專利名稱：一種高通量篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于平板、微孔細(xì)胞培養(yǎng)板的快速、高通量篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株
的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酸是傳統(tǒng)大宗發(fā)酵產(chǎn)品，是最早大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的氨基酸，也是目前世界上 生產(chǎn)量最大的氨基酸。谷氨酸在食品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用，其單鈉 鹽-谷氨酸鈉(商品名稱味精)是重要的調(diào)味品。2008年我國(guó)谷氨酸產(chǎn)量約為160萬(wàn)噸，占 全球總量的75%左右。然而我國(guó)主要將谷氨酸(味精)作為純粹調(diào)味品(比例為85% )， 其他國(guó)家將谷氨酸作為純粹調(diào)味品的比例僅為52%，而將其用做化工、醫(yī)藥和保健食品中 間體的比例卻高達(dá)48% (日本味之素公司食品事業(yè)報(bào)告書，2002年)。預(yù)計(jì)今后5-20年， 我國(guó)將谷氨酸用做化工、醫(yī)藥和保健食品中間體的比例將會(huì)大大提高。預(yù)計(jì)2020年全球谷 氨酸產(chǎn)量可以達(dá)到320萬(wàn)噸，中國(guó)占總分額的70%，將達(dá)到224萬(wàn)噸。 中國(guó)是谷氨酸的生產(chǎn)大國(guó)同時(shí)也是消耗大國(guó)。但目前我國(guó)谷氨酸工業(yè)存在一些 嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題，最主要的是缺乏現(xiàn)代生物技術(shù)方法改造的高產(chǎn)優(yōu)良菌株， 發(fā)酵生產(chǎn)的主要技術(shù)指標(biāo)明顯低于國(guó)外先進(jìn)廠家的水平，造成生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)成本過(guò)高(食品科 學(xué)，2009， 30 (4) :40-43)。 優(yōu)良的谷氨酸高產(chǎn)菌株是發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的關(guān)鍵。我國(guó)于上世紀(jì)60年代開(kāi)始，先 后分離選育獲得了北京棒狀桿菌AS1.299、鈍齒棒狀桿菌AS1.452及天津短桿菌T6-13。隨 后通過(guò)UV、6°Co輻射、NTG、 DES等誘變方法和原生質(zhì)體融合等方法，選育了適合工業(yè)生產(chǎn)的 谷氨酸產(chǎn)生菌種。如云逢霖等以T6-13為出發(fā)菌株，采用UV和NTG誘變以及原生質(zhì)體誘變 等方法，通過(guò)多次誘變處理，選育出S9114菌株。該菌株具有耐高糖(25% -30% )、耐高谷 氨酸(20% )、不利用谷氨酸的特點(diǎn)。搖瓶試驗(yàn)初糖15.5%，產(chǎn)酸8.56%，轉(zhuǎn)化率55. 15%。 該菌株已在多家味精廠推廣應(yīng)用(發(fā)酵科技通訊，1993， 22(1) :3-7)。但是生產(chǎn)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)， 產(chǎn)谷氨酸菌種在保存?zhèn)鞔^(guò)程中，生產(chǎn)性能會(huì)逐漸衰退，產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率會(huì)不斷下降，因此， 必須定期進(jìn)行復(fù)壯，即從衰退的菌株中，通過(guò)分離、純化篩選出未衰退的菌株，這樣才能保 持菌株的高產(chǎn)性能，不斷滿足生產(chǎn)需要(發(fā)酵科技通訊，1993，22(2) :38-34)。
所以，高產(chǎn)谷氨酸菌株的選育工作在谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中必不可少。無(wú)論是用傳 統(tǒng)誘變、用現(xiàn)代基因工程手段對(duì)現(xiàn)有谷氨酸高產(chǎn)菌株的改造，還是高產(chǎn)菌株的復(fù)壯，都需要 從眾多的單菌株中挑選出高產(chǎn)菌株，而目前常用的篩選方法，都是先從特定的平板上挑選 單菌落，然后通過(guò)試管或小搖瓶發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酸初篩，再用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酸復(fù)篩，選出高產(chǎn) 菌株。