針具有約300mVg至約500m7g 的表面積，更優(yōu)選約400m7g至約450m7g。
在一些實施方案中，條形碼寡核苷酸是基因、病毒RNA或DM、 細(xì)菌DM、真菌DM、哺乳動物DNA、 cDNA、 mRNA、 RNA或DNA片段、 天然或合成核酸或適體。
在一些實施方案中，用可檢測標(biāo)記修飾條形碼寡核苷酸。可檢測 標(biāo)記可以是生物素，放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，發(fā)色團(tuán)，氧化還原活性 基團(tuán)，具有電特征(signature)的基團(tuán)，催化基團(tuán)或拉曼標(biāo)記。
在一些實施方案中，條形碼寡核苷酸和微粒是通用探針的成員。
在一些實施方案中，配體是單克隆或多克隆抗體。
在一些實施方案中，通過比色測定進(jìn)行條形碼寡核苷酸的檢測。在一些實施方案中，比色測定包括檢測條形碼寡核苷酸，通過提供包 括第一和第二顆粒探針的溶液，其中第一顆粒探針包括與條形碼寡核 苷酸的一個末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸，并且其中第二顆粒探針包括與
條形碼寡核苷酸的另一相對末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸；將條形碼寡核 苷酸接觸溶液并使條形碼寡核苷酸與第一和第二顆粒探針雜交，由此 第一和第二顆粒探針聚集成聚集物，其中溶液中的顏色改變表示所述
聚集物的形成；并且檢測所述溶液中的顏色改變。
附圖簡述


圖1.比色生物條形碼測定。A.胺修飾的多孔硅石珠子的探針制 備和電子顯微鏡照片(插圖)。B.白細(xì)胞介素-2檢測方案。
圖2.點樣在TLC平板上的金納米顆粒聚集物的定量方法。點強(qiáng) 度值與條形碼DNA的數(shù)量成比例(聚集的金納米顆粒越多，顯現(xiàn)的顏 色越淺)，并且條形碼DNA的數(shù)量與存在的目標(biāo)蛋白質(zhì)的量成比例。
圖3.基于金納米顆粒的比色條形碼DNA"-2檢測(上定量數(shù)據(jù)； 下TLC平板上金納米顆粒點)。A,在緩沖液中。B.在人血清樣品 中。
圖4.多路比色生物條形碼測定。A.顯示了測定步驟的方案。B. 測定中可以使用的多種類型的納米顆粒。
發(fā)明詳述
I.介紹
本發(fā)明提供了簡單的，超靈敏的生物條形碼方法，用于檢測目標(biāo) 分析物。出于以下原因，該生物條形碼分析物檢測方法是重要的。首 先，該新方法已經(jīng)顯示出通過調(diào)節(jié)條形碼探針的表面和大小可以顯著 提高每個探針的條形碼DNA數(shù)量。這使得產(chǎn)生了多個實施方案來檢測 條形碼DNA。在一個實施方案中，如實施例中所示的，使用了比色測 定。其次，對于該測定的檢測極限的數(shù)量級優(yōu)于其他常規(guī)免疫測定。 第三，該生物-條形碼方法不需要復(fù)雜的儀器裝置或試驗步驟。探針溶液的簡單混合和分離將獲得彬、摩爾靈敏度而不需要使用微陣列、復(fù)雜 的信號擴(kuò)增步驟如酶擴(kuò)增和銀加強(qiáng)或精密復(fù)雜的信號測量工具。因為 讀出是基于顏色改變，只需要最小的專門技術(shù)來進(jìn)行測定。第四，研
發(fā)了使用圖形軟件的定量方法用于定量比色條形碼DNA檢測測定，這 對于使用之前的基于金納米顆粒的比色DNA檢測方案是不可能的。最 后，該測定應(yīng)當(dāng)適于護(hù)理點(point-of-care)應(yīng)用，只需要探針溶液 和TLC平板。
II.定義
如整個說明書中所用的"條形碼"，"生化條形碼"，"生物條 形碼，，，"條形碼寡核苷酸"，"條形碼DNA"， "DM條形碼，，，"報 告條形碼"，"報告條形碼DNA，，等全部可以相互交替使用并具有相 同的含義。條形碼DNA可以是核酸，如脫氧核糖核酸或核糖核酸。優(yōu) 選，DNA條形碼是預(yù)定序列的寡核苷酸。如果需要，可以將DNA條形 碼標(biāo)記，例如，j吏用生物素，放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
術(shù)語"顆粒"指的是可以優(yōu)選由金屬，硅石，氧化硅或聚苯乙烯 組成的小塊物質(zhì)。"顆粒"可以是任何形狀的，如球形或桿狀。如在 此所用的術(shù)語"顆粒"特意包括納米顆粒和微粒。
術(shù)語"復(fù)合物"或"探針復(fù)合物"或"顆粒復(fù)合物探針"指的是 由包括報告寡核苷酸和目標(biāo)分析物特異性配體的多孔微粒綴合包括對 相同目標(biāo)分析物特異性的配體的磁性探針顆粒構(gòu)成的綴合物，使目標(biāo) 分析物結(jié)合于其上的兩個配體。
術(shù)語"分析物"，"目標(biāo)分析物"或"目的分析物"指的是待檢 測的化合物或組合物，包括藥物，代謝物，殺蟲劑，污染物等。分析 物可以由特異性結(jié)合對(sbp)的成員組成，并可以是配體，其是單價 的(單表位(monoepitopic ))或多價的(多表位(polyepitopic ))， 優(yōu)選抗原或半抗原性的，且是單個化合物或多個化合物，其共享至少
一個共同的表位或決定簇位點。分析物可以是細(xì)胞或微生物的一部分， 細(xì)胞如細(xì)菌或帶有血型抗原如A, B， D等或HLA抗原的細(xì)胞，微生物如細(xì)菌，真菌，原生動物或病毒。如果分析物是單表位的，可以將分 析物進(jìn)一步修飾，例如，在化學(xué)上修飾，以提供一個或多個另外的結(jié) 合位點。在本發(fā)明的實踐中，分析物具有至少兩個結(jié)合位點。
術(shù)語"配體"指的是其受體天然存在或可以制備的任何有機(jī)化合 物。術(shù)語配體還包括配體類似物，這是修飾的配體，通常是有機(jī)基團(tuán)
或分析物類似物，通常分子量高于ioo,其可以與類似配體竟?fàn)幨荏w，
修飾提供了一種將配體類似物連接另一個分子的方式。配體類似物通 常不同于配體，差異不僅僅是用鍵替代了氫，鍵將配體類似物連接中
樞或標(biāo)記；但是不需要。配體類似物可以以與配體相似的方式結(jié)合受 體。類似物可以是，例如，針對配體抗體的獨特型的抗體。
術(shù)語"受體"或"反配體"指的是能夠識別分子的特定空間和極 性組構(gòu)的任何化合物或組合物，例如，表位或決定簇位點。說明性的 受體包括天然存在的受體，例如，甲狀腺素結(jié)合球蛋白，抗體，酶， Fab片段，凝集素，核酸，核酸適體，抗生物素蛋白，蛋白A， barsar， 補(bǔ)體成分Clq等。抗生物素蛋白旨在包括蛋清抗生物素蛋白和來自其 他來源的生物素結(jié)合蛋白，如鏈霉抗生物素蛋白。
術(shù)語"特異性結(jié)合對(sbp )成員"指的是兩個不同分子中的一個， 其特異性地結(jié)合另 一個分子并可以限定為與另 一個分子的特定空間和 /或極性組構(gòu)互補(bǔ)。特異性結(jié)合對的成員可以稱為配體和受體(反配 體)。這些通常是免疫對如抗原-抗體的成員，盡管其他特異性結(jié)合對， 如生物素-抗生物素蛋白，酶-底物，酶-拮抗劑，酶-激動劑，藥物-目標(biāo)分子，激素-激素受體，核酸雙鏈體，IgG-蛋白A/蛋白G，多核苷 酸對如DNA-DNA， DM-RNA，蛋白-DNA,脂質(zhì)-DNA,脂質(zhì)-蛋白，多糖-脂質(zhì)，蛋白-多糖，核酸適體和相關(guān)的目標(biāo)配體(例如，小的有機(jī)化合 物，核酸，蛋白質(zhì)，肽，病毒，細(xì)胞等)等不是免疫對，但包括于本 發(fā)明和sbp成員的定義中。特異性結(jié)合對的成員可以是完整的分子， 或只是分子的一部分，只要該成員特異性地結(jié)合目標(biāo)分析物上的結(jié)合 位點以形成特異性結(jié)合對。
術(shù)語"特異性結(jié)合"指的是與其他分子顯著較低的識別相比較，兩個不同分子中的一個對于另一個的特異性識別。通常，分子在其表 面上或腔中具有一些區(qū)域，在兩個分子間產(chǎn)生特異性識別。特異性結(jié) 合的實例是抗體-抗原相互作用，酶-底物相互作用，多核苷酸相互作 用等。
如在此所用的，與另一個多核苷酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對(含 合適的核普酸插入或缺失)時，多核苷酸或其片段與另一個是"實質(zhì)
上同源"("實質(zhì)上相似")，使用BLASTN (Altschul， S. F. Gish， W. ， Miller, W. ， Myers, E. W. &Lipman， D. J. ( 1990 ) "Basic local alignment search tool." /. 215: 403-410 ),在至少
約80%,優(yōu)選至少約90°/。，更優(yōu)選至少約95-98%核苷酸堿基中存在核 香酸序列同一性。為了確定兩個不同多核苷酸之間的同源性，使用比 對程序如BLASTN程序"BLAST 2 sequences"測定百分比同源性。對 于公眾使用可以通過互聯(lián)網(wǎng)從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲得該 程序(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden ( 1999 ) ， "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"，層S Ze". 174: 247-250 )?？梢允褂玫?br> 參數(shù)是產(chǎn)生最高計算的百分比同源性(如以下所計算的)的以下的任 意組合，括號中顯示了缺省參數(shù)
程序-blastn
配對獎賞-O或1 (1)
錯配懲罰-0， -1， -2或-3 (-2)
開放缺口懲罰-0， 1， 2, 3， 4或5 (5)
延伸缺口懲罰-0或1 (1)
缺口 x—dropoff (減少)-0或50 ( 50 )
預(yù)期—10
字長- 11
濾器-低復(fù)雜性
術(shù)語"抗體"指的是特異性結(jié)合另一個分子并因此限定為與另一 個分子的特定空間和極性組構(gòu)互補(bǔ)的免疫球蛋白?？贵w可以是單克隆
