專利名稱：Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及口蹄 疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其構建方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由 口蹄疫病毒 (Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的主要侵害豬、牛、羊等偶蹄動物的一種急性、 熱性、高度接觸性傳染病。該病病原FMDV(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)共分為 7個血清型，分別為0，A，C，SAT 1,SAT 2，SAT 3和Asia 1型，感染一種血清型并不能產生 對另外一種血清型的免疫保護力。3A蛋白氨基酸的缺失多發(fā)生于0型FMDV，這種自然缺失 在Asia 1型FMDV至今尚未見報道。對于FMD的預防，在西方發(fā)達國家以檢疫為主，一旦發(fā)病以封鎖、隔離撲殺為主要 預防手段；而在發(fā)展中國家由于經濟發(fā)展條件的限制，多采用疫苗接種結合封鎖、隔離和撲 殺患病動物的預防措施。在我國對于該病的預防主要以強制免疫作為平時的主要預防措 施。由于鑒別口蹄疫自然感染和疫苗免疫動物(DIVA)是OIE判定一個國家有無口蹄疫的 依據(jù)，因此疫苗的設計和生產也要服務于這個原則，即可以與DIVA的診斷方法相輔相成。 動物感染FMDV后，通常既產生結構蛋白的抗體也能產生非結構蛋白的抗體。由于非結構蛋 白在口蹄疫病毒復制過程中產生，所以如果血清中存在非結構蛋白抗體則說明動物感染了 FMDV。而未感染的動物僅產生結構蛋白抗體，傳統(tǒng)疫苗中保留了大部分的病毒免疫原蛋白。 基于此原理，一些依賴于檢測非結構蛋白來鑒別FMD自然感染和疫苗免疫動物的ELISA方 法油然而生(De Diego et al. , 1997 ；Mackay et al. , 1998 ；Sorensen et al. , 1998 ；Moonen et al.，2004)。然而疫苗在制備過程中可能存在非結構蛋白殘留，降低了 ELISA試驗的特 異性。由于滅活疫苗純化過程中很難監(jiān)測，所以殘留的非結構蛋白會干擾對自然感染動物 的診斷，診斷的準確性低。分子標記疫苗是在分子水平上，將具有選擇性標記的基因克隆到病毒全長cDNA 中，經過檢測，可以區(qū)分抗體來自于自然感染還是標記疫苗免疫，從而鑒別出感染畜群和免 疫畜群。分子標記疫苗的開發(fā)有可能成為疫苗發(fā)展的一個主要方向。在國外，分子標記疫 苗研究的比較多，例如，1997年Michael等(Michael et al，1997，Michael，1997)用反向遺 傳技術在呼腸孤病毒基因組上插入了 CAT基因，并得到了 CAT活性極高的拯救病毒。Moser 等(1998)將CAT基因插入到CSFV Alfort/187株的全長cDNA克隆pA187_l上的Npro中， 并將體外轉錄本RNA轉染入SK-6細胞，結果得到了重組病毒VA187-CAT，重組病毒與原病毒 VA187-1在培養(yǎng)特性上無差別，并可在細胞培養(yǎng)液中檢測到融合蛋白CAT-Npro，此蛋白具 有CAT活性和Npro活性，CAT基因可穩(wěn)定保留在重組病毒基因組中，經傳代10次后仍具有 CAT活性。Shi等(2002)成功構建了西尼羅河病毒的全長感染性克并在cDNA上插入和缺 失了幾個酶切位點作為遺傳標記，試驗證明該重組病毒與其父本病毒具有同樣的致病性。 Yount等(2003)用反向遺傳技術拯救出了帶有突變標記的SARS病毒。Baric等(2005)構建出了帶GFP標記的MHV (mouse hepatitis virus)和SARS-CoV感染性cDNA，試驗證明，用此策略可在2個月內拯救出SARS病毒。國內，分子標記疫苗研究較少，如黃耀偉等(2003) 報道，通過定點突變在傳染性法氏囊病毒B節(jié)段上引入一個EcoRV酶切位點作為分子標記 并成功拯救出了傳染性法氏囊病毒；另又據(jù)網上新聞報道，我國還成功研制出帶分子標記 的高產重組禽流感疫苗株rH5N3、豬偽狂犬病毒閩A株SA215三基因缺失疫苗等一批產品。 然而FMD抗原表位分子缺失標記疫苗的研究在國內尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有滅活疫苗純化過程中很難監(jiān)測，所以殘留的非結構 蛋白會干擾對自然感染動物的診斷，診斷的準確性低的問題，而提供Asia 1型口蹄疫病毒 3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其構建方法。Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列為SEQ ID NO 1。Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的構建方法按以 下步驟進行一、從pBSAs全長重組質粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L (左 臂)和3A14R (右臂)，得到3A14L PCR產物和3A14R PCR產物，然后進行融合PCR并回收融 合產物；二、用EcoRT22I和Sma I分步雙酶切pBSAs全長重組質粒和融合產物，回收所需目 的片段，連接并構建重組質粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗 原表位缺失感染性cDNA的構建。本發(fā)明具有雙重特征，一是Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感 染性cDNA在缺失掉這14個氨基酸(NEYIDKANITTDDK)后病毒對某些細胞的感染能力下降， 甚至不感染；二是該區(qū)域是抗原表位區(qū)，缺失后即可作為一種標記與親本病毒相鑒別；本 發(fā)明中缺失3A非結構蛋白的一部分，不會殘留此部分的非結構蛋白，不會干擾對自然感染 動物的診斷，診斷的準確性高；傳統(tǒng)疫苗的弊端是一旦滅活不徹底，殘留的非結構蛋白會引 起機體產生針對非結構蛋白的抗體，而自然感染的動物體內由于也有非結構蛋白抗體，所 以給區(qū)分自然感染和疫苗免疫動物帶來很大困難。


圖1是具體實施方式
二中融合PCR凝膠電泳圖，其中1泳道為2000pluSMarker， 2泳道為3A14L PCR產物，3泳道為3A14R PCR產物，4泳道為融合產物；圖2是具體實 施方式二中重組質粒pBSAs-3A14D鑒定的凝膠電泳圖，其中1泳道為15000DNA Marker, 2泳道為EcoR V酶切產物；圖3是具體實施方式
二中缺失重組病毒的RT-PCR鑒定的 凝膠電泳圖，其中1泳道為2000plus Marker，2泳道為rvAs-3A14D PCR產物，3泳道為 rvAs-3A14D PCR產物；圖4是具體實施方式
二中重組病毒生長曲線，其中 為親本病毒，· 為rvAs-3A14D ；圖5是具體實施方式
二中3A14PCR擴增產物的凝膠電泳圖，其中1泳道為 2000plus Marker, 2泳道為3A14 PCR產物；圖6是具體實施方式
二中pET_32a_3A14表達 載體鑒定的凝膠電泳圖，其中1泳道為2000pluSMarker，2泳道為Xho I單酶切，3泳道為 Bgl II和Xho I雙酶切，4泳道為EcoR I酶切，5泳道為質粒對照；圖7是具體實施方式
二 中pET-32a-3A14-2表達載體鑒定的凝膠電泳圖，其中1泳道為2000plus Marker，2泳道為陰性結果，3泳道為3A14-2PCR產物；圖8是具體實施方式
二中pET_32a-3A14-4表達載 體鑒定的凝膠電泳圖，其中1泳道為2000plus Marker，2泳道為陰性結果，3泳道為陰性結 果，4泳道為Bgl II和Xho I雙酶切；圖9是具體實施方式
二中pET32a-3A14表達蛋白的 SDS-PAGE分析凝膠電泳圖，其中1泳道為蛋白分子量標準，2泳道為pET_32a空載體誘導 后，3泳道為pET-32a-3A14誘導后，4泳道為pET-32a_3A14誘導前；圖10是具體實施方式
二中pET32a-3A14-2和pET32a_3A14_4表達蛋白的SDS-PAGE分析凝膠電泳圖，其中1泳道 為pET32a空載體誘導后，2泳道為pET32a_3A14_2誘導前，3泳道為pET32a_3A14_2誘導后， 4泳道為pET32a-3A14-2誘導后裂解后沉淀，5泳道為pET32a-3A14_2誘導后裂解后上清， 6泳道為蛋白分子量標準，7泳道為pET32a-3A14-4誘導前，8泳道為pET32a-3A14_4誘導 后，9泳道為pET32a-3A14-4誘導后裂解后沉淀，10泳道為pET32a-3A14_4誘導后裂解后上 清；圖11是具體實施方式
二中3A14及其串聯(lián)表達蛋白的Western blot鑒定凝膠電泳圖， 其中1泳道為蛋白分子質量標準，2泳道為FMDV-VP2結構蛋白陽性對照，3泳道為pET_32a 空載體表達蛋白陰性對照，4泳道為3A14單獨表達蛋白(印i3A14)的westernblot結果， 5 泳道為3A14-2表達蛋白的western blot結果，6泳道為3A14-4表達蛋白的western blot 結果。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失 感染性cDNA的基因序列為=SEQ ID NO 10本實施方式中缺失掉的是3A基因91 104位氨基酸，這14個氨基酸的序列為 NEYIDKANITTDDK。
具體實施方式