由于谷氨酸搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，需要通過(guò)多次補(bǔ)加尿素或氨水來(lái)維持發(fā)酵液pH7. O，操 作繁瑣，工作量大，同時(shí)人為誤差也大，并且用試管或小搖瓶，每次發(fā)酵試驗(yàn)的數(shù)量有限，篩 選工作速度慢，因此，成為高產(chǎn)菌株選育的一個(gè)瓶頸。 本發(fā)明根據(jù)高產(chǎn)谷氨酸菌株的特點(diǎn)，采用選擇平板，如平板篩選限制因素為高 糖、高谷氨酸、谷氨酸唯一碳源、抗性(磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素等)、琥珀酸敏感型、營(yíng)養(yǎng)缺陷型(異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸缺陷型)等，或低pH耐受性，或高pH耐受性。 挑取在選擇平板生長(zhǎng)的菌落；用微孔細(xì)胞培養(yǎng)板代替試管或搖瓶進(jìn)行產(chǎn)酸初篩， 一塊微孔細(xì)胞培養(yǎng)板就可以進(jìn)行24至384個(gè)樣品同時(shí)搖床發(fā)酵，搖床上可放置多個(gè)微孔培 養(yǎng)板，有效地增加了每次篩選的菌落數(shù)量。并且本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酸堿指示劑，有 效的提示了補(bǔ)加尿素的時(shí)間，從而減少人為誤差，降低篩選工作強(qiáng)度，提高了整個(gè)篩選工作 的效率。因此，本發(fā)明對(duì)于高產(chǎn)谷氨酸產(chǎn)生菌株的選育有積極的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于選擇平板、微孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)技術(shù)，建立的快速、
高通量篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株的方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案 (1)將從自然界分離微生物樣品或通過(guò)人工改造的產(chǎn)谷氨酸突變菌樣品，涂布到 平板28-35t:培養(yǎng)48-72h。平板篩選限制因素為高糖、高谷氨酸、谷氨酸唯一碳源、抗性 (磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素等)、琥珀酸敏感型、營(yíng)養(yǎng)缺陷型(異亮氨酸、蛋氨酸、 苯丙氨酸等缺陷型)、低PH耐受、高pH耐受等。 如抗性平板培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖5-10g、蛋白胨5-10g、酵母膏l(xiāng)-5g、 牛肉膏3-10g、 NaCl 2-5g、瓊脂15_20g，并含磺胺胍5-20g、酮基丙二酸0. 5-2. 5g、丙二酸 5-20g、香豆素l-5g，蒸餾水定容至1L， pH7. 0。 如高糖平板培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖250-300g、蛋白胨5-10g、酵母膏
l-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g，瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1L， pH7. 0。 如高谷氨酸培養(yǎng)基由下述成分組成谷氨酸鈉150-200g、蛋白胨5-10g、酵母膏
l-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g，瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1L， pH7. 0。 如谷氨酸唯一碳源培養(yǎng)基由下述成分組成谷氛酸鈉5-10g、 (NH4)2S040. 5_2. 5g、
K2HP04 0 . 5-2 . 5g、 KH2P04 0. 1—0 . 8g、 MgS04 0. 5-5g、 FeS04 l-10mg、 MnS04 1—10mg、硫胺素
0. 05-0. 2mg、生物素0. 01-0. lmg，水洗瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1L， NaOH調(diào)pH7. 0。 如選育琥珀酸敏感型菌株所用培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖5-10g、蛋白胨
5-10g、酵母膏l(xiāng)-5g、牛肉膏3-10g、 NaCl 2-5g、琥珀酸0. 1-3g，瓊脂15_20g，蒸餾水定容至
1L， pH7. 0。 如低pH梯度平板由下述成分組成葡萄糖l-10g、蛋白胨5-10g、酵母膏l(xiāng)-5g、牛 肉膏3-10g、NaCl 2-5g、瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1L，滅菌后用谷氨酸調(diào)節(jié)pH 4.0-5.0。