10或多克隆的，并可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)來制備，如對宿主的免疫 和血清的收集(多克隆的)或通過制備連續(xù)雜交細(xì)胞系并收集分泌的 蛋白質(zhì)(單克隆的)，或通過克隆和表達(dá)編碼至少天然抗體特異性結(jié) 合需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其誘變形式。抗體可以包括完整 的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各種類別和同種型，如
IgA， IgD， IgE， IgGl， IgG2a， IgG2b和IgG3， IgM等。其片段可以 包括Fab， Fv和F(ab， )2， Fab，等。此外，在合適的情況中，可以 使用免疫球蛋白或其片段的聚集物，聚合物和綴合物，只要保持對特 定分子的結(jié)合親和性。
III.檢測樣品中分析物的方法
現(xiàn)在參照圖1B，本發(fā)明的一個實施方案提供了檢測來自樣品的目 標(biāo)分析物的方法。該方法包括提供懷疑含有目標(biāo)分析物的樣品，將多 孔顆粒探針和磁性探針顆粒接觸樣品，并使多孔顆粒探針和磁性探針 顆粒兩者結(jié)合目標(biāo)分析物。多孔顆粒(即，微?；蚣{米顆粒)探針包 括特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的第一配體和條形碼寡核苷酸。磁性探針顆 粒(即，納米顆粒)包括也特異性結(jié)合目標(biāo)分析物的第二配體。如果 樣品中存在目標(biāo)分析物，在目標(biāo)分析物、多孔顆粒探針和磁性探針顆 粒之間形成復(fù)合物。從樣品中分離出復(fù)合物，從復(fù)合物釋放并收集條 形碼寡核苷酸，并檢測條形碼寡核苷酸。
如圖1B所示，將用配體官能化以捕獲目標(biāo)分析物的多孔微粒探針 和磁性探針顆粒兩者與懷疑含有目標(biāo)分析物的樣品混合。經(jīng)混合，如 果存在，目標(biāo)分析物結(jié)合磁性探針顆粒和多孔微粒探針兩者上的配體， 以形成探針復(fù)合物，該探針復(fù)合物包括通過結(jié)合目標(biāo)分析物的配體連 接在一起的磁性探針顆粒和多孔微粒探針。
在一個實施方案中，該方法利用了目標(biāo)分析物與用寡核苷酸標(biāo)記 的顆粒的結(jié)合事件和對那些結(jié)合事件的后續(xù)檢測。在此所述方法的最 后一步依賴于普通DNA的表面化學(xué)。因此，可以引入現(xiàn)有技術(shù)中顆粒 DNA檢測方法的許多高靈敏度方面，但允許檢測多種生物分子如蛋白質(zhì)，而非DM-在檢測事件過程中不存在蛋白質(zhì)。對于表面測定，蛋白 質(zhì)通常比短的寡核苷酸更難以操作，因為它們易于呈現(xiàn)出對固體支持 物更高的非特異性結(jié)合，這通常導(dǎo)致更高的背景信號。最后，對于同 質(zhì)測定，與這些納米顆粒結(jié)構(gòu)相關(guān)的異乎尋常敏銳的熔解曲線將使得 與使用呈現(xiàn)出正常和寬DNA熔解行為的探針可能的情況相比較，設(shè)計 更多的生物條形碼。
本發(fā)明考慮了使用任何合適的顆粒，其上附有適用于檢測測定的 寡核苷酸。如在此所述的，每個微粒，磁性探針顆粒和納米顆粒將具 有多個與其連接的寡核苷酸。因此，每個顆粒-寡核苷酸綴合物可以結(jié)
合多個具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸或核酸。
將寡核苷酸接觸水溶液中的顆粒，持續(xù)足以使至少一些寡核苷酸 通過官能團(tuán)結(jié)合納米顆粒的時間。可以根據(jù)經(jīng)驗來確定這樣的時間。 例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約12至24小時的時間獲得良好的結(jié)果。在一些臨床 檢測的實施方案中，用于雜交的優(yōu)選時間可為IO分鐘至12小時。也 可以根據(jù)經(jīng)驗來確定用于寡核苷酸結(jié)合的其他合適條件。例如，約 10-20nM的納米顆粒濃度和室溫溫育獲得了良好的結(jié)果。
探針復(fù)合物形成后，從樣品中分離出探針復(fù)合物。在優(yōu)選的實施 方案中，這通過磁性分離來進(jìn)行，通過將樣品暴露于磁場(例如，通 過磁性分離裝置)來促進(jìn)磁性分離，磁場吸引探針復(fù)合物中的磁性顆 粒并允許將其從樣品中分離出來。因此，在本發(fā)明的一個方面中，顆 粒探針復(fù)合物包括具有條形碼寡核苷酸和配體的微粒，其中配體結(jié)合 特定的目標(biāo)分析物，并且目標(biāo)分析物還結(jié)合磁性探針顆粒上的另一個 配體。
從樣品中分離出來后，釋放并捕獲探針復(fù)合物中多孔微粒上連接 的條形碼寡核苷酸，用于進(jìn)一步的檢測或分析。對于其所連接的顆粒， 通過破壞條形碼與顆粒表面結(jié)合的化學(xué)釋放劑來釋放條形碼。這樣的 試劑包括，但不限于，通過硫醇連接優(yōu)先結(jié)合顆粒的任何分子，如其 他含硫醇或二硫化物的分子，二硫蘇糖醇(DTT )， 二疏赤蘚糖醇(DTE )， 巰基乙醇等，和裂解二硫鍵并因此將條形碼從其所連接的顆粒中釋放
12出來的還原劑，如硼氫化鈉。還可以通過將條形碼暴露于使條形碼與
條形碼通過其來連接顆粒的寡核苷酸去雜交(dehybridize)的條件， 將條形碼從顆粒中釋放出來。
然后可通過任何合適的方式來檢測條形碼或報告寡核苷酸。通常， 在檢測之前，條形碼通過去雜交從復(fù)合物中釋放出來?？梢允褂萌魏?合適的將條形碼從復(fù)合物中去雜交并釋放出來的溶液或介質(zhì)。代表性 的介質(zhì)是水。
a.目標(biāo)分一斤物
目標(biāo)分析物可以是核酸分子，蛋白質(zhì)，肽，半抗原，金屬離子， 藥物，代謝物，殺蟲劑或污染物。該方法可以用于檢測諸如以下的分 析物的存在毒素，激素，酶，凝集素，蛋白質(zhì)，信號分子，無機(jī)或 有機(jī)分子，抗體，污染物，病毒，細(xì)菌，其他病原生物體，獨特型或 其他細(xì)胞表面標(biāo)記。意圖本發(fā)明可以用于檢測懷疑含有目標(biāo)分析物的 樣品中的目標(biāo)分析物的存在或不存在。
在一些實施方案中，目標(biāo)分析物由核酸組成，并且特異性結(jié)合互 補(bǔ)物是寡核苷酸?；蛘?，目標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)或半抗原，并且特異性 結(jié)合互補(bǔ)物是包括單克隆或多克隆抗體的抗體。或者，目標(biāo)分析物是 來自基因組DNA樣品的序列，并且特異性結(jié)合互補(bǔ)物是寡核苷酸，該 寡核苷酸具有與基因組序列的至少一部分互補(bǔ)的序列。基因組DNA可 以是真核生物，細(xì)菌，真菌或病毒DNA。
在一個實施方案中，特定細(xì)胞因子的檢測可以用于癌癥的診斷。 特定的目標(biāo)分析物包括細(xì)胞因子，如IL-2，如實施例中所示的。細(xì)胞 因子是重要的目標(biāo)分析物，因為細(xì)胞因子在造血作用的調(diào)節(jié)中起著關(guān) 鍵作用；介導(dǎo)表型上不同的細(xì)胞的分化，遷移，活化和增殖。提高的 細(xì)胞因子檢測極限將使得可以更早和更準(zhǔn)確地診斷和治療癌癥和免疫 缺陷相關(guān)的疾病，并導(dǎo)致對細(xì)胞因子相關(guān)疾病和生物學(xué)的增加理解， 因為當(dāng)人受到外來抗原感染時，細(xì)胞因子是特征生物標(biāo)記。
趨化因子是另一類重要的目標(biāo)分析物。應(yīng)答細(xì)菌感染，病毒和引
13起身體損傷的試劑如硅石或尿酸鹽晶體而從多種細(xì)胞中釋放出趨化因 子。它們主要作為白細(xì)胞的化學(xué)引誘物，募集單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì) 胞和其他效應(yīng)細(xì)胞從血液至感染或損傷部位。它們由許多不同細(xì)胞類 型來釋放并用來指引先天性免疫中涉及的細(xì)胞以及獲得性免疫系統(tǒng)的 淋巴細(xì)胞。因此，提高的趨化因子檢測極限將允許更早和更準(zhǔn)確的診 斷和治療，即，對于細(xì)菌感染和病毒感染。
在一些實施方案中，目標(biāo)分析物可以是各種致病生物體，包括但
不限于，唾液酸用來檢測HIV，衣原體屬(C力/fl/z/j^/a)，腦膜炎奈瑟 菌(^iey^er/a/z e/7//7^7" /'s)， 豬鏈球菌(《^re/^ococcw"w/s)， 沙門氏菌屬(Salmonella)，腮腺炎、新城和各種病毒，包括呼腸孤 病毒、仙臺病毒和粘病毒；和9-0AC唾液酸用來檢測冠狀病毒，腦脊 髓炎病毒和輪狀病毒；非-唾液酸糖蛋白用來檢測巨細(xì)胞病毒和麻滲病 毒；CD4,血管活性腸肽和肽T用來檢測HIV;表皮生長因子用來檢測 痘苗病毒；乙酰膽堿受體用來檢測狂犬??；Cd3補(bǔ)體受體用來檢測EB 病毒；p-腎上腺素能受體用來檢測呼腸弧病毒；ICAM-1， N-CAM和髓 磷脂-相關(guān)糖蛋白MAb用來檢測鼻病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒受體用來檢測 脊髓灰質(zhì)炎病毒；成纖維細(xì)胞生長因子受體用來檢測皰滲病毒；寡聚 甘露糖用來檢測大腸桿菌；神經(jīng)節(jié)苷脂G^用來檢測腦膜炎奈瑟菌；和 抗體用來檢測多種病原體(例如，淋病奈瑟菌(#e/"erya ^ /3orr力oeae)， 創(chuàng)傷弧菌(K ^/7"http://7cus)， 副溶血弧菌(^ para力fle銜/7〃c^)， 霍亂弧菌(K c力o/erae)和溶藻弧菌(K a/g/no/y〃CM))。
在一些實施方案中，通過利用對不同目標(biāo)分析物特異性的多個配 體和利用對應(yīng)于每個目標(biāo)分析物的不同條形碼寡核苷酸可檢測多個目 標(biāo)分析物。
b.樣品
可以在樣品中直接找到目標(biāo)分析物，樣品如來自宿主的體液。宿 主可以是哺乳動物，爬行動物，烏，兩棲動物，魚或昆蟲。在優(yōu)選的實施方案中，宿主是人。體液可以是，例如，尿液，血液，血漿，血 清，唾液，精液，糞便，痰，腦脊液，淚液，粘液，膿，粘痰等?？?以將顆粒與活細(xì)胞或含有活細(xì)胞的樣品混合。
