專利名稱：一種受抗生素誘導的化學誘導性啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種新的化學誘導性啟動子，包括擬南芥啟 動子序列的克隆、植物轉(zhuǎn)基因載體的構建、該啟動子在不同組織中的活性分析、該啟動子對 抗生素絲裂霉素和博萊霉素誘導響應的時效性分析以及所用抗生素對植物的生長影響分 析。
背景技術：
啟動子是指RNA聚合酶識別、結合并起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因 上游。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是依賴于DNA的RNA聚合 酶的識別和結合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處。習慣上，將植物基因的 啟動子按其基因的表達方式分為組成型啟動子(constitutive promoter)、誘導型啟動子 (inducible promoter)和組織特異性啟動子(tissue-specific promoter) 但在某些情 況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性。組成型啟動子是指啟動子所驅(qū)動的基因在不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達 沒有明顯差異，在所有組織中都能夠啟動基因的表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性。例 如花椰菜菜葉病毒CaMV35S啟動子(Odell等，1985)。組織特異性啟動子，是指啟動子所驅(qū)動的基因只在某些特定的器官和組織中表 達，并往往表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，例如花特異性啟動子(Vantimen等，1988)、葉片特異性啟 動子(Taylor等，2001)。對這些啟動子的研究，不僅有助于闡明基因在植物形態(tài)、發(fā)育、代 謝途徑等中的作用，而且可以借助這些啟動子，驅(qū)動目的基因在特定的位點進行表達，從而 達到生產(chǎn)實踐或科研上所設定的特定目的。誘導型啟動子，是指在某些特定條件例如物理、化學、生物信號(統(tǒng)稱為“誘導因 子”)存在時，啟動子可以驅(qū)動下游的基因增強表達，轉(zhuǎn)錄水平大大提高。其特征為，沒有誘 導因子存在時，該類型啟動子控制的基因不表達或者只有非常低的表達(也稱為“本底表 達”)，但一旦受到誘導因子的誘導，基因表達量迅速大幅度增加。誘導型啟動子在基礎科研 和生產(chǎn)實踐中均具有重要應用價值。它可以用于研究基因的定時定量表達對于植物表型的 影響，從而研究基因的體內(nèi)功能；也可用于生產(chǎn)實踐上，使某些外源的轉(zhuǎn)基因在需要的時候 高表達，不需要時不表達或低表達，從而達到生產(chǎn)上的某種特定目的。目前，根據(jù)植物所感受到的信號刺激種類，誘導型啟動子主要可劃分為物理因素 (如溫、光、旱等)、化學因素(離子、有機物、激素等)和生物因素(病菌、組織器官、發(fā)育階 段等)誘導表達的啟動子。該類啟動子常以誘導信號命名，例如光誘導表達基因啟動子、熱 誘導表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子、激素誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達 基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等(吳雪峰等，2004)?；瘜W誘導啟動子，往往 由于誘導物是外源的，生物體內(nèi)或環(huán)境中不存在誘導因素，相比較于生物因素或溫度等環(huán) 境因素誘導的啟動子，特異性更強，更易控制基因的開關，故而在生產(chǎn)或科研上應用更為廣 泛。