二 本實施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失 感染性cDNA的構建方法按以下步驟進行一、從pBSAs全長重組質粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L (左臂)和3A14R(右臂)，得到3A14L PCR產物和3A14R PCR產物， 然后進行融合PCR并回收融合產物；二、用EcoRT22I和Sma I分步雙酶切pBSAs全長重組 質粒和融合產物，回收所需目的片段，連接并構建重組質粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型 口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的構建。本實施方式步驟一中pBSAs全長重組質粒為含有As/CHA/05株FMDV全基因組全 長cDNA的pBluescriptSK質粒，包含了保證所合成的轉錄本具有感染性所要求的Poly(C) 和Poly(A)序列；在全長cDNA的5，末端上游具有T7 RNA聚合酶啟動子，T7啟動子上游和 3’末端具有EcoR V限制性內切酶位點以保正轉錄正確啟始和終止。本實施方式步驟一中3A14L(1518bp)，3A14R(516bp)，融合產物(2038bp)，如圖 1 所示。本實施方式步驟二中所得重組質粒pBSAs_3A14D，經鑒定為陽性的質粒送測序公 司進行測序，以確保缺失了 3A基因的42bp ；經基因組兩端的EcoR V酶切位點切出8200bp 和3000bp條帶，如圖2所示，結果表明，成功構建了重組質粒pBSAs-3A14D。實驗
(一 )、重組病毒rvAs_3A14D的拯救及鑒定a、缺失重組病毒的CPE 重組質粒pBSAS-3A14D線性化的體外轉錄本轉染BHK-21細胞后42h，細胞出現(xiàn)細 胞病變(CPE)，表現(xiàn)為細胞圓縮、呈葡萄串狀分布、細胞崩解成碎片直至脫落；將細胞培養(yǎng) 物連續(xù)傳代，CPE出現(xiàn)的時間縮短，病變更加典型，傳至第3代細胞可在接種病毒后8h出現(xiàn) 明顯的CPE，培養(yǎng)Ilh可使80%細胞CPE，繼續(xù)培養(yǎng)后最終單層脫落形成空斑，而對照細胞單 層完整，形態(tài)規(guī)則；拯救得到的FMDV病毒命名為rvAs-3A14D ；
b、缺失重組病毒的間接免疫熒光檢測將拯救病毒rvAs_3A14D分別感染BHK-21細胞后用Asia 1型FMDV特異性單克 隆抗體進行間接免疫熒光試驗檢測，均可觀察到特異性熒光，而正常BHK-21細胞無熒光產 生，這表明，拯救的缺失病毒為Asia 1 FMDV0C、缺失重組病毒的電鏡觀察純化的缺失拯救病毒與FMDV特異性單克隆抗體作用后形成免疫復合物，經過負 染色，電子顯微鏡下觀察，可見呈球形的病毒粒子，直徑約為25nm ；d、缺失重組病毒的RT-PCR鑒定對拯救病毒rvAs_3A14D進行RT-PCR鑒定，擴增一段含有缺失位點的大小約為 650bp的基因片段，如圖3所示，經測序表明，兩株拯救的病毒分別缺失了目的區(qū)域的30bp 和 42bp。( 二 )、重組病毒的特性研究重組病毒的生長曲線為了比較重組病毒與親本病毒之間的動態(tài)生長特性，制作 病毒生長曲線，結果見圖4，重組病毒與親本病毒具有相似的復制特點和增殖特性。a、病毒 TCID5tl 的測定用Reed-Muench法測定了親本病毒和重組病毒rvAs_3A14D的在BHK-21細胞的 TCID50 ；算得的TCID5tl結果分別為，親本病毒10_7_23，rvAs-3A14D 10_6 88 ；由此可見，病毒缺 失掉14aa抗原表位后對BHK-21細胞的感染性與親本病毒差別不大；b、病毒乳鼠LD5tl的測定接種重組病毒和親本病毒的乳鼠，分別在接種后28h 32h，高濃度接種乳鼠表 現(xiàn)典型的呼吸困難、后肢麻痹等癥狀；42h 48h后開始出現(xiàn)乳鼠死亡，對照鼠正常；最后 根據(jù)統(tǒng)計結果，計算出重組病毒和親本病毒的LD5tl，分別為親本病毒10_6 77 ；rvAs-3A14D 10_6 56 ；在致病力上不存在顯著差異；C、重組病毒的細胞嗜性為了研究病毒缺失3A的部分基因后，在體外是否會改變對其宿主細胞的嗜性和 感染能力，選擇了 BHK-21、PK15和犢牛腎細胞三種動物腎細胞進行感染試驗；結果表明，病 毒缺失3A的91 104位氨基酸后，對犢牛腎細胞的感染能力明顯降低，甚至不能在該細胞 中進行復制，而在倉鼠腎細胞和豬腎細胞中生長良好；這說明，完整的3A基因對本毒株As/ CHA/05能在犢牛腎細胞中正常復制是必需的。(三)、3A14短肽的原核表達及抗原性鑒定1材料與方法1. 1血清和抗體