在樣品是活細(xì)胞或含有活細(xì)胞的樣品的情況中，細(xì)胞表面蛋白或 其他分子可以作為目標(biāo)分析物。這使得可以檢測細(xì)胞活化和增殖事件，
細(xì)胞相互作用，倍增(multiplexing)和其他生理相關(guān)事件。 c.多孔微粒探針
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用多孔微粒和基于金屬納米顆粒 的比色DM檢測方案，用于直截了當(dāng)?shù)淖x出(圖1)。在優(yōu)選的實施 方案中，多孔微粒探針應(yīng)具有以下特征捕獲目標(biāo)分析物的配體和條 形碼寡核苷酸，其是特異性條形碼DNA序列。
在一個實施方案中，微粒是具有限定孔隙度并由具有限定大小范 圍的小孔構(gòu)成的多孔顆粒，其中將條形碼寡核普酸加于微粒的小孔內(nèi)。 使用多孔微?？梢允姑總€顆粒容納數(shù)百萬條形碼DNA，因此使得可以 使用具有渺摩爾靈敏度的比色條形碼DNA檢測方案。這是一個重要的 進(jìn)展，因為該方案具有生物條形碼擴(kuò)增方法的渺摩爾(10—"M)靈敏度 以及基于金納米顆粒的比色檢測方法的簡單，輕便和低成本。
在一些實施方案中，多孔微粒探針可以由包括硅石和氧化硅的材 料構(gòu)成。如在此所用的術(shù)語"微粒"包括任何顆粒狀珠子，球體，顆 ?；蜉d體，不管是生物可降解的或非生物可降解的，由天然存在的或 合成的有機(jī)或無機(jī)多孔材料構(gòu)成。特別地，微粒包括具有約0. 1至約 5000微米直徑的任何顆粒狀珠子，球體，顆?；蛟泽w，更優(yōu)選約1-5 Him直徑，更優(yōu)選約3-4 jiffl直徑。如在此所用的術(shù)語"約"意思是包 括多至所給范圍土l單位。在另一個實施方案中，使用多孔硅石微粒 (1. 57 x 109ml_1直徑3. 53 ± 0. 49 p m)
本發(fā)明的微粒由聚苯乙烯，硅石，氧化鐵，聚丙烯酰胺和各種多 糖包括葡聚糖，瓊脂糖，纖維素，及其修飾的，交聯(lián)的和衍生的實施 方案構(gòu)成。本發(fā)明微粒的特定實例包括聚苯乙烯，纖維素，與雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖(Biogel. TM. ， Bio-Rad， U.S.A.)，瓊脂，玻璃 珠子和乳膠珠子。衍生的微粒包括用羧基烷基如羧甲基，磷?；腿?代的磷酰基，硫酸鹽，巰基和磺酰基，以及氨基和取代的氨基衍生的 微粒。
顆粒的大小，形狀和化學(xué)組成將影響所得到的包括條形碼DNA的 探針的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括光學(xué)性質(zhì)，光電性質(zhì)，電化學(xué)性質(zhì)，電性 質(zhì)，在各種溶液中的穩(wěn)定性，作為濾器時分離生物活性分子的能力等。 考慮了使用具有不同大小，形狀和/或化學(xué)組成的顆粒的混合物和使用 具有均一大小，形狀和化學(xué)組成的顆粒。
在一些實施方案中，微粒是氨基-官能化的，然后與配體和條形碼 寡核苷酸反應(yīng)。在優(yōu)選的實施方案中，多孔微粒探針由硅石和氧化鐵 構(gòu)成并用胺基團(tuán)官能化，用于用其他生物分子的進(jìn)一步修飾。例如， 可以從PHENOMENEX (Torrance， CA)獲得這樣的顆粒。其他人已經(jīng)廣 泛使用了類似的戊二醛連接物化學(xué)來影響蛋白質(zhì)與氨基官能化顆粒的 連接。
在另一個實施方案中，下文中所述的官能化納米顆粒的方法可以 用來官能化多孔微粒探針。在一些實施方案中，硅石覆蓋的磁性顆粒 是官能化的氨基-珪烷分子，以用胺來官能化硅石表面。
多孔微粒影響可引入探針上的條形碼寡核苷酸數(shù)量并因此影響靈 敏度的其他性質(zhì)包括表面積，孔徑大小，孔的互連性，親水性和孔 分布。
i.表面積
通過調(diào)節(jié)條形碼探針的表面和大小顯著增加了每個探針的條形碼 寡核苷酸數(shù)量，這還形成了各種實施方案來檢測多于 一個條形碼寡核 苷酸。在生物條形碼方法中，每個探針的條形碼寡核苷酸數(shù)量是重要 的，因為最終的檢測信號與捕獲的條形碼DNA量成比例。
在一些實施方案中，多孔顆粒的表面積是約300m7g至約500m7g， 更優(yōu)選約400m7g至約450m2/g。在優(yōu)選的實施方案中，大的探針大小(幾微米)和孔隙率導(dǎo)致相 對于過去的方法(沒有孔的數(shù)十納米的顆粒)顯著提高的條形碼寡核
苷酸裝栽。使用UV-可見光鐠學(xué)(對于單鏈DNA的UV吸收峰是在 260nm )，測定出每~ 3. 5微米珠子的平均條形碼寡核苷酸總數(shù)為~ 3. 6 x 106。與其他每個納米顆粒探針只能載有數(shù)百個條形碼DNA的基于納 米顆粒的條形碼探針相比較，就每個條形碼探針的條形碼寡核苷酸數(shù) 量而言，本發(fā)明的微粒導(dǎo)致擴(kuò)增高出幾個數(shù)量級。
ii. 孔徑大小
孔徑大小也是多孔顆粒的一個重要方面?？讖酱笮”仨氉銐虼?， 使得條形碼寡核苷酸在條形碼與顆粒結(jié)合的過程中可以進(jìn)入孔中，并 在釋放條形碼寡核苷酸用于檢測時離開孔。
因此，在一些實施方案中，孔徑大小是約50埃至約150埃，更優(yōu) 選約90埃至約110埃。
iii. 互連性
多孔顆粒內(nèi)的孔的互連性使得樣品或流出物貫穿多孔顆粒流動。 這些"通道，，提供了制備并從孔內(nèi)釋放條形碼DNA的方式。此外，通 過具有通道，其防止了孔內(nèi)的氣穴形成，氣穴可干擾條形碼DNA進(jìn)入 和釋放。
因此，在優(yōu)選的實施方案中，多孔顆粒具有通道來提供更大的條 形碼DNA容納以及條形碼DNA更好的結(jié)合和從顆粒釋放。
iv. 親水性
在優(yōu)選的實施方案中，多孔顆粒是親水性的并極少至沒有疏水性。 親水性多孔顆粒使得可以有效制備探針和有效釋放條形碼DNA用于檢測。
v. 孔分布在優(yōu)選的實施方案中，多孔顆粒將具有可以引至顆粒上但不負(fù)面 影響每個顆粒結(jié)構(gòu)完整性的最大數(shù)量的孔。
每個顆粒的孔分布或孔數(shù)量還可以影響可容納于顆粒上的條形碼
DNA數(shù)量?？椎臄?shù)量對每個顆粒的表面積具有直接的影響。然而，顆 ?？梢跃哂械目椎臄?shù)量存在限制。如果將太多的孔引至每個顆粒，可 能損害顆粒的結(jié)構(gòu)完整性。
d.配體
可以將連接用來捕獲目標(biāo)分析物的配體連接，可除去地連接，共 價或非共價連接到多孔顆粒探針和磁性顆粒探針。
連接多孔顆粒探針的配體和連接磁性顆粒探針的配體都特異性地 結(jié)合目標(biāo)分析物。因此，在優(yōu)選的實施方案中，目標(biāo)分析物具有至少 兩個結(jié)合位點，使每個配體特異性地結(jié)合。
配體可以是將已知分析物作為特異性結(jié)合對成員的任何分子或物 質(zhì)。因此。特異性結(jié)合對的每個成員可以是核酸，寡核苷酸，肽核酸， 多肽，抗原，碳水化合物，氨基酸，激素，類固醇，維生素，病毒， 多糖，脂質(zhì)，脂多糖，糖蛋白，脂蛋白，核蛋白，白蛋白，血紅蛋白， 凝血因子，肽激素，非肽激素，生物素，鏈霉抗生物素蛋白，細(xì)胞因 子，趨化因子，包括腫瘤特異性表位的肽，細(xì)胞，細(xì)胞表面分子，微 生物，小分子，酶，受體，通道，發(fā)色團(tuán)，螯合化合物，磷酸反應(yīng)基 團(tuán)，分子識別復(fù)合物，二硝基苯酚，電子供體或受體基團(tuán)，疏水性化 合物，親水性化合物，有機(jī)分子和無機(jī)分子。
在一些實施方案中，配體是單克隆抗體或多克隆抗體，其中目標(biāo) 分析物是蛋白質(zhì)，半抗原或肽。在抗體用作配體的情況中，通過使用 不同的偶聯(lián)化學(xué)，用來官能化磁性探針顆粒的抗體的表位不同于用來 制備微粒探針的抗體的那些表位。因此，在優(yōu)選的實施方案中，選擇 作為配體的抗體是具有兩個不同表位的已經(jīng)產(chǎn)生的抗體。對于重要的 疾病標(biāo)記，通過學(xué)術(shù)和商業(yè)方式可容易地獲得許多具有不同表位的高 質(zhì)量抗體。而且，本領(lǐng)域公知可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生針對配體的
18抗體。
在一些實施方案中，在目標(biāo)分析物是核酸的情況中，配體是具有 與該核酸的至少一部分序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。
在一些實施方案中，在目標(biāo)分析物來自基因組DNA樣品的情況中， 配體是具有與基因組序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。
將氨基-官能化的磁性顆粒連接用于目標(biāo)分析物的配體。在優(yōu)選的 實施方案中，在抗體用作配體的情況中，使用戊二醛-胺偶聯(lián)化學(xué)，抗 體的表位不同于用于制備條形碼DNA的抗體的那些表位。
e.條形碼寡核苷酸
在優(yōu)選的實施方案中，可以連接，可除去地連接，共價或非共價 連接條形碼寡核苷酸，條形碼寡核苷酸連接多孔微粒探針來捕獲目標(biāo) 分析物。
可以使用將寡核苷酸連接至納米球體表面上的任何合適方法。特 別優(yōu)選的將寡核苷酸連接至表面的方法是基于以下申請中所述的老化 法U. S.申請系列No. 09/334, 667， 1999年6月25日申請；系列 No. 09/603, 830， 2000年6月26日申請；系列No. 09/760， 500, 2001 年1月12日申請；系列No. 09/820, 279， 2001年3月28日申請；系 列No. 09/927, 777 ， 2001年8月 10日申請；和國際申請 no. PCT/US97/12783, 1997年7月21日申請；PCT/US00/17507, 2000 年6月26曰申請；PCT/US01/01190， 2001年1月12日申請； PCT/US01/10071， 2001年3月28日申請，在此將這些公開內(nèi)容以其 整體通過引用并入本文。老化法提供了具有出人意料的提高的穩(wěn)定性 和選擇性的納米顆粒-寡核苷酸綴合物。
