一種用于檢測(cè)miRNA-20a的硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境分析領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)miRNA-20a的硼摻雜石墨烯量子點(diǎn) 電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]miRNAs是一類長(zhǎng)約20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，能夠參與 調(diào)控多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞分化，發(fā)育進(jìn)程，細(xì)胞凋亡，疾病，腫瘤等。有研宄表明，50 % 的miRNAs位于腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域或者脆弱的位點(diǎn)，并且不同類型的miRNAs的表達(dá)也 相應(yīng)的表示不同腫瘤疾病，miRNA-20a的表達(dá)已被證明至少與三種實(shí)體腫瘤相關(guān)。因此， miRNA-20a的定量檢測(cè)對(duì)于腫瘤的臨床診斷和藥物效果評(píng)估有著至關(guān)重要的作用。
[0003] 傳統(tǒng)的miRNAs檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)，雜交印跡法，微陣列芯片這幾種 方法。雖然這些方法的檢測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確，但是它們的操作都很復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用較高，耗時(shí)， 靈敏度低。近年來(lái)電化學(xué)傳感技術(shù)也被用于檢測(cè)miRNAs。然而這些方法基本上都是用酶， 磁性納米材料等作為信號(hào)放大技術(shù)。這些物質(zhì)不但價(jià)格較高，而且酶的使用壽命較短，對(duì)檢 測(cè)環(huán)境的PH、溫度等要求嚴(yán)格，這都不利于傳感器的推廣應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)適用性廣、操作簡(jiǎn) 單、綠色高效的、高選擇性高靈敏度的miRNAs檢測(cè)方法具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 電化學(xué)發(fā)光傳感器，由于其本身的特點(diǎn)近幾年來(lái)較受關(guān)注。這種技術(shù)所需設(shè)備簡(jiǎn) 單、檢測(cè)速度快、反應(yīng)可控，而且可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)原位分析。電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是電化學(xué)發(fā)光傳感 器的重要部件，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)性能的好壞，直接決定了電化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測(cè)效果。傳 統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，釕化合物、魯米諾，均有一定的生物毒性，如果用于檢測(cè)miRNAs，難免 會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。石墨烯量子點(diǎn)近年來(lái)也被用做電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。但是其本身根據(jù) 制備方法的不同，發(fā)光穩(wěn)定性也不同。因此提高電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的性能，并將電化學(xué)發(fā)光傳 感用于檢測(cè)miRNAs，成為了亟待解決的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)電化學(xué)方法制備了硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)，利用高導(dǎo)電性、高發(fā)光穩(wěn)定 性，高生物兼容性、環(huán)保友好的硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)作為電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，以與miRNA-20a 互補(bǔ)的發(fā)夾狀DNA作為識(shí)別探針，構(gòu)建了對(duì)miRNA-20a具有高選擇性高靈敏度的硼摻雜石 墨烯量子點(diǎn)基電化學(xué)發(fā)光傳感器。解決了傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜、繁瑣耗時(shí)、成本高、實(shí)用性差 等缺點(diǎn)，應(yīng)用前景非常廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決了現(xiàn)有miRNA_20a檢測(cè)方法操作復(fù)雜、繁瑣耗時(shí)、成本高、實(shí)用性差等 不足，提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用的miRNA-20a的定量分析方法。
