專利名稱：嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的羧基端區(qū)域的表達純化及非結(jié)構(gòu) ...的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及對嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2進行基因工程改造以獲得在大腸桿菌中的高效表達、純化和結(jié)晶的方法，以及嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2第113位到第638位氨基酸的三維晶體結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
2002年底至2003年初，全球大規(guī)模爆發(fā)的SARS疫情引起了全人類的恐慌，極大挑戰(zhàn)了我國和全世界應對重大疫情的能力，更引起了各國政府和科學家們對冠狀病毒的極大重視。目前，盡管SARS疫情大規(guī)模爆發(fā)已經(jīng)被控制住，2003年之后仍出現(xiàn)過小規(guī)模發(fā)作。雖然這些小規(guī)模的疫情很早被監(jiān)視和控制在搖籃中，而沒有形成再次大規(guī)模的爆發(fā)，但SARS疫情再次大規(guī)模爆發(fā)的可能性仍然存在。最近研究顯示某些蝙蝠很有可能是SARS冠狀病毒的天然宿主，而且SARS冠狀病毒在適應性和生態(tài)壓力的雙重驅(qū)動下，會不斷通過基因重排、重組和突變在其天然宿主中藏匿并伺機爆發(fā)，甚至會傳播到新宿主身上，這說明冠狀病毒對人類健康仍然是一個潛在威脅。因此，針對SARS冠狀病毒的侵染、基因組復制和轉(zhuǎn)錄機制、與宿主相互作用關系、抑制劑藥物開發(fā)以及疫苗的研發(fā)各方面的研究正在逐步深入地進行，以應對SARS疫情的再次爆發(fā)。解析SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的三維結(jié)構(gòu)不僅對揭示其復制機制具有重要的科學意義，對開發(fā)抗SARS冠狀病毒藥物具有重要價值和理論指導意義。SARS冠狀病毒為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其基因組長度大約為30kb。SARS冠狀病毒復制酶基因由兩個大的開放閱讀框ORFla和ORFlb組成，它們均位于基因組的5’端。ORFla編碼一條長約441kDa的復制酶多蛋白ppla，ORFla和ORFlb共同編碼一條長約741kDa的復制酶多蛋白pplab。pplab C端的ORFlb編碼的復制酶部分在翻譯時需要-1位的核糖體移位。這兩個復制酶多蛋白被病毒編碼的兩個蛋白酶(一個木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶PLP2(nsp3)以及一個3C主蛋白酶(nsp5)共同切割成16個獨立的功能亞基，這16個獨立的功能亞基被稱為非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structrual protein, Nsp),在復制轉(zhuǎn)錄過程中形成復合物來共同行使功能。非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2是復制轉(zhuǎn)錄復合物的一個組成成分，已有的研究顯示，nsp2似乎可以和包括nsp6, nsp7, nsp8, nspll, nspl5, nspl6在內(nèi)的多種非結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，并存在一定的細胞內(nèi)共定位，推測nsp2可能間接參與到病毒的轉(zhuǎn)錄與復制過程之中。也有研究表明，SARS冠狀病毒nsp2可與宿主兩個重要蛋白prohibitin I (PHBl)and prohibitin2(PHB2)及其形成的復合物相互作用，可能參與干擾宿主信號傳遞，降低宿主的免疫反應，從而利于SARS-CoV更好地復制和增殖，這些需要進一步的實驗來確定。
而由于國內(nèi)對嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒實驗的嚴格限制和相關實驗模型的缺乏，使得針對SARS冠狀病毒活毒的實驗無法進行。只能退而求其次，在細胞水平或者宿主動物模型上去研究與SARS冠狀病毒屬于同一種屬的小鼠肝炎病毒MHV(mousehepatitis virus),或者SARS冠狀病毒的假病毒或者復制子,但這些是不能替代SARS冠狀病毒活毒的。對SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析對揭示蛋白質(zhì)功能具有重大而直接的指導意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面，提供了一種將SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2進行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達的方法。本發(fā)明優(yōu)選使用大腸桿菌的原核細胞表達系統(tǒng)(但不排除其他的表達系統(tǒng)，如在其他細菌或者其他的真核生物細胞中進行表達)，對以上所述蛋白以GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白的方式進行表達，并用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。本發(fā)明述及在大腸桿菌中高效獲得SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的表達方法。優(yōu)選地，本發(fā)明將SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2進行了基因工程改造，將非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2全長基因進行了截短的研究，提供了一個可以在大腸桿菌中高效表達的方法，該方法包括了氨基端第110位氨基酸至C末端的編碼基因，更優(yōu)選地包括113位至638位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的方法。將基因工程方法改造過以后的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2基因連接于帶有標簽的表達性質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌細胞中進行表達、純化。優(yōu)選地，其中所述的標簽選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag ;所述載體含有選擇性標記基因。