在一個實施方案中，該方法包括提供條形碼寡核苷酸，該寡核苷 酸優(yōu)選具有與其共價結(jié)合的部分，該部分包括可以結(jié)合納米顆粒的官 能團(tuán)。所述部分和官能團(tuán)是允許寡核苷酸結(jié)合(即，通過化學(xué)吸附或 共價結(jié)合)納米顆粒的那些。例如，具有共價結(jié)合其5'或3'端的鏈 垸硫醇，鏈烷二硫化物或環(huán)狀二硫化物的寡核苷酸可以用來將寡核苷酸結(jié)合至多種納米顆粒，包括金納米顆粒。將寡核苷酸連接納米顆粒
的方法進(jìn)一步描述于U. S.專利申請系列No. 10/877, 750中，以 US20050037397公開，在此通過引用并入本文。
在一些實施方案中，條形碼寡核苷酸通過連接物連接微粒。存在 許多可購得的胺-反應(yīng)性連接物(用于共價連接)。因此，考慮了通常 用胺修飾微粒。優(yōu)選，連接物進(jìn)一步包括連接環(huán)狀二硫化物的碳?xì)浠?合物部分。合適的碳?xì)浠衔锸强少彽玫模⑵溥B接環(huán)狀二硫化物。 優(yōu)選，碳?xì)浠衔锊糠质穷惞檀細(xì)埢?。已?jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)與使用鏈 烷硫醇或無環(huán)二硫化物作為連接物制備的綴合物相比較，使用包括連 接環(huán)狀二硫化物的類固醇?xì)埢倪B接物制備的寡核苷酸顆粒綴合物對
于硫醇(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)溶液中所用的二硫蘇糖醇)非 常穩(wěn)定。實際上，其他人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的寡核苷酸-顆粒綴合物穩(wěn)定 性高出300倍。參見U.S.專利申請系列No. 10/877, 750。該穩(wěn)定性很
可能是由于每個寡核苷酸通過兩個硫原子而不是單個硫原子錨定到微 粒這一事實。特別地，認(rèn)為環(huán)狀二硫化物的兩個相鄰硫原子具有螯合 效應(yīng)，這在穩(wěn)定寡核苷酸-微粒綴合物中是有利的。連接物的大疏水性 類固醇?xì)埢ㄟ^從水溶性分子接近納米顆粒的表面篩選微粒也似乎有 助于綴合物的穩(wěn)定性。
在另一個實施方案中，使用基于硫的官能團(tuán)將條形碼寡核苷酸結(jié) 合到微粒。U. S.專利申請系列No. 09/760, 500和09/820， 279和國際 申請no.PCT/USOl/01190和PCT/US01/10071描述了本發(fā)明實踐中有 用的用環(huán)狀二硫化物官能化的寡核苷酸。環(huán)狀二硫化物優(yōu)選在其環(huán)中 具有5或6個原子，包括兩個硫原子。合適的環(huán)狀二硫化物是可購得 的，或可以通過已知程序合成。還可以使用環(huán)狀二疏化物的還原形式。
在一個實施方案中，使用乙醇胺來鈍化微粒上所有未反應(yīng)的反應(yīng) 位點。還可以另外或替代地使用如牛血清白蛋白的蛋白質(zhì)來進(jìn)一步鈍 化微粒表面上沒有活性的區(qū)域。
如定義中所述的，DNA條形碼可以是核酸，如脫氧核糖核酸或核 糖核酸。優(yōu)選，DNA條形碼是預(yù)定序列的寡核苷酸。DNA條形碼寡核苷酸可以包括基因；病毒RNA和DNA;細(xì)菌DNA;真菌DNA;哺乳動物DNA, cDM， mRNA， RNA和DNA片段；寡核苷酸；合成的寡核苷酸；修飾的 核苷酸；單鏈和雙鏈核酸；天然和合成的核酸；和適體。
制備預(yù)定序列寡核苷酸的方法是公知的。參見，例如，Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實驗室 手冊)(第2版，1989 )和F. Eckstein (編輯)Oligonucleotides and Analogues (寡核苷酸和類似物)，第1版(Oxford University Press, New York, 1991)。固相合成方法對于寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核 苷酸都是優(yōu)選的(合成DNA的公知方法也可用于合成RM)。還可以 通過酶制備寡核普酸。對于具有其所結(jié)合的目標(biāo)分析物的特異性結(jié)合 互補(bǔ)物的寡核苷酸，可以使用將特異性結(jié)合互補(bǔ)物如蛋白質(zhì)與寡核苷 酸連接的任何合適方法。
本發(fā)明考慮了使用通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)設(shè)計的序列， 包括，優(yōu)化退火溫度，序列對模板的特異性和序列的長度?？梢允褂?引物預(yù)須'J軟件如01igo6 (Molecular Biology Insights, Inc.， Cascade, CO)進(jìn)行序列的設(shè)計。還可以使用用于引物設(shè)計的定制腳本 和軟件。
任何獨特的寡核普酸序列及其互補(bǔ)序列可以用于條形碼寡核苷 酸。優(yōu)選用作條形碼寡核苷酸的寡核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與其互補(bǔ) 序列雜交。如在此所用的術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)條件"指的是序列將與其目標(biāo)子 序列或互補(bǔ)物雜交而不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴 性的且在不同情況下將不同。較長的序列在較高的溫度特異性地雜交。 通常，選擇嚴(yán)謹(jǐn)條件為比在限定離子強(qiáng)度和pH下特定序列的熱熔點 (Tm)低約15"C。 Tm是平衡時50°/。與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針與目標(biāo)序列 雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度，pH和核酸濃度下)。(因為目標(biāo)序 列通常過量存在，因此在Tm，平衡時50%探針被占據(jù))。
在一些實施方案中，用可檢測標(biāo)記修飾條形碼寡核苷酸?？蓹z測 標(biāo)記的實例包括生物素，放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，發(fā)色團(tuán)，氧化還原 活性基團(tuán)，具有電特征的基團(tuán)，催化基團(tuán)和拉曼標(biāo)記。
21可以在以下文獻(xiàn)中找到這些特異性條形碼DNA序列的實例，例如， ^u/t/p/e;re^/ / etect/o/of 戶rofe//2 Ca/ cer #arirers fr/f力 》/06flrcodedA"a/2o;7sr〃c/e戶ro6es ， Stoeva等 ， 128 J. Am. Chem. Soc. 8378-8379 ( 2006 ) ; "/'o-Koi/e-^^/細(xì) Z "ec〃0/7 尸CW-7/i"e5^/ W〃f"/ ,Nam等 126
J. Am. Chem. Soc. 5932-5933 ( 2004 );和脂〃; 7eji^f扁Z "ec〃加 『27力^/06arcof/edjV^/70;7arfic/e戶ro6es， Soteva等，45 Angew. Chem. Int.Ed.， 3303-3306 ( 2006 )，在此通過引用并入本文。
在優(yōu)選的實施方案中，條形碼DNA是具有限定序列的3'氨基-官 能化的條形碼DM互補(bǔ)物(例如，作為鑒定標(biāo)簽)，來鑒定微粒，用 于檢測特定目標(biāo)分析物，因此可以檢測樣品中的多個目標(biāo)分析物。
在一個實施方案中，該方法利用作為生化條形碼的寡核苷酸，用 于檢測樣品中的單個或多個分析物。該方法利用用納米顆粒直接或間 接官能化的識別元件(例如，蛋白質(zhì)或核酸)和之前觀察到導(dǎo)致金納 米顆粒聚集的雜交事件可以顯著改變它們的物理特性(例如，光學(xué)， 電學(xué)，機(jī)械)?？偟臉?gòu)思是每個識別元件可以結(jié)合不同的寡核苷酸序 列(即，DNA條形碼)，這些序列具有離散的和可裁制的雜交和熔解 特性以及與納米顆粒相關(guān)的物理信號，所述納米顆粒在熔解時改變以 解碼多分析物測定中的一系列分析物。因此，可以使用DNA相連聚集 物的熔解溫度以及與納米顆粒相關(guān)的物理特性，所述納米顆粒在熔解 時改變以解碼多分析物測定中的一系列分析物。在此的條形碼不同于 基于物理診斷標(biāo)記物的那些，如納米棒，熒光團(tuán)標(biāo)記的珠子和量子點， 因為解碼信息是存儲于預(yù)先設(shè)計的寡核苷酸序列中的化學(xué)信息形式。
f.磁性探針顆粒
磁性探針顆?？梢杂砂ㄑ趸F和其他鐵磁材料的磁性材料構(gòu) 成?？梢杂霉枋蚓酆衔锶缇郾０罚郾揭蚁┑劝淮判蕴结橆w 粒，如對于多孔微粒所述的對其表面官能化。
在優(yōu)選的實施方案中，磁性探針顆?？梢允蔷哂屑s0.1納米至約5000微米直徑的納米顆?；蛭⒘?。合適的磁性顆粒廣泛用于本領(lǐng)域 中，并可以從供應(yīng)商如Dynal Biotech (新近被Invi trogen獲得)獲得。
在一個實施方案中，按照實施例中所述的使用戊二醛-胺偶聯(lián)化學(xué) 來制備磁性顆粒。
本發(fā)明實踐中有用的微粒和納米顆粒包括金屬(例如，金，銀， 銅和柏)，半導(dǎo)體(例如，CdSe， CdS以及用ZnS覆蓋的CdS或CdSe ) 和磁性(例如，鐵磁)膠體物質(zhì)。本發(fā)明實踐中有用的其他納米顆粒 包括ZnS， Zn0， Ti02， Agl, AgBr， Hgl2， PbS， PbSe， ZnTe， CdTe， In2S3， In2Se3， Cd3P2， Cd3As2， InAs和GaAS。納米顆粒的大小優(yōu) 選為約5nm至約150nm (平均直徑)，更優(yōu)選約5至約50nm，最優(yōu)選 約10至約30nm。納米顆粒還可以是棒狀，棱柱或四面體。