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啟動子的活性分析常用到⑶S(β -glucuronidase，編碼β -葡萄糖醛酸糖苷酶) 作為報告基因，它可以作為外源基因插入到啟動子的下游，根據(jù)組織化學染色分析就可以 直觀地得到基因在植物的不同部位的表達時空信息。在本發(fā)明申請中，同樣采用GUS基因 來報告啟動子的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種受抗生素誘導的化學誘導性啟動子，它同時也是一種組 織特異性啟動子。本發(fā)明提供的啟動子，是從擬南芥的PARPl基因的上游克隆到的一段順序。其核 苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，記為PARPl啟動子。PARPl蛋白負責植物蛋白質(zhì)的多聚ADP 核糖化修飾，在植物的DNA修復中起重要作用。PARPl基因本身可以受到絲裂霉素和博萊霉 素的強烈誘導。本發(fā)明提供的PARPl啟動子是一種受絲裂霉素和博萊霉素高度誘導的化學誘導 性啟動子，除了絲裂霉素和博萊霉素外，它幾乎不受到其它內(nèi)源或外源因素的誘導，故而誘 導特異性特別強。這種類型的誘導性啟動子，對于構建植物轉(zhuǎn)基因載體，用于科研或者生產(chǎn) 實踐均具有重要意義。本發(fā)明提供的組織特異性啟動子，在苗期基根、開花期植物早期花藥以及花絲中 具有活性。將該啟動子克隆于報告基因載體中，通過轉(zhuǎn)基因技術發(fā)現(xiàn)它所驅(qū)動的GUS報告基 因僅在3-5天幼苗的基根部位短暫表達；而在成熟植物中，僅在第八期前的花藥以及花絲 頂部靠近花藥處有表達。因此，PARPl啟動子可以驅(qū)動外源基因在這些組織中特異表達，從 而達到定向地轉(zhuǎn)基因的目的。將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達可以提高外源基因在特 定部位的表達水平，增加轉(zhuǎn)基因的目的性。重要的，本發(fā)明提供的啟動子是一種受抗生素絲裂霉素和博萊霉素誘導的化學誘 導性啟動子。本發(fā)明提供的啟動子特征是未誘導之前，基因表達量很低，當用22μ g/ml絲裂霉 素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導30h后，即可使其大量表達，在不同的組織中提高的倍數(shù)有 所不同，本實驗用定量PCR手段檢測了 GUS報告基因在花(誘導強度強)和蓮座葉(誘導 強度弱)中誘導前后表達量變化，發(fā)現(xiàn)在花里誘導表達量高達32倍，而在蓮座葉中提高了 7 倍。本實驗還利用擬南芥的苗嘗試了單獨用絲裂霉素和博萊霉素處理的誘導效果，發(fā)現(xiàn)當 用1. 0 μ g/ml的博萊霉素誘導50h的效果與用22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素 誘導30h的效果相當。與博萊霉素相比，絲裂霉素誘導效果較弱，故而單獨用低濃度的博萊 霉素誘導50小時就可以使外源目的基因在苗中高強度表達。本發(fā)明還檢測了 1. 0μ g/ml的博萊霉素對植物生長的影響，將擬南芥的苗生長在 含有1. 0 μ g/ml的博萊霉素的培養(yǎng)基上，結果發(fā)現(xiàn)這個濃度對植物苗的生長沒有明顯不利 影響。這些結果說明，該啟動子可以成為一個安全、有效、使用方便的誘導型啟動子，可以 用于轉(zhuǎn)基因載體的構建從而實現(xiàn)對基因表達的人工調(diào)控，使目的基因定時、定量、定位地表 達。本發(fā)明還提供利用PARPl啟動子構建植物轉(zhuǎn)基因載體的方法。具體步驟如下
將擬南芥PARPl啟動子通過酶切位點可以連接到任何轉(zhuǎn)基因載體的外源基因起 始密碼的上游，以驅(qū)動下游基因的表達。本申請以轉(zhuǎn)基因載體PAKK687為例，將克隆到的 PARPl啟動子通過EcoR I/Sma I雙酶位點插入到pAKK687的載體⑶S報告基因的上游，構 成了以GUS為報告基因的植物轉(zhuǎn)基因載體。通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，成功獲 得轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS組織化學染色可以檢測該啟動子在不同組織以及外界因素刺激下 的活性。外源基因可以替代GUS報告基因插入在PARPl啟動子的下游。本發(fā)明還提供抗生素誘導PARPl啟動子的方法、抗生素施用濃度以及表達水平的 檢測方法。具體方法在苗期或者開花期噴灑抗生素溶液直至滴流為止，可以用22μ g/ml絲 裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素來誘導，時間為30小時，但此濃度可能對植物生長造成影 響。如果用低至1. O μ g/ml的博萊霉素來誘導，時間為50小時，也可以達到幾乎同樣的誘 導效果，而且在該濃度下，抗生素對植物生長沒有不利影響(圖7中植物在含1. 0 μ g/ml的 博萊霉素的培養(yǎng)基上生長一周，植物的生長未受到明顯脅迫)。噴灑后可以根據(jù)插入的外源基因設計基因特異性引物，抽提總RNA，用定量PCR來 檢測誘導前后基因的表達水平變化。


