專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其檢測(cè)方法，尤其是涉及一種基于生物條形碼模式構(gòu)建的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，具有高發(fā)病率和高死亡率，隨著人們生活水平日漸提高，癌癥早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷已成關(guān)注焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物是這樣一類(lèi)物質(zhì),在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生,或者由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)而產(chǎn)生，分泌并釋放到血液、細(xì)胞、體液中，可直接、有效反應(yīng)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的產(chǎn)生、發(fā)展和治療效果等情況。顯然，檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)癌癥早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的重要手段。目前，國(guó)內(nèi)外也已對(duì)此做了大量的研究工作，已有少量腫瘤標(biāo)志物被應(yīng)用于臨床檢測(cè)。但總體而言，現(xiàn)有方法靈敏度有限，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌前病變、早期患者體內(nèi)極低濃度腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)高靈敏度的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法仍是迫切需求。免疫傳感器是利用抗體與抗原之間的特異性識(shí)別與結(jié)合而研制成的一類(lèi)生物傳感器，響應(yīng)速度快、特異性強(qiáng)、選擇性好、重現(xiàn)性好。電化學(xué)發(fā)光免疫分析是電化學(xué)發(fā)光和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物，具有快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點(diǎn)。基于納米粒子的生物條形碼技術(shù)是一種有效的信號(hào)放大和檢測(cè)技術(shù)，該方法通過(guò)目標(biāo)蛋白第一抗體標(biāo)記的磁性微球、目標(biāo)蛋白、目標(biāo)蛋白的第二抗體和條形碼DNA同時(shí)標(biāo)記的納米金顆粒形成夾心式免疫復(fù)合物，磁場(chǎng)分離后，經(jīng)去雜交將條形碼DNA釋放，再通過(guò)下游檢測(cè)方法如PCR擴(kuò)增、生物芯片法等檢測(cè)條形碼DNA數(shù)量以檢測(cè)目標(biāo)蛋白濃度。該方法靈敏度超高，比常規(guī)ELISA高IO6倍，是目前報(bào)道的唯一一種具有聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)靈敏度而又不需要酶放大的檢測(cè)體系。因具有超高靈敏度，生物條形碼技術(shù)自2003年問(wèn)世以來(lái)，越來(lái)越受到科學(xué)家關(guān)注，但至今未見(jiàn)生物條形碼技術(shù)在免疫傳感器構(gòu)建方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于生物條形碼模式的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其兼具生物條形碼技術(shù)的超高靈敏度和電化學(xué)發(fā)光免疫分析快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，達(dá)到對(duì)腫瘤疾病早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的目的，本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對(duì)電極，所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體、腫瘤標(biāo)志物、以及腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。所述的參比電極為Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極，所述的對(duì)電極是鉬電極。所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物。一種制備用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方法，包括以下步驟: (O固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極的制備
a.將直徑為3 5mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二招拋光處理，超聲2 min，超純水沖洗干凈后，置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定；
b.將步驟(a)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中，4°C下反應(yīng)10 h ；
c.將步驟(b)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在2.5%戊二醛水溶液中，4 °C下反應(yīng)I h ;
d.將步驟(c)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50μ g/mL的腫瘤標(biāo)志物第一抗體中，4 °C下反應(yīng)12 18 h ; e.將步驟(d)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中，4 °C下封閉I 2 h，即得固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極；
(2)腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的合成
a.導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時(shí)，緩慢滴加5mL正硅酸四乙酯(TEOS);滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入
0.18 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL的20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌1 h，4000 rpm離心洗滌，沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球，4 1:儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> b.取1 2mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)1 h，4000 rpm離心洗滌；
c.取步驟(b)所得的沉淀物，加入0.5 1 mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)1 h，4000 rpm離心洗滌；
d.取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反1 h ；
e.取3 5Pg腫瘤標(biāo)記物第二抗體加入到步驟(d)所得的懸浮液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌，即可得到腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> (3)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝
a.將固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極，浸泡在含腫瘤標(biāo)志物的溶液中，4 °C下溫育 50 min ；