制備金屬，半導(dǎo)體和磁性納米顆粒的方法是本領(lǐng)域公知的。參見， 例如，Schmid， G.(編輯)Cluster and Colloids (VCH， Weinheim， 1994 ); Hayat, M. A.(編輯)Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications ( Academic Press, San Diego， 1991) ; Massart， R. ， IEEE Taransactions On Magnetics, 17， 1247 ( 1981 ); Ahmadi， T. S，等，Science, 272， 1924 ( 1996 ) ; Henglein， A,等，J. Phys. Chem. ， 99， 14129 ( 1995 ); Curtis, A. C.等，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ， 27， 1530 ( 1988 )。
制備ZnS， Zn0， Ti02， Agl， AgBr， HgI2， PbS, PbSe， ZnTe， CdTe， In2S3， In2Se3， Cd3P2， Cd3As2， InAs和GaAS納米顆粒的方法也是 本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Weller， Angrew. Chem. Int. Ed. Engl.， 32， 41 ( 1993 ) ; Henglein, Top. Curr. Chem. ， 143， 113 ( 1988 ); Henglein, Chem. Rev. ， 89， 1861 ( 1989 ); Brus， Appl. Phys. A., 53， 465( 1991 ); Bahncmann， Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy ( Pelizetti和Schiavello編輯，1991) ， p251; Wang和Herron, J. Phys. Chem. , 95， 525 ( 1991 ) ; Olshavsky等， J. Am. Chem. Soc. ， 112, 9438 ( 1990 ) ; Ushida等,J. Phys. Chem.，95， 5382 ( 1992 )。
也可以從例如Ted Pella， Inc.(金)，Amersham Corporation
(金)和Nanoprobes， Inc.(金)購得合適的納米顆粒。
目前優(yōu)選用于檢測核酸的是金納米顆粒。金膠體顆粒對于產(chǎn)生其 漂亮顏色的條帶具有高消光系數(shù)。這些強(qiáng)烈的顏色隨著顆粒大小，濃 度，顆粒間的距離以及聚集程度和聚集物形狀(幾何學(xué))而改變，使 這些材料對于比色測定特別有吸引力。例如，連接金納米顆粒的寡核 苷酸與寡核普酸和核酸的雜交形成肉眼可見的立即顏色改變。
將顆?；蚬押塑账峄騼烧吖倌芑员銓⒐押塑账徇B接到顆粒。 這樣的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，用鏈烷硫醇在其3，-端或5'-端官能化的寡核苷酸容易地連接金納米顆粒。參見Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference on Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pl09-121 ( 1995 )。還可以參見，Mucic等，Chem. Commun. 555-557
(1996 )(描述了將3，硫醇DM連接到平的金表面的方法；該方法 可以用于將寡核苷酸連接納米顆粒)。鏈烷硫醇方法也可以用于將寡 核苷酸連接其他金屬，半導(dǎo)體和磁性膠體以及連接上述的其它納米顆 粒。用于將寡核苷酸連接到固體表面的其他官能團(tuán)包括硫代磷酸基團(tuán)
(參見，例如，U. S.專利No. 5, 472, 881，用于寡核苷酸-硫代磷酸酯 與金表面的結(jié)合)，取代的烷基硅氧烷(參見，例如，Burwell， Chemical Technology, 4， 370-377( 1974 )以及Matteucci和Caruthers， J. Am. Chem. Soc. ， 103， 3185-3191 ( 1981 )，關(guān)于寡核苷酸與硅石和玻璃 表面的結(jié)合，和Grabar等，Anal, Chem. ， 67， 735-743,關(guān)于氨基烷 基硅氧烷的結(jié)合和巰基烷基硅氧烷的類似結(jié)合)。末端為5'硫代核 苷或3，硫代核苷的寡核苷酸也可以用于連接寡核苷酸到固體表面。 以下的參考文獻(xiàn)描述了可以用來連接寡核苷酸到納米顆粒的其他方 法Nuzzo等，J. Am. Chem. Soc. ， 109， 2358 ( 1987 )(金上面的 二硫化物)；Allara和Tompkins, Langmuir， 1， 45 (1985)(鋁上面 的羧酸)；Allara和Tompkins, J. Colloid Interface Sci. ， 49，410-421 ( 1974 )(銅上面的羧酸)；Iler， The Chemistry Of Si 1 ica， 第6章，(Wiley 1979 )(硅石上的羧酸);Timmons和Zisman, J. Phys. Chem. , 69, 984-990 ( 1965 )(賴上面的羧酸)；Soriaga和Hubbard, J. Am. Chem. Soc. ， 104， 3937 ( 1982 ) (4白上面的芳香環(huán)化合物)； Hubbard, Acc. Chem. Res. ， 13， 177 ( 1980 )(柏上面的環(huán)丁砜， 亞砜和其他官能化的溶劑)；Hickman等，J. Am. Chem, Soc. ， 111， 7271 (1989)(賴上面的異腈);Maoz和Sagiv， Langmuir, 3， 1045( 1987 ) (珪石上的硅烷)；Maoz和Sagiv， Langmuir, 3， 1034 ( 1987 )(珪 石上的珪烷)；Wasserman等，Langmuir, 5， 1074 ( 1989 )(硅石上 的砝烷)；Eltekova和Eltekov， Ungmuir， 3， 951 ( 1987 ) (二氧 化鈦和硅石上的芳香羧酸，醛，醇和甲氧基)；Lee等，J. Phys. Chem.， 92， 2597 ( 1988 )(金屬上的剛性磷酸鹽/酯)。
g.通用探針
在一些實施方案中，條形碼寡核苷酸和多孔顆粒是通用探針的成 員，其可以用于對包括至少兩個部分的任何目標(biāo)核酸的測定中。該"通 用探針，，包括單個"捕獲"序列的寡核苷酸，該序列與報告寡核苷酸 (例如，條形碼DM)的至少一部分互補(bǔ)，以及與目標(biāo)識別寡核苷酸 的一部分互補(bǔ)。目標(biāo)識別寡核苷酸包括具有至少兩個部分的序列；第 一個部分包括對連接到多孔顆粒的捕獲序列的互補(bǔ)序列，第二個部分 包括對特定目標(biāo)核酸序列的第 一個部分的互補(bǔ)序列。各種類型的目標(biāo) 識別寡核苷酸與通用探針一起使用能獲得很大的優(yōu)勢，使得可以轉(zhuǎn)換 或互換目標(biāo)識別寡核苷酸文庫，以便選擇特定測試溶液中的特定目標(biāo) 核酸序列。將包括與目標(biāo)核酸的第二個部分互補(bǔ)的序列的捕獲寡核苷 酸連接到磁性探針顆粒。
為了提高的優(yōu)勢可以操縱這些通用探針，其取決于待進(jìn)行的特定 測定。通過簡單地取代或互換目標(biāo)識別寡核苷酸，使得通用探針的第 二個部分包括對不同目標(biāo)核酸的互補(bǔ)序列，探針可以"調(diào)向"各種單 個目標(biāo)核酸序列。相似地，如果要在單個測試溶液中測定多個目標(biāo)核
25酸序列，報告寡核苷酸可以包括對每個目標(biāo)核酸特異性的序列，借此， 已知的特定序列的報告寡核苷酸的檢測將表示測試溶液中特定目標(biāo)核 酸的存在。將包括與目標(biāo)核酸的第二個部分互補(bǔ)的序列的捕獲寡核苷 酸連接到納米顆粒。
h.樹狀分子
在本發(fā)明該實施方案的一個方面中，提供了與用至少兩種類型的 寡核苷酸標(biāo)記的樹狀分子綴合的顆粒。樹狀分子是由多個分支單元單
體構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，并用于各種應(yīng)用中。參見，例如，Barth等， "/ocoo力g"e C力e邊/"ry 5: 58-66 ( 1994 ) ; Gitsov & Frechet ， 船cro咖/ecw/es 26: 6536-6546 ( 1993 ); Lochmann等，J. Amer. Chem. Soc. 115: 7043-7044 ( 1993 ) ; Miller等，/. J邊er. C/ e瓜 114:1018-1025 ( 1992 ) ; Mousy等，他cro邊/ec"/es 25:2401-2406 (1992 ) ; Naylor等，/. ^z er. 111: 2339—2341 ( 1989 );
Spindeler & Frechet，腸ro衡/ecw/es 26: 4809-4813( 1993 ); Turner 等，Macromolecules, 26: 4617-4623 ( 1993 ) ; Wiener等，他卵e〃c ^eso/ a/ ce#^f. 31 (1): 1-8 ( 1994 ) ; Service, 267:458-459 ( 1995 ); Tomalia， "A細(xì)r. 62-66 ( 1995 );和Tomalia的U. S.專利 No. 4， 558， 120; 4, 507, 466 ; 4, 568, 737 ; 4, 587, 329 ; 4, 857, 599 ; 5, 527, 524; 5, 338, 532,以及Nilsen的U. S.專利No. 6， 274， 743,全 部以其整體通過引用并入本文，用于所有目的。樹狀分子提供了優(yōu)于 其他類型的超分子結(jié)構(gòu)的重要優(yōu)勢，如接觸最大體積最少結(jié)構(gòu)單元， 更容易控制大小，重量和生長特性的能力，并且可以衍生化多個末端 來產(chǎn)生高度標(biāo)記的分子，其在標(biāo)記之間具有限定的空間，或提供用于 其他分子連接的位點，或其組合。概括地參見U. S.專利No. 6， 274， 723 和上述關(guān)于合成方法的參考文獻(xiàn)。用于本發(fā)明方法中的核酸樹狀分子