如高pH梯度平板由下述成分組成葡萄糖100-150g、 K2HP04 0. 5-1. 5g、 MgS04 0. 5-5g、 FeS04 l-10mg、 MnS04 1-10mg、硫胺素0. 01-0. lmg、尿素3-10g、玉米槳H0g、溴百 里香酚蘭0. 05-0. 5g、瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1L，滅菌后用NaOH調(diào)pH 10. 0-12. 0。
(2)微孔培養(yǎng)板初篩挑選在平板生長(zhǎng)的單菌落，接種于每孔含有O. 8-1. 2mL種子 培養(yǎng)基的微孔培養(yǎng)板，28-35t:搖床培養(yǎng)12-24h后，按5% _10%接種量，轉(zhuǎn)接至每孔含有 0. 8-1. 2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的微孔培養(yǎng)板，30-35t:搖床培養(yǎng)32-48h，搖床轉(zhuǎn)速是200-300rpm， 并在發(fā)酵12-24h時(shí)，補(bǔ)加質(zhì)量濃度10% -20%的尿素50-100 ii L，繼續(xù)發(fā)酵20_36h。微孔 培養(yǎng)板中的發(fā)酵液通過(guò)SBA-40C生物傳感分析儀檢測(cè)谷氨酸產(chǎn)量，選取產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。 采用的微孔培養(yǎng)板是24孔或48孔或96孔或384孔的方形深孔板。種子培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖15-25g、 K2HP04 0 . 5-2 . 5g、 MgS040. 3_6g、
FeS04 l-10mg、MnS04 l-15mg、尿素l-3g、玉米漿20_35g，定容至1L， pH 7.0。 發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖100-150g、 K2HP04 0. 5-1. 5g、 MgS040. l_6g、
FeS04 l-5mg、 MnS04 1-5mg、硫胺素0. 01-0. lmg、尿素3-10g、玉米槳l-10g，定容至1L， pH
7. 0。 (3)搖瓶復(fù)篩將上述產(chǎn)谷氨酸含量高的菌株接種到含10-30mL種子培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，28-35 。C搖床培養(yǎng)8_12h后，按2. 5% _10%轉(zhuǎn)接至含有10_50mL發(fā)酵培 養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0. 01-0. lg/L的酸堿指示劑。培養(yǎng)在 200-250rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床、或90-150rpm的往復(fù)式搖床上進(jìn)行，根據(jù)發(fā)酵液中指示劑顏色 變化，補(bǔ)加質(zhì)量濃度10 % -40 %的尿素3-8次，每次加量100-800 y L，發(fā)酵40_50h，通過(guò) SBA-40C生物傳感分析儀檢測(cè)谷氨酸產(chǎn)量，選出高產(chǎn)菌株。 發(fā)酵液中葡萄糖以及谷氨酸含量用SBA-40C生物傳感分析儀檢測(cè)發(fā)酵液稀釋 10-100倍，樣品進(jìn)樣量25 ii L，根據(jù)儀器顯示數(shù)據(jù)乘以稀釋倍數(shù)即為谷氨酸以及葡萄糖含 搖瓶中菌體生長(zhǎng)用752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)搖瓶中菌液適當(dāng)稀釋后，于
分光光度計(jì)檢測(cè)0D66。；微孔培養(yǎng)板中菌體生長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸取200 P L微孔板中的菌液
至新的微孔板中，蓋蓋后置于酶標(biāo)儀震蕩30s后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定0D66。。 本發(fā)明的有益效果傳統(tǒng)的篩選方法是從平板上挑取單菌落，然后通過(guò)試管或小
搖瓶發(fā)酵初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的篩選進(jìn)行了改良，根據(jù)高產(chǎn)谷氨酸菌
株的特點(diǎn)，在平板上挑取單菌落，用微孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。本發(fā)明方法