b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h;
c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物。步驟(2)的(a)步驟中所述的乙醇、所述的水和所述的濃氨水的混合體積比為87:7:1。一種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，具體步驟如下:
(O電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝
a.配制一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液，將權(quán)利要求2中制備得到的固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極，分別浸泡在不同濃度的腫瘤標(biāo)志物的溶液中，4 °C下溫育50min ；
b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL的權(quán)利要求2中制備得到的腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h ；
c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器；
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
將電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器放入含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，獲得一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系；
(3)樣品測(cè)定
根據(jù)上述步驟獲得待測(cè)樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣品溶液中腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確濃度。所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含I 3 mM的H2O2的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為9 11。所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含0.03 2 mM的2- (二丁基胺)乙醇(DBAE)的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為7 9。所述的腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE )、人絨毛膜促性腺激素(hCG )和J L茶酚胺類(lèi)物質(zhì)。發(fā)明原理:現(xiàn)行電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中，電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物直接標(biāo)記在第二抗體上，一個(gè)腫瘤標(biāo)志物抗原一般對(duì)應(yīng)于一個(gè)第二抗體，而一個(gè)第二抗體至多可以標(biāo)記20個(gè)左右的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，否則失去免疫活性，這就意味著一個(gè)腫瘤標(biāo)志物抗原至多對(duì)應(yīng)于20個(gè)左右電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；本發(fā)明創(chuàng)新標(biāo)記手段，采用生物條形碼模式，將電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物不直接標(biāo)記于第二抗體，而是和第二抗體一起固載到導(dǎo)電納米球之上，這樣，一個(gè)腫瘤標(biāo)志物抗原對(duì)應(yīng)于一個(gè)導(dǎo)電納米球，而一個(gè)導(dǎo)電納米球表面可以標(biāo)記數(shù)萬(wàn)個(gè)電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，這就意味著，一個(gè)腫瘤標(biāo)志物抗原可以對(duì)應(yīng)于數(shù)萬(wàn)個(gè)電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，靈敏度大幅提高是必然的?？偠灾?，該導(dǎo)電納米球比表面積大，且具有導(dǎo)電表面，既不影響電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與電極之間的能量、電子傳遞，大幅度提高有效的電化學(xué)發(fā)光探針數(shù)目至傳統(tǒng)標(biāo)記方法的千倍以上，又不會(huì)影響第二抗體活性，最終實(shí)現(xiàn)大幅度提高檢測(cè)靈敏度的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(O高靈敏度，本發(fā)明的檢測(cè)限達(dá)到10_3 10_4 pg/mL，而目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢測(cè)限最高也只有0.1 I pg/mL。(2)高選擇性，常見(jiàn)其他蛋白對(duì)本檢測(cè)體系均無(wú)干擾。原因在于:本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，是基于抗體與抗原之間的特異性識(shí)別與結(jié)合構(gòu)建的，干擾蛋白不是腫瘤標(biāo)志物第一抗體和第二抗體的目標(biāo)物，因此待測(cè)液中的干擾蛋白并不能與腫瘤標(biāo)志物第一抗體和第二抗體結(jié)合，故對(duì)本檢測(cè)體系無(wú)干擾。(3)結(jié)果準(zhǔn)確，回收率達(dá)到91% 110%。(4)操作簡(jiǎn)單。綜上所述，本發(fā)明擬制備一種基于生物條形碼模式的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，兼具生物條形碼技術(shù)的超高靈敏度和電化學(xué)發(fā)光免疫分析快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活多樣的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，達(dá)到對(duì)腫瘤疾病早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的目的。


圖1為腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的制備過(guò)程流程 圖2為基于生物條形碼模式構(gòu)建的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備過(guò)程流程 圖3為一系列的電化學(xué)阻抗圖，阻抗的變化表明了電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的層層組裝制備過(guò)程(電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的層層組裝制備過(guò)程中的阻抗變化圖)。a:裸電極；b:組裝半胱胺后的金電極；c:組裝腫瘤標(biāo)志物第一抗體后的金電極；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極；e:組裝腫瘤標(biāo)志物后的金電極；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極。實(shí)驗(yàn)條件:50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)，含 5 mmol/L Fe (CN) 64_/3_ 溶液；