圖IPARPl啟動子片段的擴增。箭頭所示為克隆到的啟動子片斷。圖2重組質(zhì)粒示意圖，將PARPl啟動子通過酶切位點插入至⑶S報告基因的上游。圖3PARP1啟動子的組織特異性活性分析。PARPl啟動子所驅(qū)動的GUS報告基因僅在3_5天幼苗的基根部位短暫表達；而在 成熟植物中，僅在第八期前的花藥以及花絲靠近花藥處有表達。A 生長3-5天幼苗；B 開 花植物的蓮座葉；C 莖生葉；D 花穗；E 早期(第八期前)的花；F 開放的花；G 莖；H 幼 嫩果莢(胚胎子葉期前)；I 成熟果莢(子葉期后)。圖4PARP1啟動子在不同組織中博萊霉素誘導前后表達變化。0h/30h表示用 22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導0h/30h，圖示花穗、苗和發(fā)育中的果莢誘導 前后⑶S報告基因的水平變化。誘導前⑶S在這些組織中表達水平很低或者沒有表達，誘 導后在整個花穗中，苗期的整個植物以及整個果莢中均有強烈表達，顯示強烈的藍色信號。圖5生長一周的幼苗用1. 0 μ g/ml的博萊霉素誘導。A.對照；B. 0. 5 μ g/ml博萊 霉素誘導5小時；C. 0. 5 μ g/ml博萊霉素誘導50小時；D. 1. 0 μ g/ml博萊霉素誘導5小時； Ε.Ι.Ομ g/ml博萊霉素誘導50小時；F. 35S啟動子在苗期的活性。圖6利用定量PCR分析誘導前后PARPl啟動子的活性變化。在花里誘導表達量高 達32倍(較強)，而在蓮座葉中表達量約為7倍(較弱)。圖7在含有1. 0 μ g/ml博萊霉素的V2MS培養(yǎng)基生長一周的幼苗。1. 0 μ g/ml博 萊霉素未對植物造成明顯傷害，在該濃度的培養(yǎng)基上生長一周的苗除了根稍許彎曲，子葉 大小及根長與對照接近。圖8PARP1啟動子受其它外界環(huán)境因素影響的情況。從圖中可以看出在苗中除了 絲裂霉素和博萊霉素，PARPl幾乎不受其它外界環(huán)境因素的誘導。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列是實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，例如Sambrook等分子克隆實驗手冊中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。實施例IPARPl基因啟動子片段的克隆1.DNA的提取取擬南芥生態(tài)型Col-O植株的葉片，液氮研磨，加0.4ml 2% CTAB (2% CTAB, IOOmM Tris-Cl pH8. 0,20mM EDTApH8. 0,1. 4M NaCl，臨用前加巰基乙醇至 0. 2% )，混勻；65°C水浴30min ；加入0. 4ml氯仿，混勻；4000rpm，離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新 的離心管；加入400 μ 1異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ； 12000rpm，離心IOmin ；棄上清，70% 乙醇洗滌；37°C烘箱干燥，加20 μ 1水溶解。用0. 8%瓊脂糖凝膠檢測DNA的質(zhì)量。2. PARPl基因啟動子片段的擴增根據(jù)PARPl基因5’上游序列設計兩對引物， 一對不含酶切位點的引物，上游引物5’-ATT TTG AGG CGG TGG AGT TTC-3’ ；下游引物 5，-CGT CGA CTT TGA GCT TGT TCG-3，。一對含有酶切位點，上游引物5，_GAA TTC TTTTGA GGC GGT GGA GTT TC-3，；下游引物5，_CCC GGG TTT CGT CTT CTT CTT CAGGAG MT AG-3，。 見SEQ ID NO. 2。首先用不含酶切位點的一對引物進行擴增，利用LATaq酶，按以下條件 940C 2min ；94°C 30s, 53°C /51°C /49°C /47°C /45°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 個循環(huán)。回收 大于2kb的條帶，作為模板。再用帶有酶切位點的一對引物進行二次PCR，利用高保真pfu 酶，按以下條件94°C 2min ；94°C 30s, 50°C /49°C /48°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 個循環(huán)，擴 增出一條單一的2179bp的片段(見圖1)。