所述與特異標簽識別的方法是通過親和層析柱進行，所述去掉標簽的方法通過用蛋白酶酶解，所述分離純化蛋白的方法是進一步用離子交換層析等方法分離純化非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2 ;用凝膠電泳的方法確定蛋白質(zhì)的純度；用分析型超速離心的方法確定蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)和均一性。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)晶上述得到的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白的方法，所述的方法包括:將非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2濃縮至5-10mg/ml，在4-18攝氏度下用懸滴氣相擴散法篩選晶體生長條件。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了衍射性能良好的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的蛋白質(zhì)晶體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了 SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的三維晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)描述了非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的二級結(jié)構(gòu)組成、肽鏈走向、組織模式以及三維分子構(gòu)造。其中針對非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2晶體進行X射線晶體衍射，得到非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2晶體的晶體衍射數(shù)據(jù)，用所述的蛋白質(zhì)晶體的衍射數(shù)據(jù)進一步通過結(jié)構(gòu)解析，構(gòu)建非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的三維結(jié)構(gòu)。其中所述非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2為所述非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2全長蛋白序列的從第113位氨基酸至638位氨基酸的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標，或者SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表I中的坐標的平均根方差小于或等于1.5埃。優(yōu)選地，其中所述的母體晶體具有P6(5)空間群，晶胞參數(shù)為約:a = 112.8埃，b=112.8 埃，c = 91.1 埃，α = β = 90° , Y = 120。。優(yōu)選地，其中所述非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2由α螺旋1，即含Met6_Vall2的氨基酸區(qū)段，α螺旋2，即含Prol8-Glu20的氨基酸區(qū)段，β折疊1，即含Leu26_Cys32的氨基酸區(qū)段，β折疊2,即含Asp36-Cys43的氨基酸區(qū)段，β折疊3,即含Ala48_Cys50的氨基酸區(qū)段，β折疊4，即含Gly54-Asn57的氨基酸區(qū)段，β折疊5，即含Val75_Pro78的氨基酸區(qū)段，α螺旋3，即含Pro80-Gln83的氨基酸區(qū)段，α螺旋4，即含Val93_Tyr96的氨基酸區(qū)段，β折疊6，即含Argll3-Phell5的氨基酸區(qū)段，β折疊7,即含Cysll8_Cysl25的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即含Argl29-Alal36的氨基酸區(qū)段，α螺旋5，即含Glu 153_Aspl58的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即含Asnl69_Ilel72的氨基酸區(qū)段，α螺旋6，即含Glul80_Phel89的氨基酸區(qū)段，α螺旋7，即含Thrl93-1le200的氨基酸區(qū)段，α螺旋8，即含Tyr205-Cys215的氨基酸區(qū)段，β折疊10，即含Lys219-Thr221的氨基酸區(qū)段，β折疊11，即含Trp230_Ile232的氨基酸區(qū)段，α螺旋9，即含Gln248-Ala258的氨基酸區(qū)段，α螺旋10，即含Ile268_Ile282的氨基酸區(qū)段，α螺旋11，即含Gln285-Thr296的氨基酸區(qū)段，α螺旋12，即含Val304_Thr311的氨基酸區(qū)段，α螺旋13，即含Val315_Leu325的氨基酸區(qū)段，α螺旋14，即含Arg334-Ala346的氨基酸區(qū)段，α螺旋15，即含Val348_Thr363的氨基酸區(qū)段，β折疊12，即含Phe366-Val369的氨基酸區(qū)段，β折疊13，即含Gln372_Val375的氨基酸區(qū)段，α螺旋16，即含Asp382-Met397的氨基酸區(qū)段，α螺旋17，即含Pro441_Ala444的氨基酸區(qū)段。其中，由所述的β折疊I與2，3與4各自相互反平行，然后一起組成一個類似于β折疊桶的形狀；β折疊5，8，7，6組成一個反平 行β片層的扭曲的平面；β折疊9，10，11，組成一個平行的β片層；β折疊12，13組成一個反平行β片層。所述的非結(jié)構(gòu)蛋2的中間區(qū)域富含α螺旋，三個為一組，交錯盤旋，C末端則多為無規(guī)卷曲。優(yōu)選地，其中所述非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2中結(jié)合有兩個選自鋅、鎂、錳、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，其中兩個金屬離子分別位于由Cys32-Cys35-Cys50_Cys53、Cys79-CyS82-HiS91-CyS125構(gòu)成的四元錨定中心。更優(yōu)選地，其中所述金屬離子為鋅離子。優(yōu)選地，其中所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)域，分別可以代表為CX2CX14CX2C、CX2CX8HX3C。