中的任何一種?？梢愿鶕?jù)/>開文獻(xiàn)合成這樣的樹狀分子，如Hudson 等， "Nucleic Acid Dendrimers: Novel Biopolymer Structures"j瓜115: 2119-2124 ( 1993 ); U. S.專利No. 6， 274， 723; 和Cantor的U. S.專利No. 5， 561， 043。
IV.比色方法
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了簡單而超靈敏的比色生物條 形碼測定。本發(fā)明的篩選方法和檢測方案基于發(fā)明人之一和其他人在 以下參考文獻(xiàn)中所述的那些US專利申請No. 10/877， 750 ，以 US20050037397公開；U. S.專利申請No. 10/788， 414，以US20050009206 公開；和U. S.專利申請No. 10/108211，以US20020192687公開，在 此再次將全部通過引用并入本文，用于所有目的。在優(yōu)選的實施方案 中，通過提供具有提高的生物條形碼DNA擴(kuò)增以及定量和多路能力的 比色測定，本發(fā)明的生物條形碼測定提供了改進(jìn)的分析物檢測的生物 條形碼方法。
在一個實施方案中，如實施例中所示的，使用比色測定來檢測條 形碼DNA，因為它不需要復(fù)雜的裝置或?qū)嶒灢襟E。探針溶液的簡單混 合和分離將導(dǎo)致渺摩爾靈敏度，而不需要使用微陣列、復(fù)雜的信號擴(kuò) 增步驟如酶擴(kuò)增和銀加強(qiáng)或精密復(fù)雜的信號測量工具。因為讀出是基 于顏色改變，進(jìn)行測定只需要最少的專門技術(shù)。
在一些實施方案中，可使用圖像分析工具檢測和定量顏色改變。 在另一個實施方案中，通過眼睛目測顏色改變。
在一些實施方案中，通過比色測定進(jìn)行條形碼寡核苷酸的檢測。 在一些實施方案中，比色測定包括通過以下方法來檢測條形碼寡核苷 酸提供包括第一和第二顆粒探針的溶液，其中第一顆粒探針包括與 條形碼寡核苷酸的一個末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸，并且其中第二顆粒 探針包括與條形碼寡核苷酸的另一相對末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸；將 條形碼寡核苷酸接觸溶液并使條形碼寡核苷酸與第一和第二顆粒探針 雜交，借此第一和第二顆粒探針聚集成聚集物，其中溶液中的顏色改 變表示所述聚集物的形成；并且檢測所述溶液中的顏色改變。
通過對聚集的納米顆粒的視覺檢測進(jìn)行條形碼DM的比色檢測。每種類型的納米顆粒含有與對特定目標(biāo)分析物的特異性條形碼寡核苷 酸互補(bǔ)的預(yù)定捕獲寡核苷酸。在目標(biāo)分析物的存在下，作為微粒，磁 性顆粒和目標(biāo)分析物之間的結(jié)合相互作用的結(jié)果，產(chǎn)生了探針復(fù)合物。 從復(fù)合物中釋放出條形碼寡核苷酸，并可以通過任何合適的方式例如 熱變性來分離和分析，來檢測一種或多種不同類型的報告寡核苷酸的 存在。然而，考慮到對于比色檢測，進(jìn)一步的擴(kuò)增不是必需的。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括有效使寡核苷酸之間發(fā) 生特異性結(jié)合相互作用以形成聚集復(fù)合物的條件下，將含有顆粒捕獲 探針的溶液接觸條形碼寡核苷酸，以發(fā)出樣品中存在目標(biāo)分析物的信
號；檢測顏色改變的存在或不存在。在一個實施方案中，在步驟中使 用顆粒探針來檢測從探針復(fù)合物中分離出來的條形碼DNA。
本發(fā)明優(yōu)選用于檢測核酸的是金或銀納米顆粒。金和銀膠體顆粒 對于產(chǎn)生其漂亮顏色的條帶具有高消光系數(shù)。這些強(qiáng)烈的顏色隨著顆 粒大小，濃度，顆粒間的距離以及聚集程度和聚集物形狀(幾何學(xué)) 而改變，使這些材料對于比色測定特別有吸引力。例如，連接金納米 顆粒的寡核苷酸與寡核苷酸和核酸的雜交形成肉眼可見的立即顏色改 變(參見，例如，實施例和圖4B)。合適的納米顆粒也可以從例如Ted Pella， Inc.(金)，Amersham Corporation (金)和Nanoprobes， Inc.(金)購得。
Chad A. Mirkin， Robert L. Letsinger， Robert C. Mucic， James J. Storhoff也已經(jīng)描述過使用這樣的納米顆粒用于比色檢測的方法， A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials, Nature 382， 607-609 ( 1996年8月15曰) 和Selective Colorimetric Detection of Polynucletides Based on the Distance-Dependent Optical Properties of Gold Nanoparticles, Science 22， 1999年8月，277:1078-1081。在使用 金納米顆粒探針的優(yōu)選實施方案中，觀察到顏色從紅色變?yōu)樽仙?br> 參照圖4B,該方法可以是多路的。在此多路指的是同時檢測一種 溶液中的許多不同目標(biāo)?？梢园凑請D4A中所示的進(jìn)行該多路技術(shù)。一種納米結(jié)構(gòu)(例如，13nm金納米顆粒)可以和不同的點位置一起使用 (這是較簡單的形式)。然而，使用多個標(biāo)記的多路技術(shù)將更有益(這 是真正的多路，因為通過進(jìn)行一個實驗可以從一個試管檢測幾個標(biāo)記， 并且通過看顏色讀出可以區(qū)分目標(biāo))。在此的主要構(gòu)思是使用呈現(xiàn)不 同光學(xué)特性的不同納米結(jié)構(gòu)(形狀，組成和大小是變量)，這些特性 使得可以用呈現(xiàn)出許多不同顏色的不同納米結(jié)構(gòu)來標(biāo)記目標(biāo)分子。再一次參照圖4B，還可以使用銀納米顆粒和其他用于讀出的量子 點進(jìn)行該方法。在使用銀納米顆粒探針的實施方案中，顏色改變可以 從橙色，黃色或綠色并取決于顆粒的大小、形狀等通常變?yōu)楦畹狞S 色或綠色。a.條形碼寡核苷酸的比色檢測一旦DNA條形碼或報告寡核苷酸通過去雜交從探針復(fù)合物中的多 孔微粒中釋放出來，可以通過任何合適的方法來檢測。通常，在檢測 之前，DM條形碼通過去雜交從復(fù)合物中釋放出來。可以使用任何合 適的溶液或介質(zhì)，將DNA條形碼去雜交并從復(fù)合物中釋放出來。代表 性的介質(zhì)是水。在優(yōu)選的實施方案中，通過以下的方法來檢測條形碼DNA: (a) 提供包括第一和第二納米顆粒探針的溶液，其中用與所述條形碼寡核 苷酸的所述特異性DM序列的一個末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸官能化第 一納米顆粒探針，并且其中用與所述條形碼寡核苷酸的所述特異性 DNA序列的另一相對末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸官能化第二納米顆粒探 針；(b )將從探針復(fù)合物中分離出來的所述條形碼寡核苷酸與所述溶 液混合，以允許所述條形碼寡核苷酸與所述納米顆粒探針雜交和所述 納米顆粒探針聚集物的裝配，其中溶液中的顏色改變反映出所述聚集 物的形成；(c)將所述溶液點樣在基質(zhì)(substrate)上；(d)檢測 與對照相比較所述溶液中的顏色改變。在另一個實施方案中，可以通過使用具有與其結(jié)合或連接的納米 顆粒探針的基質(zhì)來擴(kuò)大可檢測的改變(信號)和提高測定的靈敏度。29然后將含有條形碼寡核苷酸的溶液置于基質(zhì)上，用于隨后的檢測。在優(yōu)選的實施方案中，在溶液中提供了用與所述特異性DNA序列 的一部分互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸官能化的納米顆粒探針。提供了兩組納 米顆粒探針；各自用與從探針復(fù)合物釋放出來的條形碼寡核苷酸的特 異性DNA序列的兩個末端之一互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸官能化。因此，連 接到一組納米顆粒探針的捕獲寡核苷酸具有與待檢測的條形碼寡核苷 酸的序列5，端互補(bǔ)的序列，而另一組納米顆粒探針具有與待檢測的 條形碼寡核苷酸的序列3，端互補(bǔ)的序列。然后在有效允許納米顆粒 探針上的捕獲寡核苷酸與條形碼寡核苷酸雜交的條件下，將條形碼寡 核苷酸接觸兩組納米顆粒探針。以這種方式，條形碼寡核苷酸與至少 兩個納米顆粒探針結(jié)合，以允許納米顆粒探針聚集物的裝配。由此納 米顆粒探針聚集物的形成反映在含有捕獲納米顆粒探針聚集物的溶液 的比色改變中。然后可以將溶液點樣或傳送至基質(zhì)上，用于隨后的檢 測。如果溶液中存在足量的復(fù)合物，可以使用或不使用背景基質(zhì)肉眼 觀察復(fù)合物?？梢允褂萌魏卧试S觀察可檢測改變的基質(zhì)。合適的基質(zhì) 包括透明的固體表面(例如，玻璃，石英，塑料和其他聚合物)，不 透明的固體表面(例如，白色的固體表面，如TLC硅石板，濾紙，玻 璃纖維濾器，硝酸纖維素膜，尼龍膜)，和導(dǎo)電性固體表面(例如， 銦-錫-氧化物(IT0))?；|(zhì)可以是任何形狀或厚度，但是通常是平 而薄的。優(yōu)選的是透明基質(zhì)，如玻璃(例如，玻璃栽玻片)或塑料(例 如，微量滴定平板的孔)。在優(yōu)選的實施方案中，基質(zhì)是TLC板。在一個實施方案中，在比色改變的檢測用于患者疾病狀態(tài)診斷時， 為確保對抗假陽性發(fā)生率，應(yīng)當(dāng)提供多個板組或陣列用于測試。