圖4為一系列的電化學(xué)發(fā)光行為圖，表明電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器層層組裝制備過(guò)程中電化學(xué)發(fā)光行為的變化。(電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器層層組裝制備過(guò)程中的電化學(xué)發(fā)光行為圖)a:裸電極；b:組裝半胱胺后的金電極；c:組裝腫瘤標(biāo)志物第一抗體后的金電極；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極；e:組裝腫瘤標(biāo)志物后的金電極；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極。實(shí)驗(yàn)條件:0.05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H2O2),電位范圍O 1.0 V，掃速0.1 V/s ；
圖5中A為檢測(cè)一系列不同濃度(a g，4X 10_8 4X 10_6 ng/mL)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)的電化學(xué)發(fā)光行為圖。B為不同濃度腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)的ECL信號(hào)一濃度線性圖。實(shí)驗(yàn)條件:0.05 M碳酸鹽緩沖液(含ImM的H2O2),電位范圍O
1.0 V，掃速 0.1 V/s。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例一
腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的合成，其具體步驟如下:
(a)導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100 mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液(Vi醇:V*:V濃氨水=87:7:1為宜)，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時(shí)，緩慢滴加5 mL正硅酸四乙酯(TEOS)；滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入0.18 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗漆,然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL 20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌I h，4000 rpm離心洗滌，所得沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?b)取I 2 mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌；
(c)取步驟(b)所得的沉淀物,加入0.5 I mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物)溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h,4000 rpm離心洗漆；
(d)取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h ；
(e)取3 5μg腫瘤標(biāo)記物第二抗體加入到步驟(d)所得的溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，即可得到腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞唧w實(shí)施例二
半胱胺組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將直徑為3 5 mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，將金電極用超純水沖洗干凈，在超純水中超聲2 min，然后置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定；將該金電極用超純水沖洗干凈后 ，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中4 °C下反應(yīng)10 h，用超純水沖洗干凈，即可得到半胱胺修飾的金電極。這一過(guò)程可用交流阻抗法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3所示，未修飾半胱胺之前的裸電極阻抗很小(曲線a)，修飾了半胱胺之后的金電極阻抗大大增加(曲線b)，表明半胱胺成功地組裝到金電極上。
具體實(shí)施例三 戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實(shí)施例二中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在含有2.5%的戊二醛水溶液中4°C下反應(yīng)I h;將該金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物第一抗體中4°C下反應(yīng)12 18 h，用超純水沖洗干凈，即可得到戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體修飾的金電極。這一過(guò)程可用交流阻抗法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3所示，修飾了戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體之后的金電極阻抗大大增加(曲線C)，表明戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體成功地組裝到金電極上。具體實(shí)施例四
牛血清白蛋白組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實(shí)施例三中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中4 °C下封閉I 2 h，用超純水沖洗干凈，即可得到牛血清白蛋白固載的金電極。這一過(guò)程可用交流阻抗法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3所示，組裝了牛血清白蛋白之后的金電極阻抗大大增加(曲線d)，表明牛血清白蛋白成功地組裝到金電極上。具體實(shí)施例五
腫瘤標(biāo)志物組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將該實(shí)施例四中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在含腫瘤標(biāo)志物的溶液中4 °〇下溫育50 min;用超純水沖洗干凈，即可得到腫瘤標(biāo)志物組裝的金電極。這一過(guò)程可用交流阻抗法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3所示，組裝了腫瘤標(biāo)志物之后的金電極阻抗大大增加(曲線e)，表明腫瘤標(biāo)志物成功地組裝到金電極上。具體實(shí)施例六
腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球組裝的金電極的制備，其具體步驟如下:
將實(shí)施例五中的金電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50 Pg/mL腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球溶液中4 °C下反應(yīng)I h;用超純水沖洗干凈，即可得到腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球組裝的金電極。這一過(guò)程可用交流阻抗法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3所示，修飾了腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球之后的金電極阻抗大大減小(曲線f)，因?yàn)橹苽淠[瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球中用的新型吸附載體是導(dǎo)電納米球，所以組裝上腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球后阻抗大大減小，表明腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球成功地組裝到金電極上。具體實(shí)施例七
構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，其具體步驟如下:
將實(shí)施例六中的金電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，選擇合適的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液。將上述的三支電極，放入合適的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。配制一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液，按照前述步驟獲得一系列的對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)上述步驟獲得待測(cè)樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣品溶液中腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確濃度。具體實(shí)施例八
以前列腺特異性抗原(PSA)為例檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝過(guò)程的電化學(xué)發(fā)光行
為
按照實(shí)施例一的操作步驟完成導(dǎo)電納米球、復(fù)合功能化納米球的制備。然后按照實(shí)施例二至六層層組裝金電極，在0.05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H202)、電位范圍O 1.0 V、掃速0.1 V/s的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試并記錄如下電極的電化學(xué)發(fā)光行為:a:裸電極(圖4.a)；b:組裝半胱胺后的金電極(圖4.b)；c:組裝腫瘤標(biāo)志物第一抗體后的金電極(圖4.c)；d:組裝牛血清白蛋白后的金電極(圖4.d)；e:組裝腫瘤標(biāo)志物后的金電極(圖4.e)；f:組裝復(fù)合功能化納米球后的金電極(圖4.f)。由圖4可以得出，a e均無(wú)發(fā)光信號(hào)，只有f有顯著的發(fā)光信號(hào)，是因?yàn)槁汶姌O、半胱胺、腫瘤標(biāo)志物第一抗體、牛血清白蛋白、腫瘤標(biāo)志物均無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，而復(fù)合功能化納米球標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，所以只有在組裝上復(fù)合功能化納米球后，本發(fā)明的傳感器才會(huì)有電化學(xué)發(fā)光行為。本發(fā)明建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系后，可以由待測(cè)物的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度直接得出腫瘤標(biāo)志物的濃度。具體實(shí)施例九 本發(fā)明的靈敏度及線性范圍
以檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)為例，按照發(fā)明內(nèi)容中的具體實(shí)驗(yàn)步驟構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，在實(shí)驗(yàn)條件:0.`05 M碳酸鹽緩沖液(含I mM的H2O2),電位范圍O 1.0 V,掃速0.1 V/s下測(cè)試電化學(xué)發(fā)光。如圖5所不，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨著腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)濃度(4X 10_8 4X 10_6 ng/mL)的增加而增加，腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)濃度的對(duì)數(shù)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為:1=4004.59 + 416.46*1呢(:，線性相關(guān)系數(shù)為0.9986。該公式中I是電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，C是腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)的濃度。具體實(shí)施例十
其他蛋白對(duì)本發(fā)明構(gòu)建的傳感器的影響
本發(fā)明具有高選擇性，常見(jiàn)的牛血清白蛋白、小雞白蛋白、血漿蛋白、免疫球蛋白或者非目標(biāo)腫瘤標(biāo)志物等蛋白質(zhì)，對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)應(yīng)用無(wú)干擾。為了確定本發(fā)明構(gòu)建的傳感器的特異性，以腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)作為目標(biāo)腫瘤標(biāo)志物，選擇小雞白蛋白、牛血清白蛋白、血漿蛋白、CEA、AFP、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原作為對(duì)照蛋白進(jìn)行測(cè)定。按照發(fā)明內(nèi)容中傳感器制備步驟構(gòu)建對(duì)照蛋白的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光行為測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示，本電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器只對(duì)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)有強(qiáng)的響應(yīng)，其他蛋白的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)可以忽略，進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明的高選擇性。具體實(shí)施例1^一 人唾液中腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)
準(zhǔn)確移取人唾液空白樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)，按照發(fā)明內(nèi)容中實(shí)施例一至實(shí)施例八的具體實(shí)驗(yàn)步驟構(gòu)建傳感器并進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表I。表I人唾液中多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對(duì)電極，其特征在于:所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體、腫瘤標(biāo)志物、以及腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征在于:所述的參比電極為Ag/AgCl電極或者甘汞電極，所述的對(duì)電極是鉬電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物。
4.一種制備權(quán) 利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方法，其特征在于包括以下步驟: (O固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極的制備 a.將直徑為3 5mm的金電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二招拋光處理，超聲2 min，超純水沖洗干凈后，置于0.5 M的H2SO4中，在O 1.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速為100 mV/s，直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定； b.將步驟(a)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在0.1 mol/L的半胱胺溶液中，4°C下反應(yīng)10 h ； c.將步驟(b)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在2.5%戊二醛水溶液中，4 °C下反應(yīng)I h ; d.