血清為牛Asia 1型FMDV感染血清；兔抗牛IgG辣根過氧化物酶標二抗購自Sigma 公司。1. 2質粒與菌株表達載體pET_32a、大腸桿菌感受態(tài)細胞Rosetta (DE3) pLysS本實驗室保存。1.3主要試劑Ni2+-NTA離子柱親和層析純化試劑盒購自德國QIAGEN公司；EasySeeWestern blot Kit購自全式金公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID公司；IPTG購自寶生物工程 (大連)有限公司；氨芐青霉素(Amp)、十二烷基磺酸鈉(SDS)為Sigma公司進口分裝；低 熔點瓊脂糖、考馬斯亮藍R250和考馬斯亮藍R250購自哈爾濱萬太生物科技公司；丙烯酰 胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸氨、甘氨酸、 Tris-Cl、Tris-base、購自哈爾濱寶泰克生物科技公司。1.4 14aa短肽相應基因的PCR擴增該14aa短肽位于3A的91 104位氨基酸(基因片段命名為3A14，蛋白命名為 epi3A14)；為了進行表位串聯(lián)表達，故在短肽的下游引入了連接肽(Gly4Ser)3，需要擴增 的整個序列結構為BglII-NEnDKANITTDDK-(Gly4Ser)3-BamH I-Xho I。利用融合 PCR 的 方法擴增這段基因，4條引物如下所示，其中3A14E1和3A14E2為內引物，3A14E3和3A14E4 為外引物；
~ PCR融合分兩步進行，第一步內引物退火延伸，低復性溫度下進行10個循環(huán)；第二 步加入3A14E3和3A14E4 (外引物)，以第一步反應產物為模板在高復性溫度下進行25個循 環(huán)擴增融合片段。1. 5重組表達載體的構建a、3A14基因與表達載體pET_32a的連接反應上述純化后的PCR產物和載體 pET-32a分別用Bgl II和Xho I進行雙酶切，將3A14片段定向克隆至pET_32a中，連接產 物命名為 pET-32a-3A14 ；b、表位串聯(lián)重組表達載體pET-32a-3A14_2和pET_32a-3A14_4的構建將 pET-32a-3A14重組載體用BamH I和Xho I酶切，回收載體片段。由于BamH I與Bgl II是同尾酶，所以具有Bgl II和Xho I粘性末端的3A14酶切產物能夠插入上述載體中，構建成 含有2個3A14E片段的重組載體pET-32a-3A14-2 ；同理，構建了含有4個3A14E片段的重 組載體 pET-32a-3A14-4。1. 6 3A14及其串聯(lián)蛋白的誘導表達及純化 a、在大腸桿菌Rosetta中進行誘導表達將提取的陽性質粒轉化表達宿主菌 E. coli RoSetta(DE3)，之后接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)到菌液的 OD600nm約為0. 4 0. 6時；加入終濃度為1. Ommol/L的IPTG進行誘導表達，測定誘導4h后 的陽性菌和陰性菌的0D_值，準備通過12%分離膠進行SDS-PAGE電泳分析3A14及其串聯(lián) 產物在Rosetta宿主菌中的表達情況；b、誘導菌的SDS-PAGE分析收集誘導4h后的ImL樣品12000r/min離心lmin，棄 上清，菌體沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.4)重懸，重懸用PBS ( μ L)=菌液OD6c 值X 50，加入 等體積的2 X SDS上樣緩沖液，沸水中裂解5min，12000r/min，離心30s后備用，參照分子克 隆指南第三版中SDS-PAGE制膠方法，采取5%積層膠、12%分離膠進行SDS-PAGE分析。C、表達蛋白的純化表達的蛋白以可溶形式表達，在天然條件下對蛋白進行純化， 并參照Ni2+-NTA離子柱親和層析純化試劑盒QIAGEN蛋白純化手冊進行操作。1. 7ffestern blot 檢測以重組3A14及其串聯(lián)蛋白為被檢抗原，原核表達的口蹄疫病毒VP2蛋白做為陽性 參照蛋白，TrxA蛋白作為陰性對照(TrxA為pET_32a的一個大的融合標簽蛋白，有109aa)； 以牛Asia 1型口蹄疫病毒感染血清為一抗；兔抗牛IgG-HRP為二抗，進行Western blot操 作，具體操作如下(1)將純化得到的蛋白經SDS-PAGE后轉印至PVDF膜；(2)封閉以5%的脫脂乳4°C封閉過夜；(3) 一抗作用棄去封閉液，用PBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，然后將其放入 用PBST稀釋好的一抗中(1 1000)，于平緩搖動的37°C搖床上，50r/min，溫育2h ；(4) 二抗作用棄去一抗，用PBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin。將PVDF膜移至 用PBST稀釋好的二抗中(1 10000)，于平緩搖動的37°C搖床上，50r/min，溫育Ih ；(5)顯色棄去二抗溶液，用PBST洗滌NC膜3次，每次lOmin，ECL顯色試劑盒進 行顯色，膠片曝光。2 結果2. 1 3A14短肽及其串聯(lián)片段原核表達載體的構建a、3A14的PCR擴增產物經融合PCR，獲得了含有3A14和連接肽的115bp的PCR產物，如圖5所示。b、pET-32a-3A14表達載體的鑒定用Xho I單酶切，切出6015bp目的條帶(5900bp+115bp)，用目的片段兩端的Bgl II和Xho I雙酶切切出5900bp載體帶和115bp條帶，而連入目的片段后，載體原有的EcoR I酶切位點消失，故用EcoR I應切不開質粒，如圖6所示。c、pET-32a-3A14-2 表達載體的鑒定用引物3A14E3和3A14E4 PCR鑒定重組質粒，目的條帶大小為200bp，如圖7所示。d、pET-32a-3A14-4 表達載體的鑒定
用Bgl II和Xho I雙酶切，切出5900bp載體帶和388bp的條帶，如圖8所示。2. 2 3A14短肽及其串聯(lián)片段在大腸桿菌中的誘導表達經終濃度為lmmol/L IPTG，37°C誘導4h后，SDS-PAGE分析誘導后的與誘導前的菌 相比，在約20kDa的位置出現(xiàn)了預期相符的蛋白條帶，結果表明Asial 口蹄疫病毒3A14的 融合蛋白在Rosetta菌中獲得了表達(約20kDa)，如圖9所示；3A14的2個串聯(lián)和4個串 聯(lián)片段誘導后也得到了表達，而且是可溶性表達，約為27kDa和34kDa，如圖10所示。2.3 3A14短肽及其串聯(lián)片段表達蛋白的Western blot鑒定純化后的蛋白經Western blot鑒定，表達的融合蛋白印i3A14_2和印i3A14_4均與牛Asial型口蹄疫感染血清產生特異性反應，具有良好的抗原性，但印i3A14卻無可見條
市ο結論a、利用融合PCR技術構建了 Asia 1型FMDV 3A基因91 104位氨基酸缺失的感 染性重組質粒pBSAs-3A14D。b、利用反向遺傳操作系統(tǒng)構建了一株缺失掉Asia 1型FMDV 3A基因91 104位 氨基酸的重組病毒(rvAs-3A14D)，該缺失位點模擬了其他血清型FMDV的自然缺失，為研究 Asia 1型FMDV的宿主嗜性提供及其有利的資料。C、本實施方式構建的重組病毒rvAs_3A14D缺失的14aa為3A非結構蛋白中的抗 原表位區(qū)，缺失后可作為標記與親本病毒相鑒別，為進一步研究口蹄疫分子標記疫苗奠定 ■石出。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟一中克隆3A基因 的91 104位氨基酸的左臂(3A14L)，所用的反應體系成分用量以pBSAs全長重組質粒的500倍稀釋為模板3 μ L20 μ M 弓I物 Ll 5' -TCATCAAACTCCTGAGCCGC-3‘1 μ L20 μ M 弓 I 物 L2 5 ‘ - TTCCGCCTCGTCA AGAGT CACCGCATCATTCACCATCT—3 ‘ 1 μ L5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0· 5 μ L用dH20 補至50 μ L注單下劃線部分與3A104L的3'端匹配；雙下劃線部分與3A14R的5'端匹配；條件94°C預變性 3min，94°C 20s，57°C 30s，72°C lmin，共 25 個循環(huán)，72 °C 延伸 7min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟一中克隆3A基因 的91 104位氨基酸的右臂(3A14R)，所用的反應體系成分用量以pBSAs全長重組質粒的500倍稀釋為模板3 μ L20 μ M 弓 I 物 Rl 5' -GATGGTGAATGATGCGGTG ACTCTTGACGAGGCGGAAAA ‘ 1 μ L0094]20iiM 引物 R2 5' -TGACGAGGCACGAGGTAGGC-3
0095]5XPrimeSTAR Buffer
0096]2. 5mM dNTP
0097]PrimeSTAR HS DNA 聚合酶
0098]用dH20補至
1 u L 10 u L 4u L 0. 5u L 50 u L注單下劃線部分與3A104L的3'端匹配；雙下劃線部分與3A14R的5'端匹配；條件94°C預變性 3min，94°C 20s，57°C 30s，72°C lmin，共 25 個循環(huán)，72 °C 延伸 7min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟一中融合PCR分為 兩步進行，第一步融合PCR不加引物，反應體系由下列成分組成成分用量5XPrimeSTAR Buffer10 u L2. 5mM dNTP4 u L3A14L PCR 產物5 ii L3A14R PCR 產物5 ii LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 ii L條件94°0預變性31^11，94115s，50°C 30s，72°C 1. 5min，共 10 個循環(huán)。其它步驟 及參數(shù)與具體實施方式