例如， 提供了高通量微平板，含有多個孔，每個孔含有相同的特定條形碼和 磁性顆粒探針的溶液來鑒定目標(biāo)分析物。在另一個實施方案中，對于 每個單個標(biāo)記或分析物，將該方法的檢測步驟進(jìn)行多次。例如，臨床醫(yī)生將形成五個點用于條形碼分析，除去最高和最低點強(qiáng)度的點，并 使用其他三個點用于最終的定量和診斷。的納米顆粒。這可以進(jìn)一步允許多路技術(shù)，用于鑒定樣品中存在的一個或多個至許多個不同目標(biāo)分析物的目的。參照圖4A，使用多個標(biāo)記 的多路技術(shù)將更有利，允許檢測一個樣品孔中的幾個目標(biāo)分析物。使鐠^二檢測，用4檢測每個納米顆;立的特異性光學(xué)特征或波;/如本 領(lǐng)域中已知并實踐的。本發(fā)明還包括提供用于檢測樣品中存在的多于一個目標(biāo)分析物的 陣列。例如，提供含有多個孔的高通量微平板，每個孔具有含有鑒定 目標(biāo)分析物的特異性探針的溶液。在另一個實施方案中，使用微射流技術(shù)來自動化和制備大規(guī)模平 行的陣列。合適的微射流裝置可以基于發(fā)明人之一和其他人在Proc. Natl. Acsd. Sci. USA， 102， 9745 ( 2005 )中所描述的，在此以其 整體通過引用并入本文。現(xiàn)在參照圖2,本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于定量比色條形碼DNA檢 測測定的定量方法，這使用之前的基于金納米顆粒的比色DNA檢測方 案是不可能的?？梢允褂脠D形軟件進(jìn)行該定量方法，該軟件是使用包 括以下步驟的方法開發(fā)的(a)獲取基質(zhì)上聚集物點的數(shù)字圖像；(b) 選擇點用于分析；(c)計算與對照點相比較的點強(qiáng)度。在一個實施方 案中，步驟(b)進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)對比度的步驟，用于更好的顯現(xiàn)觀察 和表征。在優(yōu)選的實施方案中，在使用金納米顆粒的情況中，根據(jù)以 下計算聚集物的定量，并因此計算出樣品中存在的分析物的量占強(qiáng)度-(對于對照點的通過i 五D通道的柱狀圖的平均值) '"、 (對于給定點的通過i EZ)通道的柱狀圖的平均值)點強(qiáng)度與條形碼DNA寡核苷酸的數(shù)量成比例，即，越多的納米顆 粒聚集，越少的紅色出現(xiàn)；并且條形碼DNA寡核苷酸的數(shù)量與存在的 目標(biāo)蛋白的量成比例。在優(yōu)選的實施方案中，將條形碼DM加入金納米顆粒探針后，將 溶液點樣于TLC板上并干燥。掃描平板來獲取平板的數(shù)字掃描。使用 圖形程序如ADOBE PHOTSHOP軟件調(diào)節(jié)掃描圖像對比度。然后選擇每個納米顆粒點，并使用定量函數(shù)如具有紅色通道選項的PHOTOSHOP中 的柱狀圖功能來定量選定的區(qū)域。使用來自柱狀圖窗口的平均值來計 算每個點的點強(qiáng)度。最后，該測定應(yīng)當(dāng)適用于護(hù)理點應(yīng)用，只需要探針溶液和TLC板。 目前正在進(jìn)行優(yōu)化檢測系統(tǒng)用于更好的定量以及使系統(tǒng)多路化用于其 他細(xì)胞因子的努力?？紤]了可以根據(jù)探針溶液的濃度，探針大小，反 應(yīng)時間改變或優(yōu)化所述的本發(fā)明的實施方案，合成更多單分散的多孔 微粒，或通過最小化交叉反應(yīng)性用于多路技術(shù)(例如，通過進(jìn)一步的 探針鈍化或調(diào)節(jié)反應(yīng)時間)。V. 檢測分析物的試劑盒在一個實施方案中，本發(fā)明提供了進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒，包 括高通量微平板，含有孔陣列，每個孔含有相同或不同的特異性條形 碼和磁性顆粒探針的溶液，來鑒定目標(biāo)分析物。將等份樣品與陣列中 的每個孔混合，因此允許在平行孔中進(jìn)行測定。在另一個實施方案中， 對于每個單個標(biāo)記或分析物，將該方法的檢測步驟進(jìn)行多次。例如， 臨床醫(yī)生將形成五個點用于條形碼分析，除去最高和最低點強(qiáng)度的點， 并使用其他三個點用于最終的定量和診斷。任選，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了進(jìn)行圖像分析的裝置， 包括用于獲得數(shù)字信號的工具，如平板掃描儀或CCD相機(jī)，和用于分 析的工具，如具有可以分析像素強(qiáng)度的圖形軟件的計算機(jī)。在優(yōu)選的 實施方案中，該裝置包括簡單的平板掃描儀和具有如ADOBE PHOTOSHOP (Adobe Systems, San Jose， CA)軟件的計算機(jī)來分析像素強(qiáng)度。VI. 實施例以下實施例用來舉例和說明，但不限制本發(fā)明。其滋辨厶'^^并和才法電子顯微照相J吏用了 UC Berkeley Microlab機(jī)構(gòu)的LEO 1550掃描電子顯微鏡(SEM)。在~ 3nm鉻汽相沉積至樣品上后，使用3kV加速電壓以3mm的工作距離拍攝圖像。
條形碼探針制備。為了制備條形碼探針，將lml氨基官能化的多孔珪石孩史粒(1. 57 x l09ml_1直徑3. 53 士 0. 49 ju m;從Phenomenex，Torrance, CA獲得)的水懸液在10， OOOrpm離心5分鐘，并除去上清液。將顆粒重懸浮于PBS溶液中，并再一次重復(fù)離心步驟。將所得到的聚苯乙烯顆粒沉淀重懸浮于lml pH7. 4的PBS溶液中的8%戊二醛中。將溶液在搖擺振蕩器上混合5小時。在10， OOOrpm離心5分鐘，并丟棄上清液(將該步驟再重復(fù)兩次)。將所得到的沉淀重懸浮于PBS中，并將5jug IL-2單克隆抗體加入溶液中。抗體的量(5jig)比Polysciences， Inc.推薦的用來完全修飾顆粒表面的抗體量低得多(抗體購自Abcam， Inc， Cambridge, MA)。將溶液置于振蕩器上過夜，來將抗IL-2連接到活化的聚苯乙烯顆粒。其他人已經(jīng)廣泛使用類似的戊二醛連接物化學(xué)來實現(xiàn)蛋白質(zhì)與氨基官能化顆粒的連接。然后將3，氨基官能化條形碼DNA互補(bǔ)物(lml 100 n M ;5 ，CGTCGCATTCAGGATTCTCAACTCGTAGCT-Ai。-C6-胺3， ( SEQ ID NO: 1))加至單克隆抗體修飾的硅石顆粒，并將離心步驟重復(fù)兩次。將所得到的沉淀重懸浮于lml 0. 2M乙醇胺中，以在室溫將微粒上所有未反應(yīng)的戊二醛位點鈍化30分鐘。進(jìn)行離心來除去上清液。隨后加入牛血清白蛋白溶液(10WBSA)來進(jìn)一步鈍化顆粒表面的蛋白無活性區(qū)域。將離心步驟重復(fù)兩次，并除去上清液。將所得到的沉淀重懸浮于lml 0. 15MPBS溶液中。
磁性探針制備。將氨基官能化的磁性顆粒(Dynal Biotech, BrownDeer， WI)連接到IL-2的單克隆抗體。這些抗體的表位不同于用于使用戊二醛-胺偶聯(lián)化學(xué)制備條形碼探針的抗體的那些(Abcam，Cambridge, MA)。用10ml吡咬洗滌緩沖液洗滌0. 05mM EDTA溶液中的氨基官能化的磁性顆粒(5ml lmg/ml的溶液)。將所得到的溶液磁性分離，并除去上清液(再重復(fù)兩次)。然后在室溫用5ml吡啶洗滌緩沖液中的5%戊二醛活化磁性顆粒3小時。然后將活化的磁性顆粒磁性分離，并除去上清液。將該磁性分離步驟重復(fù)兩次，并將磁性顆粒
重懸浮于IO邁I吡啶洗滌緩沖液中。然后將吡啶洗滌緩沖液中的單克隆抗IL-2(lml 750jug/ml)加入磁性顆粒中，并將溶液在室溫混合10小時。然后，將lmg BSA加入磁性顆粒溶液中，并將溶液在室溫再混合10小時。將磁性分離步驟重復(fù)兩次，并將磁性顆粒重懸浮于5ml吡啶洗滌緩沖液中。然后將3ml甘氨酸溶液(1M， pH8. Q )加入所得到的溶液中來淬滅所有未反應(yīng)的醛位點，并將所得到的溶液攪拌30分鐘。在磁性分離步驟后，將5ml洗滌緩沖液加入單克隆抗體官能化的磁性顆粒中并劇烈混合(將該步驟再重復(fù)兩次)。然后將磁性顆粒磁性分離并除去上清液。將該洗滌步驟再重復(fù)三次。最后，將磁性探針重懸浮于O. 15M PBS溶液中。
條形碼DNA定量。將條形碼DNA加入金納米顆粒探針后，將溶液點樣在TLC板上并干燥。使用平板掃描儀掃描平板，并使用AdobePhotoshop軟件調(diào)節(jié)掃描的圖像(將所有的點一起調(diào)節(jié))。然后選擇每個納米顆粒點，并使用 Adobe Photoshop (Adobe SystemsIncorporated, San Jose， CA)具有紅色通道選項的柱狀圖功能來定量選定的區(qū)域。使用來自柱狀圖窗口的平均值計算每個點的點強(qiáng)度(圖2)。
實施例2:細(xì)胞因子的比色生物條形碼擴(kuò)增測定
在該工作中，我們的測定目標(biāo)是白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 。 IL一是分泌的人細(xì)胞因子蛋白質(zhì)，其介導(dǎo)炎癥和免疫應(yīng)答過程中白細(xì)胞之間的局部相互作用。細(xì)胞因子在造血作用的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用；介導(dǎo)表型上不同的細(xì)胞的分化，遷移，活化和增殖。21'22提高的細(xì)胞因子檢測極限將使得可以更早和更準(zhǔn)確地診斷和治療癌癥和免疫缺陷相關(guān)的疾病，并導(dǎo)致對細(xì)胞因子相關(guān)疾病和生物學(xué)的提高理解，因為當(dāng)人受到外來抗原感染時，細(xì)胞因子是特征生物標(biāo)記。常規(guī)的細(xì)胞因子檢測測定具有~ 50fM的檢測極限，而基于酶的滾動循環(huán)擴(kuò)增方法的檢測極限是 500aM。
34在典型的生物條形碼比色生物條形碼測定中，制備了兩種類型的