更優(yōu)選地，SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2所含有的第一個鋅指結(jié)構(gòu)域類似于轉(zhuǎn)錄因子的鋅指，第二個鋅指則是全新的折疊類型。兩個鋅指對于SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2功能的發(fā)揮具有決定性的作用。優(yōu)選地，其中所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)整體為全新的折疊類型，鋅指結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)為其功能的發(fā)掘與闡釋提供了理論指導依據(jù)，也為設計和篩選可能的抑制劑奠定了理論基礎。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了上述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體三維結(jié)構(gòu)在其功能研究、設計和篩選可能的抑制劑方面的應用，包括:根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來尋找可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋；根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過找到的可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋，找尋可能的底物類型，進行生化實驗，并將可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋中的氨基酸突變，驗證突變的效果；將根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合上述實驗結(jié)果，進行體內(nèi)天然底物類型的發(fā)掘，并將之擴展到與所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2序列相似性在至少30%的其他病毒種屬，進而分析和總結(jié)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了基于SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，探索其功能的方法，包括:通過蛋白結(jié)晶方法獲得SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體，或者獲得SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)坐標，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任何與該坐標中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標的平均根方差小于等于1.5埃的結(jié)構(gòu)；進行生化實驗分析驗證基于結(jié)構(gòu)的預測理論。


圖1為基于來自四種不同病毒類型的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的序列對比。其中，包括來源于四種不同冠狀病毒代表毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2，即人冠狀病毒HCoV-229E、SARS冠狀病毒 SARS-CoV-BJOl、小鼠肝炎病毒MHV-A59 (Mouse Heptitis Virus)和鳥支氣管炎病毒 IBV-M41 (Avian Infectious Bronchitis Virus)。其非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp2的編碼序列分別為:HCoV-229E來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession:NP_073550.1，SARS-CoV-BJOI來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession:NP_828850.1，MHV-A59來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession:NP _045298.1，IBV-M41來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession:NP—040829.1。這一比對結(jié)果表明，來源于冠狀病毒屬三個種群的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的一級序列保守性不高，SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2與同屬同一種群的MHV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2才具有相對較高的一級序列相似性。圖中用...表示在相對應區(qū)段的氨基酸缺失，紅色和黃色表示保守型高低。在說明書及權(quán)利要求書中具體的氨基酸位置均是以SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的序列說明的。圖2為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的純化和電泳圖。⑷為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2經(jīng)過陰離子交換層析的情況。(B)為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2經(jīng)過陰離子交換層析后的蛋白質(zhì)電泳圖，顯示目的蛋白(58kD處)的純度在90%以上。圖3為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的母體蛋白質(zhì)晶體圖。(A)為進行優(yōu)化之前的晶體圖片。(B)為進行優(yōu)化之后的晶體圖片。圖4為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的母體蛋白質(zhì)晶體衍射圖。其中左下角的小圖為分辨率最外殼層的衍射點。圖5為SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的三維結(jié)構(gòu)圖。其中，該結(jié)構(gòu)按照兩個不同鋅指以及不同的結(jié)構(gòu)域而使用了不同的色彩，其中，鋅原子用橙色球狀模型表示，依次標記為ZN1，ZN2。鋅指I區(qū)域用紅色表示，鋅指2區(qū)域用藍色，螺旋富集區(qū)用彩色表示，C端無規(guī)卷曲區(qū)用紅色表示，連接不同結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域用灰色表示。