將步驟(c)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50μ g/mL的腫瘤標(biāo)志物第一抗體中，4 °C下反應(yīng)12 18 h ; e.將步驟(d)所得電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清白蛋白中，4 °C下封閉I 2 h，即得固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極； (2)腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的合成 a.導(dǎo)電納米球的合成:在干凈的燒杯中加入90 100mL的由乙醇、水及濃氨水組成的混合液，磁力攪拌30 min ;待溶液混合均勻后，磁力攪拌的同時(shí)，緩慢滴加5 mL正硅酸四乙酯；滴加完畢后，用封口膜密封燒杯口，反應(yīng)10 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在超純水中形成10 mg/mL的第一懸浮液；取2 mL第一懸浮液至離心管中，加入0.18 mL3-氨丙基三乙氧基硅烷后，室溫下混勻攪拌7 h ；4000 rpm離心洗滌，然后將沉淀物分散在乙醇中形成0.5 mg/mL的第二懸浮液；取20 mL第二懸浮液至干凈的燒杯中，然后加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4溶液超聲混勻；然后緩慢滴加3 mL的20 mM的檸檬酸三鈉溶液，磁力攪拌I h,4000 rpm離心洗漆,沉淀物即粒徑約為80 100 nm的導(dǎo)電納米球,4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫? b.取I 2mg導(dǎo)電納米球，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌； c.取步驟(b)所得的沉淀物，加入0.5 I mL的0.001 M的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌； d.取步驟(c)所得的沉淀物，加水0.5 mL超聲分散，再加入90 100 μ 戊二醛，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h ；e.取3 5 Pg腫瘤標(biāo)記物第二抗體加入到步驟(d)所得的懸浮液，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育反應(yīng)I h，4000 rpm離心洗滌，即可得到腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球，4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫? (3)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝 a.將固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極，浸泡在含腫瘤標(biāo)志物的溶液中，4°C下溫育 50 min ； b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h; c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物或含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(2)的(a)步驟中所述的乙醇、水和濃氨水的混合體積比為87:7:1。
7.—種利用權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于具體步驟如下: (O電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝 a.配制一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液，將權(quán)利要求2中制備得到的固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極，分別浸泡在不同濃度的腫瘤標(biāo)志物的溶液中，4 °C下溫育50min ； b.將步驟(a)所得的電極用超純水沖洗干凈后，浸泡在50Pg/mL的權(quán)利要求2中制備得到的腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的水懸浮液中，4 °C下反應(yīng)I h ； c.將步驟(b)所得的電極用超純水沖洗干凈后，作為工作電極，采用鉬電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器； (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器放入含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，獲得一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系； (3)樣品測(cè)定 根據(jù)上述步驟獲得待測(cè)樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之間的定量關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣品溶液中腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的魯米諾及其衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含I 3 mM的H2O2的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為9 11。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于:所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為含氨基官能團(tuán)的三聯(lián)吡啶釕衍生物，所述的含共反應(yīng)試劑的緩沖溶液相應(yīng)為含0.03 2 mM的2- (二丁基胺)乙醇的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液，所述的Na2CO3-NaHCO3體系緩沖溶液的濃度為0.05 M，pH為7 9。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于:所述的腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白、癌胚抗原、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原、堿性磷酸酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、人絨毛膜促性腺激素和兒茶酚 胺類(lèi)物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用，該免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對(duì)電極，所述的工作電極為表面依次修飾有半胱胺、戊二醛、腫瘤標(biāo)志物第一抗體、腫瘤標(biāo)志物、以及腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的金電極，以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)；其制備方法包括固載有腫瘤標(biāo)志物第一抗體的金電極的制備步驟；腫瘤標(biāo)志物第二抗體和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記的復(fù)合功能化納米球的合成步驟；最后將得到的金電極和復(fù)合功能化納米球組裝成電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的步驟，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、分析速度快、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、方法靈活。
文檔編號(hào)G01N33/574GK103116023SQ20131003229
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者杜書(shū)平, 郭智勇, 郝婷婷, 陳貝貝, 王澤波 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)