二相同。第二步融合PCR中加入L1和R2引物(外引物)，反應體系由下列成分組成成分用量lOXExTaqBuffer5 u L2. 5mM dNTP4 u L20iiM 弓丨物 LI1 u L20iiM 引物 R21 u L融合PCR第一步中PCR產物3iiLExTaqDNA 聚合酶0. 5 ii L用dH20 補至50iiL條件94°C預變性 3min，94°C 15s，60°C 30s，72°C 2min，共 25 個循環(huán)，72 °C 延伸 7min，4°C保存。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中酶切的體系如 下成分用量pBSAs全長重組質粒 30. 0 ii LEcoRT22I2. 5 u L10 XH Buffer5 u L無菌水12. 5iiL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中酶切的體系如 下
成分用量pBSAs全長重組質粒EcoRT22I酶切后回收產物30. 0 ii LSma I2. 5 u L 10XT Buffer5 u LBSA5u L無菌水7. 5iiL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中酶切的體系如 下成分用量融合產物30. Oil LEcoRT22I2. 5 u L10 XH Buffer5 u L無菌水12. 5uL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中酶切的體系如 下成分用量融合產物EcoRT22I酶切后回收產物30. 0 ii LSma I2. 5 u L10XT Buffer5 u LBSA5u L無菌水7. 5iiL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中連接體系如 下成分用量10XT4DNA 連接酶緩沖液l.OiiL雙酶切后的融合產物6. 0 ii L雙酶切后的pBSAs全長重組質粒2. 0 ii LT4DNA 連接酶l.OiiL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二相同。
權利要求
Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA，其特征在于Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列為SEQ ID NO1。
2.Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的構建方法，其特 征在于Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的構建方法按以 下步驟進行一、從pBSAs全長重組質粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L和 3A14R，得到3A14L PCR產物和3A14R PCR產物，然后進行融合PCR并回收融合產物；二、用 EcoRT22I和Sma I分步雙酶切pBSAs全長重組質粒和融合產物，回收所需目的片段，連接并 構建重組質粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染 性cDNA的構建。
3.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟一中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L，所用的 反應體系成分用量以pBSAs全長重組質粒的500倍稀釋為模板3 μ L20 μ M 引物 Ll 5' -TCATCAAACTCCTGAGCCGC-3‘ 1 μ L20 μ M 弓I 物 L2 5 ‘ - TTCCGCCTCGTCAAGAGT CACCGCATCATTCACCATCT-3 ‘1 μ L5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20補至50 μ L條件94°C預變性 3min，94°C 20s, 57°C 30s, 72°C lmin，共 25 個循環(huán)，72°C延伸 7min。