具體實施例方式本發(fā)明人提供了一種將SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2進行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達蛋白的方法。通過X射線衍射晶體學方法解析了 SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的分辨率達2.7埃的三維晶體結(jié)構(gòu)。
SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白的表達純化方法:來源于SARS冠狀病毒cDNA的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的基因，其編碼的蛋白質(zhì)序列為:SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白質(zhì)序列MAVTRYVDNNFCGPDGYPLDCIKDFLARAGKSMCTLSEQLDYIESKRGVYCCRDHEHEIAWFTERSDKSYEHQTPFEIKSAKKFDTFKGECPKFVFPLNSKVKVIQPRVEKKKTEGFMGRIRSVYPVASPQECNNMHLSTLMKCNHCDEVSWQTCDFLKATCEHCGTENLVIEGPTTCGYLPTNAVVKMPCPACQDPEIGPEHSVADYHNHSNIETRLRKGGRTRCFGGCVFAYVGCYNKRAYWVPRASADIGSGHTGITCDNVETLNEDLLEILSRERVNINIVGDFHLNEEVAIILASFSASTSAFIDTIKSLDYKSFKTIVESCGNYKVTKGKPVKGAWNIGQQRSVLTPLCGFPSQAAGVIRSIFARTLDAANHSIPDLQRAAVTILDGISEQSLRLVDAMVYTSDLLTNSVIIMAYVTGGLVQQTSQWLSNLLGTTVEKLRPIFEWIEAKLSAGVEFLKDAWEILKFLITGVFDIVKGQIQVASDNIKDCVKCFIDVVNKALEMCIDQVTIAGAKLRSLNLGEVFIAQSKGLYRQCIRGKEQLQLLMPLKAPKEVTFLE⑶SHDTVLTSEEVVLKNGELEALETPVDSFTNGAIVGTPVCVNGLMLLEIKDKEQYCALSPGLLATNNVFRLKGG即
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權(quán)利要求
1.一種嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2為所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2全長蛋白序列的從第I位氨基酸至約280位氨基酸的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標，或者β -內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表I中的坐標的平均根方差小于或等于1.5埃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2為所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2全長蛋白序列的從113位氨基酸至638位氨基酸的編碼基因，這里重新編號為1-526，以下所用編號均依據(jù)于此。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述的母體晶體具有P6 (5)空間群，晶胞參數(shù)為約:a = 112.8埃，b = 112.8埃，c = 91.1埃，α =β = 90°，Y = 120。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2所述非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2由α螺旋1，即含Met6_Vall2的氨基酸區(qū)段，α螺旋2，即含Prol8-Glu20的氨基酸區(qū)段，β折疊1，即含Leu26-Cys32的氨基酸區(qū)段，β折疊2,即含Asp36-Cys43的氨基酸區(qū)段，β折疊3,即含Ala48_Cys50的氨基酸區(qū)段，β折疊4，即含Gly54-Asn57的氨基酸區(qū)段，β折疊5，即含Val75_Pro78的氨基酸區(qū)段，α螺旋3，即含Pro80-Gln83的氨基酸區(qū)段，α螺旋4，即含Val93_Tyr96的氨基酸區(qū)段，β折疊6,即含Argll3-Phell5的氨基酸區(qū)段，β折疊7,即含Cysll8_Cysl25的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即含Argl29-Alal36的氨基酸區(qū)段，α螺旋5，即含Glu 153_Aspl58的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即含Asnl69-1lel72的氨基酸區(qū)段，α螺旋6，即含Glul80_Phel89的氨基酸區(qū)段，α螺旋7，即含Thrl93-1le200的氨基酸區(qū)段，α螺旋8，即含Tyr205-Cys215的氨基酸區(qū)段，β折疊10，即含Lys219-Thr221的氨基酸區(qū)段，β折疊11，即含Trp230-1le232的氨基酸區(qū)段，α螺旋9，即含Gln248_Ala258的氨基酸區(qū)段，α螺旋10，即含Ile268-1le282的氨基酸區(qū)段，α螺旋11，即含Gln285_Thr296的氨基酸區(qū)段，α螺旋12，即含Val304-Thr311的氨基酸區(qū)段，α螺旋13，即含Val315_Leu325的氨基酸區(qū)段，α螺旋14，即含Arg334-Ala346的氨基酸區(qū)段，α螺旋15，即含Val348_Thr363的氨基酸區(qū)段，β折疊12，即含Phe366-Val369的氨基酸區(qū)段，β折疊13，即含Gln372_Val375的氨基酸區(qū)段，α螺旋16，即含Asp382_Met397的氨基酸區(qū)段，α螺旋17，即含Pro441_Ala444的氨基酸區(qū)段。