[0007] 將硼酸與石墨氧化物按一定比例混合，倒入玻璃管中，在加熱的條件下生成棒狀 的硼摻雜石墨烯。以此硼摻雜石墨烯棒為工作電極，石墨棒為對(duì)電極，通過(guò)電化學(xué)方法制備 硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)（BGQDs)。以巰基標(biāo)記的發(fā)夾狀DNA為探針捕捉miRNA-20a。將硼摻 雜石墨烯量子點(diǎn)標(biāo)記在發(fā)夾狀DNA的一端，形成電化學(xué)發(fā)光探針（記為BGQDs-DNA)。鉑電 極通過(guò)納米金（AuNPs)修飾后，電化學(xué)發(fā)光探針可以通過(guò)巰基與納米金的結(jié)合作用固定在 的電極表面，此時(shí)硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)貼近電極表面，能夠獲得較高的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。當(dāng) 體系中存在目標(biāo)miRNA-20時(shí)，發(fā)夾狀DNA的折疊結(jié)構(gòu)打開(kāi)，形成直鏈，使得硼摻雜石墨烯量 子點(diǎn)遠(yuǎn)離電極表面，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)降低。體系的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)在一定范圍內(nèi)與目標(biāo)物 miRNA-20的濃度呈線性反相關(guān)，從而為miRNA-20的定量檢測(cè)提供依據(jù)。
[0008] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)miRNA-20a的硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光傳感 器的制備，具體步驟如下：
[0009] (1)在冰浴狀態(tài)下將濃硫酸加入到石墨粉中并攪拌，然后將高錳酸鉀加入到上述 的混合物中，持續(xù)攪拌20-48小時(shí)；加入H2O并靜止10-60分鐘，隨后加入H2O和H2O2終止 反應(yīng)；將混合物離心分離，并用濃度為5%的鹽酸和水分別清洗，得到石墨氧化物；其中所 用的各物質(zhì)的摩爾比為濃硫酸：石墨粉：高錳酸鉀：H20 :H202= 1 :0 . 3 : 0 . 02 :10 : 0 . 2。
[0010] (2)向步驟⑴獲得的石墨氧化物中加入H3BO3,混合物至60-100°C保溫6-12小 時(shí)；將產(chǎn)物用水清洗，真空冷凍干燥，得到硼摻雜的石墨烯棒。其中石墨氧化物與H3BO3的質(zhì) 量比為250-5000。
[0011] (3)以步驟（2)獲得的硼摻雜的石墨烯棒為工作電極，以石墨棒為對(duì)電極通過(guò)電 化學(xué)方法制備硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)，電解液為含有25-50mMNaOH的無(wú)水乙醇和水的混合 液，無(wú)水乙醇和水的體積比=99:1-99. 5:0. 5,電流密度180-300mA/cm2,反應(yīng)1-3小時(shí)，離 心分離去除石墨雜質(zhì)；將得到的離心液透析24-48小時(shí)，透析孔徑小于5000Da，得到硼摻雜 的石墨稀量子點(diǎn)水溶液。
[0012] (4)向步驟⑶獲得的硼摻雜的石墨烯量子點(diǎn)水溶液中加入NaOH和C1CH2C00H， 超聲。再加入150mg/ml的N-羥基丁二酰亞胺（NHS)和lOmg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基 氨丙基）_碳化二亞胺（EDC)，反應(yīng)10-60分鐘；然后再加入100yM巰基標(biāo)記的發(fā)夾狀DNA， 緩慢攪拌。最后將混合物離心，沉淀即為電化學(xué)發(fā)光探針BGQDs-DNA。將電化學(xué)發(fā)光探針 BGQDs-DNA分散在0.IMTris-EDTA(TE)pH= 8. 0緩沖溶液中，儲(chǔ)存于4°C備用。其中NaOH 與CICH2COOh的質(zhì)量比為0. 25-0. 5 ;NHS與EDC的體積比1-3 ;硼摻雜的石墨烯量子點(diǎn)水溶 液與巰基標(biāo)記的發(fā)夾狀DNA的體積比120-1200。
[0013] (5)將AuNPs水溶液滴在鉑電極表面，記為Pt/Au，AuNPs水溶液在鉑電極表面的 體積2-8yL/mm2,室溫干燥，再將步驟（4)制得的BGQDs-DNA滴加到Pt/Au表面，BGQDs-DNA 在Pt/Au表面的體積2-6yL/mm2,1-3小時(shí)后用0.IM磷酸鹽（PBS)pH= 7. 4緩沖溶液沖洗 電極表面，即得硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光傳感器。
[0014] 步驟⑷中巰基標(biāo)記的發(fā)夾狀DNA總堿基數(shù)為31-39,其主體部位，對(duì)應(yīng)識(shí)別 miRNA-20a堿基序列為 5' -CTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3'。
[0015] 步驟（5)中鉑電極在使用前需要清潔，具體方法如下：