有效地增加了每次篩選的菌落數(shù)量，降低篩選工作強(qiáng)度，提高了整個(gè)篩選工作的效率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1微孔培養(yǎng)板用于發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的可行性 將實(shí)驗(yàn)室保藏的谷氨酸生產(chǎn)菌SW07-1，該菌株巳在文章"耐溫性L-谷氨酸發(fā)酵菌 種的選育"(生物加工過(guò)程，2009，7(6) :74-78)中公開(kāi)，并應(yīng)用從斜面劃線至LB平板活化 24h，接種針挑一環(huán)至含有10mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶，30°C ， 220rpm培養(yǎng)12h，種子轉(zhuǎn)接 到發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，在96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板的4個(gè)角以及邊緣一排和中間部分隨機(jī)預(yù)留一 些孔作為無(wú)菌空白樣對(duì)照，而選取11個(gè)具有代表性的位置接種作為發(fā)酵培養(yǎng)的平行樣，以 8%的接種量接種至該11個(gè)孔，每孔含有l(wèi)mL發(fā)酵培養(yǎng)基。接種后蓋上無(wú)菌紗布置于搖床 3(TC，220rpm培養(yǎng)，24h后所有的孔(包括空白樣)都補(bǔ)加10%尿素80 y L，繼續(xù)發(fā)酵24h 后分別檢測(cè)各孔(包括空白樣)的谷氨酸含量，同時(shí)利用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)樣品的OD,，考察 是否出現(xiàn)染菌情況。結(jié)果空白樣的OD,均小于O. 1，平行樣的0D,均大于0.8，故可以認(rèn)為 沒(méi)有染菌現(xiàn)象。 本實(shí)例所用培養(yǎng)基成分如下種子培養(yǎng)基葡萄糖25g、 K2HP04 1. 5g、 MgS040 . 6g、 FeS04 5mg、MnS04 5mg、尿素2. 5g、玉米槳30g，定容至1L， pH 7. 0。 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖140g、 K2HP04 lg、 MgS04 6g、 FeS04 5mg、 MnS04 5mg、硫胺素0. 05mg、尿素7g、玉米漿3g，定容至1L， pH 7. 0。 用SBA-40C生物傳感分析儀直接測(cè)定孔板中發(fā)酵液的谷氨酸含量，結(jié)果顯示所有
空白樣的谷氨酸含量低于10—、/L，而ll個(gè)平行樣的結(jié)果(單位10—2g/L)如下55. 7、55. 1、
59. 2、59. 1、57. 7、57. 6、61. 9、59. 4、58. 4、56. 7、57. 4，平均值為58. 1，方差s2 = 3. 60，標(biāo)準(zhǔn)
差o = 1.81，據(jù)SBA-40C型生物傳感分析儀的工作原理和儀器特性，其相對(duì)誤差為1%
左右，且不大于2%。而本實(shí)驗(yàn)中各個(gè)孔之間的相對(duì)誤差為2.48%，排除儀器誤差后只有
0. 48%，表明96孔培養(yǎng)板能夠較穩(wěn)定的反應(yīng)出菌種的產(chǎn)酸情況。 實(shí)施例2用抗性平板_微孔培養(yǎng)板對(duì)X射線誘變后菌株的篩選 選擇平板組成葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、 NaCl 5g、磺胺胍
20g、酮基丙二酸2. 5g、丙二酸16g、香豆素2g、瓊脂20g，定容至1L， pH7. 0。種子培養(yǎng)基葡萄糖25g、 K2HP04 1. 5g、 MgS04 0 . 6g、 FeS04 5mg、 MnS045mg、尿素
2. 5g、玉米槳30g，定容至1L， pH 7. 0。 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖140g、 K2HP04 lg、 MgS04 6g、 FeS04 5mg、 MnS04 5mg、硫胺素 0. 05mg、尿素7g、玉米漿3g，定容至1L， pH 7. 0。 將實(shí)驗(yàn)室保存的谷氨酸生產(chǎn)菌株SW07-1，用X射線誘變40min獲得突變菌庫(kù)。將 誘變后的菌懸液涂布至選擇平板，3(TC培養(yǎng)3天，挑出平板上長(zhǎng)出的菌落共89個(gè)，分別接種 至含有l(wèi)mL種子培養(yǎng)基的微孔細(xì)胞培養(yǎng)板的96孔中(其中孔A1、B1為原始菌對(duì)照)，3(TC， 220rpm培養(yǎng)24h后，以8 %接種量轉(zhuǎn)接至每孔含lmL發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 30°C ， 220rpm培養(yǎng)24h后，每孔補(bǔ)加10%的尿素80 y L，繼續(xù)32。C ， 250rpm培養(yǎng)24h發(fā)酵結(jié) 束。SBA-40C生物傳感分析儀檢測(cè)各孔中發(fā)酵液的谷氨酸含量(單位10—2g/L)，其中21株 高于對(duì)照數(shù)據(jù)，結(jié)果如表l。 表IX射線誘變后抗性突變株96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)果