探針(圖1A)。第一種是條形碼探針，用抗IL-2和寡核普酸修飾的3jLim多孔硅石顆粒，該寡核苷酸與條形碼序列(5，AGCTACGAGTTGAGAATCCTGAATGCGACG3， ( SEQ ID NO: 2 ))互補(bǔ)，后者是目標(biāo)分子的獨特鑒定標(biāo)簽。第二種探針是2. 8 p m氧化鐵磁性探針顆粒，其具有磁性氧化鐵核心，具有胺修飾的硅烷涂層(Dynal Biotech,Brown Deer， WI )。用可以捕獲IL2目標(biāo)的抗IL-2分子官能化這些顆粒。
該測定的檢測極限幾個數(shù)量級優(yōu)于其他的常規(guī)免疫測定。在一個實施方案中，測定在檢測IL-2中表現(xiàn)出三個數(shù)量級更優(yōu)(例如，在PBS緩沖液中30aM IL-2)。顯著地，在該實施方案中，在檢測IL-2中，該檢測極限比基于酶的擴(kuò)增方法靈敏 15倍。
在1卜2檢測測定中(圖1B)，將15pL磁性探針溶液(1. 5 x 109珠子/ml )加入20p 1 IL-2溶液中，接著加入15|i 1條形碼探針溶液(1 x 1()9珠子/ml )。將所得到的溶液在定軌振蕩器上37TC孵育50分鐘。接著，將溶液置于磁性分離器(Dynal Biotech, BrownDeer， WI)中，并除去上清液。然后，用0. 15M PBS溶液再洗探針復(fù)合物溶液3次。最后，將50jli1 MN0純水(18兆歐)加入磁性分離的復(fù)合物中來釋放條形碼DNA,并將復(fù)合物在70X:搖擺振蕩器中保持10分鐘。磁性分離后，收集包括游離條形碼DNA鏈的上清液用于條形碼DNA檢測。為了檢測條形碼DNA，將30nm為條形碼DM捕獲而官能化的金納米顆粒探針(對于探針1和2均為25 jl; 1 lnM)(條形碼捕獲探針l: 5，TCTCAACTCGTAGCTAAAAAAAAAA-三甘醇-SH 3， ( SEQ ID NO: 3 );條形碼捕獲探針2: 5， SH-三甘醇-AAAAAAAAAACGTCGCATTCAGGAT3， ( SEQ IDNO: 4))加入0. 15M PBS溶液中的條形碼DNA。將所得到的溶液保持在室溫一個半小時。然后將溶液離心來提高探針復(fù)合物的濃度和收集小的納米顆粒聚集物(10， 000rpm 5分鐘)，并丟棄上清液。盡管在此使用了離心步驟，該步驟對于進(jìn)一步優(yōu)化后該測定的實際實施可能不是必需的。最后，將1來自濃縮的納米顆粒溶液的納米顆粒探針溶液點樣在反相硅石TLC板(EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ )上，用于目標(biāo)證實和定量(圖2A)。點測試為30aM至300fM，并包括其中不存在IL-2的對照樣品。在背景蛋白(每個樣品lul 5yM抗生物素和1 ji 1 5pM抗纖連蛋白)存在下，該測定可以檢測低至30aMIL-2目標(biāo)。點樣的點不僅顯示出不同的顏色，而且顯示出不同的強(qiáng)度。使用基于反映出金納米顆粒聚集的紅色強(qiáng)度的圖像分析軟件(AdobePhotoshop, Adobe Systems Incorporated, San Jose， CA)定量每個點強(qiáng)度。因為該比色測定是基于顏色從紅色(無條形碼DM)變?yōu)樽仙?具有條形碼DNA)，較低的平均紅色通道值表示溶液中存在較多的條形碼DNA (圖2 )。在此的點強(qiáng)度定義為對照點的平均紅色通道值除以給定樣品點的平均紅色通道值。圖3A中繪出了這些點強(qiáng)度值
(將實驗重復(fù)五次，并且最高和最低值沒有用于最終的點強(qiáng)度計算)。30aM目標(biāo)溶液的點強(qiáng)度高于對照點的點強(qiáng)度，并且該測定的動態(tài)范圍為30aM至300fM (圖3A )。
為了驗證該比色生物條形碼系統(tǒng)用于真實樣品，使用用于PBS緩沖液中IL-2檢測的相同方案測試了人血清樣品中的IL-2分子
(Cambrex Corp. ， East Rutherford, )。用于300aM， 3fM， 30fM和300fM IL-2樣品的基于納米顆粒的條形碼檢測點顯著不同于對照點
(圖3B) 。 30fM后點強(qiáng)度快速飽和。
本說明中引用的任何專利，專利公開，出版物或GenBank登錄號表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，并在此通過引用并入本文，至如同將每一篇特意和單獨通過引用并入本文的相同程度。
權(quán)利要求
1. 檢測目標(biāo)分析物的方法，包括步驟(a)提供懷疑含有所述目標(biāo)分析物的樣品；(b)將(I)包括特異性結(jié)合所述目標(biāo)分析物的第一配體和條形碼寡核苷酸的多孔微粒探針和(II)包括特異性結(jié)合所述目標(biāo)分析物的第二配體的磁性顆粒探針接觸所述樣品，并使所述多孔微粒探針和所述磁性顆粒探針結(jié)合所述目標(biāo)分析物，如果所述樣品中存在所述目標(biāo)分析物，在所述多孔微粒探針和所述磁性顆粒探針之間形成復(fù)合物；(c)從所述樣品中分離所述復(fù)合物；(d)從所述復(fù)合物釋放并收集所述條形碼寡核苷酸；和(e)檢測所述條形碼寡核苷酸。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)分析物選自核酸，蛋白質(zhì)， 肽，金屬離子，半抗原，藥物，代謝物，殺蟲劑和污染物。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)分析物是細(xì)胞因子。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)分析物是趨化因子。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔微粒探針包括選自聚苯乙烯， 纖維素，硅石，氧化鐵，聚丙烯酰胺，多糖，葡聚糖，瓊脂糖和纖維 素的材料。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中用胺修飾所述多孔微粒探針。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒具有約0. 1微米至約5000 微米的大小。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒具有約0. 5微米至約10微 米的大小。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒具有約3微米至約5微米的 大小。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔微粒探針具有約50埃至約 150埃的孔徑大小。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔微粒探針具有約90埃至約110埃的孔徑大小。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔微粒探針具有約300m2/g 至約500m7g的表面積。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔微粒探針具有約400m7g 至約450m7g的表面積。
14. 權(quán)利要求l的方法，其中所述條形碼寡核苷酸選自基因，病 毒RNA和DNA，細(xì)菌DNA，真菌DNA，哺乳動物DNA， cDNA， mRNA， RNA 和DNA片段，天然和合成的核酸，以及適體。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中用可檢測的標(biāo)記修飾所述條形碼寡 核苷酸。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述可檢測的標(biāo)記選自生物素，放 射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，發(fā)色團(tuán)，氧化還原活性基團(tuán)，具有電特征的基 團(tuán)，催化基團(tuán)和拉曼標(biāo)記。
17. 權(quán)利要求l的方法，其中所述條形碼寡核苷酸和所述微粒是 通用探針的成員。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中所述配體是單克隆或多克隆抗體。
19. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟(e)是比色測定。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述比色測定包括通過以下步驟檢 測所述條形碼寡核苷酸(i)提供包括第一和第二顆粒探針的溶液，其中所述第一顆粒探 針包括與所述條形碼寡核苷酸的一個末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸，并且 其中所述第二顆粒探針包括與所述條形碼寡核苷酸的另 一相對末端互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸；(H )將所述條形碼寡核苷酸接觸步驟(i)的所述溶液并使所述 條形碼寡核苷酸與所述第一和第二顆粒探針雜交，借此所述第一和第 二顆粒探針聚集成聚集物，其中溶液中的顏色改變表示所述聚集物的形成；和(iii)檢測所述溶液中的所述顏色改變。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過生物條形碼測定檢測目標(biāo)分析物的方法。本發(fā)明提供了能夠檢測微小濃度分析物的比色生物條形碼方法，該方法依賴于能夠在每個顆粒上裝載大量條形碼DNA的多孔顆粒，和基于金屬顆粒的比色條形碼檢測方法。
文檔編號G01C3/14GK101523156SQ200680041376
公開日2009年9月2日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者J·T·格羅夫斯, 南佐旻 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會