實施例2PARP1啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因載體的構建將PCR產(chǎn)物電泳回收后，用T4 DNA連接酶連接至中間載體PCR Blunt中，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 α，挑選克隆，搖菌并抽提質(zhì)粒。電泳鑒定后選取有插入的克隆進行酶切鑒定，然 后測序，測序正確的克隆可以利用限制性內(nèi)切酶切下目的片段，插入到最終轉(zhuǎn)基因載體中 (本發(fā)明申請中為ΡΑΚΚ687)(見圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。得到的克隆經(jīng)酶切鑒定正確后進行 質(zhì)粒擴增，以備轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。實施例3PARP1啟動子在不同組織中的活性分析按常規(guī)轉(zhuǎn)化方法將上述表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，抗性篩選后進行PCR鑒定。 鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取Ttl代種子進行Basta抗性篩選。取 T1代種子分離比為3 1的小苗進行GUS組織化學染色，觀察GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥各 個植物器官的表達情況，拍照。GUS染色發(fā)現(xiàn)，啟動子在3-5天苗期基根處以及早期花藥中 (第八期前)具有短暫活性，但在雄蕊花絲頂部中一直表現(xiàn)出活性(見圖3)，在其它組織中 未觀察到明顯活性。實施例4PARP1啟動子在不同抗生素濃度誘導下的活性分析取轉(zhuǎn)基因陽性植株的不同組織，置于含22μ g/ml絲裂霉素+1. 5μ g/ml博萊霉素 的離心管中分別處理5h、30h。⑶S染色分析發(fā)現(xiàn)抗生素強烈誘導了⑶S報告基因的表達。 在花穗中，誘導前除了花絲頂部，整個花穗中GUS表達水平都很低，誘導后在花柄、整個花 絲、莖及雌蕊中GUS都被強烈誘導，但在花藥中誘導程度相對較弱；在培養(yǎng)基上生長了 7天 的幼苗，在抗生素誘導之前未檢測到GUS信號，誘導5h后信號開始出現(xiàn)，誘導30h之后，整個根、葉脈、莖尖等位置均有藍色出現(xiàn)，信號強烈(圖4僅顯示30h的情況)，誘導所達到的 強度可與目前廣泛使用的高表達啟動子花椰菜病毒35S啟動子幾乎接近(圖6)。未誘導之 前在幼嫩果莢中未檢測到GUS信號，誘導5h后首先在果莢兩端出現(xiàn)藍色信號，誘導了 30h 后，藍色信號遍布整個果莢(圖4)。其它組織如莖、莖生葉、蓮座葉在誘導了 30h之后，在莖 的切口處、蓮座葉、莖生葉的葉脈都能檢測到藍色信號，但信號不如苗中強(未顯示)，所以 本啟動子更適合于在苗期的整個植物中或者開花植物的花中誘導外源基因產(chǎn)物的高表達。實施例5PARP1啟動子在抗生素誘導下的活性定量分析本實驗用定量PCR手段檢測了用22μ g/ml絲裂霉素+1. 5μ g/ml的博萊霉素誘 導30h前后花和蓮座葉中⑶S的表達量變化，引物序列如下F-primer :5’ -AGT GGC AGT GAAGGG CGA ACA GT-3’ ；R-primer 5' -TCA GCG TAA GGG TAA TGC GAG GT-3，。見 SEQ IDN0. 3。950C 3min ；95°C 5s, 60°C 30s，40個循環(huán)。結果發(fā)現(xiàn)在誘導強度較高的花中誘導提 高了 32倍，在誘導較弱的蓮座葉中誘導提高了 7倍(見圖5)。實施例6抗生素濃度對植物生長的影響分析試驗更低的抗生素濃度，以及利用博萊霉素和絲裂霉素分別進行誘導，結果發(fā)現(xiàn) 相對于博萊霉素來說，絲裂霉素的誘導效果較弱，當用1. O μ g/ml的博萊霉素誘導50h的效 果與用22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導30h的效果相當(圖6)，故而實際 應用時可以采用1. 0 μ g/ml的博萊霉素來進行誘導。將擬南芥種子消毒后均勻撒種至含有1. 0 μ g/ml的博萊霉素的1/2MS培養(yǎng)基上， 置4°C春化兩天后移至光照培養(yǎng)箱，一周后發(fā)現(xiàn)擬南芥的生長未受到明顯的影響(見圖7)， 說明該誘導濃度對最為敏感的苗期植物生長沒有明顯不利影響，可用于啟動子的誘導。