4.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟一中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14R，所用的 反應體系成分用量以pBSAs全長重組質粒的500倍稀釋為模板3 μ L20 μ M 弓 I 物 Rl 5 ‘ -GATGGTGAATGATGCGGTG ACTCTTGACGAGGCGGAAAA ‘1 μ L20 μ M 引物 R2 5' -TGACGAGGCACGAGGTAGGC-3‘ 1 μ L 5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20補至50 μ L條件94°C預變性 3min，94°C 20s, 57°C 30s, 72°C lmin，共 25 個循環(huán)，72°C延伸 7min。
5.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟一中融合PCR分為兩步進行，第一步融合PCR，反應體系 由下列成分組成成分用量5XPrimeSTAR Buffer10 μ L。2. 5mM dNTP4 μ L3A14L PCR 產物5 μ L3A14R PCR 產物5 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L條件94°C預變性 3min，94°C 15s，50°C 30s, 72°C 1. 5min，共 10 個循環(huán)；第二步融合PCR，反應體系由下列成分組成成分用量IOXExTaqBuffer5μ L。2. 5mM dNTP4 μ L。20 μ M 引物 Ll1 μ L。20 μ M 引物 R21 μ L融合PCR第一步中PCR產物3yLExTaqDNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20補至50 μ L條件:94°C預變性 3min，94°C 15s, 60°C 30s, 72°C 2min，共 25 個循環(huán)，72°C 延伸 7min， 4°C保存。
6.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟二中酶切的體系如下成分用量pBSAs全長重組質粒30. 0 μ LEcoRT22I2. 5μ LIOXH Buffer5μ L無菌水12. 5 μ L0
7.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟二中酶切的體系如下成分用量pBSAs全長重組質粒EcoRT22I酶切后回收產物30. 0 μ LSma I2. 5 μ LIOXT Buffer5μ LBSA5 μ L無菌水7.5 μ L。
8.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟二中酶切的體系如下成分用量融合產物30. 0 μ LEcoRT22I2. 5μ LIOXH Buffer5μ L無菌水12.5yL。
9.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟二中酶切的體系如下成分用量融合產物EcoRT22I酶切后回收產物30. 0 ii LSma I2. 5u L10XT Buffer5 u LBSA5u L無菌水7.5uL。
10.根據(jù)權利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的構建方法，其特征在于步驟二中連接體系如下成分用量10 X T4 DNA連接酶緩沖液1. 0 u L雙酶切后的融合產物6.oyL雙酶切后的pBSAs全長重組質粒2. 0 u LT4 DNA 連接酶l.OuL。
全文摘要
Asia 1型口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其構建方法，它涉及口蹄疫病毒3A非結構蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其構建方法。它解決了現(xiàn)有滅活疫苗純化過程中很難監(jiān)測，所以殘留的非結構蛋白會干擾對自然感染動物的診斷，診斷的準確性低的問題。序列見SEQ ID NO1。方法1.從pBSAs全長重組質粒中克隆3A14L和3A14R，得到3A14L PCR產物和3A14R PCR產物，然后融合PCR回收融合產物；2.雙酶切pBSAs全長重組質粒和融合產物，再連接并構建重組質粒pBSAs-3A14D即完成。本發(fā)明中缺失3A非結構蛋白的一部分，不會殘留此部分的非結構蛋白，診斷的準確性高。
文檔編號C12N15/66GK101870980SQ20101017529
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2010年5月18日
發(fā)明者李爽, 王君偉, 馬波, 高明春 申請人:東北農業(yè)大學