其中，由所述的β折疊I與2，3與4各自相互反平行，然后一起組成一個類似于β折疊桶的形狀；β折疊5，8，7，6組成一個反平行β片層的扭曲的平面；β折疊9，10，11，組成一個平行的β片層；β折疊12，13組成一個反平行β片層。所述的非結(jié)構(gòu)蛋2的中間區(qū)域富含α螺旋，三個為一組，交錯盤旋，C末端則多為無規(guī)卷曲。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2中結(jié)合有三個選自鋅、鎂、錳、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，其中兩個金屬離子分別位于由Cys32-Cys35-Cys50_Cys53、Cys79-CyS82-HiS91-CyS125構(gòu)成的四元錨定中心。更優(yōu)選地，其中所述金屬離子為鋅離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述金屬離子為鋅離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述金屬SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)域，分別可以代表為CX2CX14CX2C、CX2CX8HX3C。更優(yōu)選地，SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2所含有的第一個鋅指結(jié)構(gòu)域類似于轉(zhuǎn)錄因子的鋅指，第二個鋅指則是全新的折疊類型。兩個鋅指對于SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2功能的發(fā)揮具有決定性的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2整體為全新的折疊類型，鋅指結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)為其功能的發(fā)掘與闡釋提供了理論指導依據(jù)，也為設計和篩選可能的抑制劑奠定了理論基礎。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體三維結(jié)構(gòu)在其功能研究、設計和篩選可能的抑制劑方面的應用，包括: 根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來尋找可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋； 根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過找到的可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋，找尋可能的底物類型，進行生化實驗，并將可能的特定的活性位點或者結(jié)合口袋中的氨基酸突變，驗證突變的效果； 將根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合上述實驗結(jié)果，進行體內(nèi)天然底物類型的發(fā)掘，并將之擴展到與所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2序列相似性在至少30%的其他病毒種屬，進而分析和總結(jié)。
10.一種純化SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的方法，其中，將權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2基因連接于帶有標簽的表達性質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌細胞中進行表達、純化 。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中所述的標簽選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特異性抗體,所述載體含有選擇性標記基因。
12.—種結(jié)晶前述權(quán)利要求中任一項所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白的方法，所述的方法包括:將SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2濃縮至5-10mg/ml，在4_30攝氏度下用氣相擴散法篩選晶體生長條件。
13.一種衍射性能良好的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2蛋白質(zhì)晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種嚴重急性呼吸道綜合征SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的羧基端區(qū)域的晶體三維結(jié)構(gòu)，其中SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的氨基端區(qū)域為所述SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的從約110～約150位氨基酸至在約600至638位范圍內(nèi)的氨基酸，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐標，或者SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的氨基端的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40％氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標與表1中的坐標的平均根方差小于或等于1.5埃。本發(fā)明還提供對SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的表達、純化和結(jié)晶的方法；以及SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的晶體結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)在功能研究、潛在藥物篩選及藥物設計方面的理論指導意義和應用。
文檔編號C07K14/165GK103172712SQ201110429198
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者饒子和, 李元元, 楊誠, 劉祥, 王權(quán), 董輝, 李慧娟, 王中玲, 陳衛(wèi)強 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院