實施例7PARP1基因?qū)ζ渌饨绛h(huán)境條件以及內(nèi)源生物因素的響應情況分析擬南芥信息網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)目前幾乎綜合了所有關于擬南芥基因 組水平的一些信息，它利用來自不同實驗室的基因芯片結果，提供了擬南芥轉(zhuǎn)錄組在不同 外界因素影響下的變化情況。根據(jù)該網(wǎng)站提供的信息我們可以查詢某一基因在不同環(huán)境因 素影響下的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)在擬南芥苗中(氣生部分以及根)PARPl基因的表達(圖 8)幾乎不受其它常見的外界脅迫因素如冷、熱、干旱、鹽、氧化、傷害等的影響，僅僅在用 Genotoxin(絲裂霉素+博萊霉素)處理時誘導大幅度提高。這從另一方面說明PARPl啟動 子受誘導的特異性非常強，應用時不易受其它因素的干擾。序列表
1. SEQ ID NO. 1 的信息
(i)序列特征長2179bp，線性核苷_I
( )分子類型核酸
(iii)序列及序列標記紅色(5’ -UTR)；藍色ATG(PARP1基因起始密碼子)
1-50TTTTGAGGCGGTGGAGTTTCTATTGATTGGTTATCGATGACCACTTGCAT
F-primer
51-100CGTCAAATGGTTCTTTGATTCGTGGTTTCGGCCCCAGCTTCATACTATCA
101-150CGAGACTCGACCATCTTGTTTTTTTCTTCTTCTTCTTGGTAAATGGTTTC
151-200ACAACTTGGTTCCTCTTTCTTTCATTTTATTTTATATACTATCATAGCAT
2151-2200 GAACTATTCTCCTGAAGAAGAAGACGAAAA TG0098]0099]R-primer0100]2. SEQ ID NO. 20101]用于擴增PARPl啟動子的引物0102]不含有酶切位點0103]上游引物5’ -ATTTTGAGGCGGTGGAGTTTC-3，0104]下游引物5，-CGTCGACTTTGAGCTTGTTCG-3'0105]含有酶切位點0106]上游引物5，-GAATTCTTTTGAGGCGGTGGA GTT TC-3'0107]下游引物5，-CCCGGGTTTCGTCTTCTTCTT CAG GAG AAT0108]3. SEQ ID NO. 30109]用于定量PCR的引物0110]上游引物:5，-AGTGGCAGTGAAGGGCGAACA GT-3'0111]下游引物5，-TCAGCGTAAGGGTAATGCGAG GT-3，。
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權利要求
一個化學誘導啟動子，其特征在于該啟動子為一段從擬南芥中克隆到的DNA序列，具有SEQ ID No.1所述的核苷酸順序。
2.如權利要求1所述化學誘導啟動子在組織特異性表達中的應用，其特征在于用于將 外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達，以提高外源基因在特定部位的表達水平，增加轉(zhuǎn)基因 的目的。
3.如權利要求1所述化學誘導啟動子在構建轉(zhuǎn)基因載體中的應用，其特征在于用于轉(zhuǎn) 基因載體的構建，實現(xiàn)對基因表達的人工調(diào)控，使目的基因定時、定量、定位地表達。
4.一種對權利要求1所述化學啟動子進行化學誘導的方法，其特征在于受到低濃度絲 裂霉素和博萊霉素誘導時，該啟動子驅(qū)動下游基因強烈表達。
5.一種包含權利要求1所述化學啟動子的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種化學誘導啟動子。包括受絲裂霉素和博萊霉素誘導的化學誘導啟動子的克隆方法、利用該啟動子的植物轉(zhuǎn)基因載體的構建方法、啟動子驅(qū)動的報告基因表達模式分析以及使用和誘導該啟動子的方法。該啟動子驅(qū)動的GUS報告基因在植物中的絕大部分組織中沒有表達或低水平表達；經(jīng)抗生素處理后該啟動子可以驅(qū)動報告基因在整個苗期以及花穗中強烈表達。除了抗生素外，該啟動子幾乎不受其它因素的誘導，特異性強，故該啟動子可被用于構建抗生素誘導的植物轉(zhuǎn)基因表達載體，在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上均具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/113GK101921764SQ20101017558
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權日2010年5月13日
發(fā)明者劉偉偉, 張海磊, 葛曉春 申請人:復旦大學