[0016] 將鉑電極在0. 05-1ym粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中研磨，研磨后依次用無(wú)水 乙醇和高純水超聲清洗，在N2保護(hù)下干燥。
[0017] 硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光傳感器浸入到含有的miRNA-20a的TE緩沖液中 (miRNA-20a的濃度范圍為l-50000pM)，37°C水浴條件下雜交0. 5-3小時(shí)，然后用0.IM磷酸 鹽（PBS)緩沖溶液（pH7. 4)沖洗電極表面。最后得到的電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電 極，銀/氯化銀電極為參比電極，利用多通道化學(xué)發(fā)光測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，檢測(cè) 是在含有0.IMKCl及0. 05MK2S2Oi^ 0.IMPBS緩沖溶液（pH= 7. 4)中進(jìn)行，電壓范圍為 0. 7~I. 15V，掃描速率0.lV/s，光電倍增管高壓為600V。
[0018]本發(fā)明具有如下效果：
[0019] (1)靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)0.05pM(S/N= 3)。
[0020] (2)相對(duì)于傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光材料，硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)生物毒性低，發(fā)光穩(wěn)定， 生命周期長(zhǎng)，不會(huì)造成環(huán)境污染。
[0021] (3)該電化學(xué)發(fā)光傳感器操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快，不需要復(fù)雜昂貴的大型設(shè)備，實(shí)用性 強(qiáng)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是本發(fā)明所述的miRNA_20a的定量檢測(cè)示意圖。
[0023] 圖2是本方法制備的硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)的TEM圖片。
[0024] 圖3是本發(fā)明的方法獲得的定量檢測(cè)miRNA-20a的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 電化學(xué)發(fā)光探針BGQDs-DNA的制備，包括如下步驟：
[0028] (1)在冰浴狀態(tài)下將23ml濃硫酸加入到Ig高純石墨粉中并攪拌，然后將3g高錳 酸鉀分多次加入到上述混合物中，持續(xù)攪拌24小時(shí)。加入50ml水并靜止15分鐘，隨后加 入150ml水和IOmlH2O2終止反應(yīng)。將混合物離心分離，并用濃度為5%的鹽酸和水分別清 洗沉淀，最終獲得石墨氧化物。
[0029] (2)向步驟⑴獲得的石墨氧化物中加入0.002gH3BO3，超聲10分鐘使其混合均 勻。然后將混合物轉(zhuǎn)移至玻璃管中，在鼓風(fēng)干燥箱中加熱至80°C保溫12小時(shí)。將產(chǎn)物用水 清洗幾次，然后真空冷凍干燥，最后得到硼摻雜的石墨烯棒。
[0030] (3)以步驟（2)獲得的硼摻雜的石墨烯棒為工作電極，以石墨棒為對(duì)電極通過(guò)電 化學(xué)方法來(lái)制備硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)。電解液為含有0.OlgNaOH的IOml無(wú)水乙醇和水的 混合液（體積比=99. 5:0. 5)，電流密度范圍200-250mA/cm2。反應(yīng)2小時(shí)后，通過(guò)離心分 離去除石墨雜質(zhì)。將得到的離心液放入透析袋（1000 Da)中，用純水透析24小時(shí)，最終得到 硼摻雜的石墨烯量子點(diǎn)水溶液。
[0031] (4)向IOml步驟（3)獲得的硼摻雜的石墨烯量子點(diǎn)水溶液中加入0. 015gNaOH和 0? 025gC1CH2C00H，超聲 3 小時(shí)（頻率：40KHZ,功率：200W)。將 400yLN-羥基丁二酰亞 胺（NHS，150mg/ml)和 250yL1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC，10mg/ml) 加入到上述混合物中反應(yīng)30分鐘。然后將50yL巰基標(biāo)記的發(fā)夾狀DNA(K)OyM)加入到 上述混合物中，并緩慢攪拌過(guò)夜。最后將混合物離心，沉淀即為電化學(xué)發(fā)光探針BGQDs-DNA。 將電化學(xué)發(fā)光探針?lè)稚⒃讴?IMTris-EDTA(TE)緩沖溶液（pH8.0)儲(chǔ)存于4°C備用。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 電化學(xué)發(fā)光探針BGQDs-DNA的制備，包括如下步驟：
[0034] (1)在冰浴狀態(tài)下將30ml濃硫酸加入到I. 2g高純石墨粉中并攪拌，然后將I.Sg 高錳酸鉀分多次加入到上述混合物中，持續(xù)攪拌24小時(shí)。加入100mL水并靜止15分鐘，隨 后加入180ml水和15mlH2O2終止反應(yīng)。將混合物離心分離，并用濃度為5%的鹽酸和水分 別清洗沉淀，最終獲得石墨氧化物。
[0035] (2)向步驟⑴獲得的石墨氧化物中加入0. 0025gH3