123456789101112
A121.035.632.714 .479.823.5146.3158.091.584.1111.656.3
B117.827.262.821.8124.369.170.7140.4155.1101.2122.660.9
C153.1166.370.512.320.749.663.893.8154.382.9128.571.9
D59.717.5105.124.714.0132.174.3130.0146.6106.4H3.0
E17.166.711.441.727.325.681.3101.1116.3150.5104.8
F40.597.524.462.640.567.296.697.0112.2136.4112.2
G67.2111.259.724.584.829.7125.9141.8141.874.4122.0
H103.125.862.859.912.643.9125.2146.940.188.3114.2 實(shí)施例3-4用pH耐受平板_微孔培養(yǎng)板對(duì)誘變后菌株的篩選 將實(shí)驗(yàn)室保存的谷氨酸生產(chǎn)菌株SW07-1，用X射線誘變40min獲得突變菌庫(kù)。將
誘變后的菌懸液分別涂布至于低PH梯度平板和高pH梯度平板，3(TC培養(yǎng)3天。 其中，低pH梯度平板由下述成分組成葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏
10g、 NaCl 5g、瓊脂20g，定容至1L，滅菌后用谷氨酸調(diào)節(jié)pH4. 6-5. 0。 高pH梯度平板由下述成分組成葡萄糖140g、 K2HP04 lg、 MgS04 6g、 FeS045mg、MnS04 5mg、硫胺素0. 05mg、尿素7g、玉米漿3g、溴百里香酚蘭0. lg、瓊脂20g，定容至1L，滅 菌后用NaOH調(diào)pH為10. 5-11. 2。 挑選在低pH梯度平板上生長(zhǎng)單菌落126個(gè)，在高pH平板生長(zhǎng)單菌落280個(gè)。將 這406個(gè)菌落，按實(shí)施例2的方法接種到96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行初篩，分別得到9株和 41株谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照菌株高的菌株。
實(shí)施例5對(duì)微孔細(xì)胞培養(yǎng)板初篩菌株的搖瓶復(fù)篩 微孔細(xì)胞培養(yǎng)板初篩得到的菌株71株菌株，經(jīng)LB平板培養(yǎng)24h后，進(jìn)行搖瓶發(fā) 酵實(shí)驗(yàn)。將菌株接種至含10mL種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基成分同實(shí)施例2)的 250mL搖瓶中，且發(fā)酵搖瓶有2個(gè)平行樣，30°C ， 220rpm培養(yǎng)8h， 8%接種量轉(zhuǎn)接至含0. 01 % 中性紅的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程中菌體先產(chǎn)堿后產(chǎn)酸，發(fā)酵液由最初的紅色變成黃色再變 成紅色，當(dāng)發(fā)酵液再次變紅時(shí)(約發(fā)酵8 10h)，每2h補(bǔ)加適量尿素維持pH7. 0左右，直至 殘?zhí)切∮趌g/L(約發(fā)酵40 48h)。 搖瓶發(fā)酵液稀釋100倍后通過(guò)SBA-40C生物傳感分析儀檢測(cè)谷氨酸及葡萄糖含 量。結(jié)果有13株突變株的產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率高于對(duì)照菌株。 這13株菌連續(xù)轉(zhuǎn)接6代后，再進(jìn)行如上所述的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2(表中
數(shù)據(jù)為兩個(gè)平行樣的平均值)。其中編號(hào)為D-2-2、D-2-3、D-2-17、G-6-13、G-6-32、G-7-2、
X-43菌株的產(chǎn)量仍高于對(duì)照菌株。 表2連續(xù)傳代后菌株的產(chǎn)谷氨酸
菌號(hào)SW07-1 (對(duì)照)D-1-32D-2-2D-2-3D-2-17G-5-19G-5-36
谷氨酸產(chǎn)量(g/L)65.7064.4070.8073.4076.1564.5059.15
菌號(hào)(i-6-13G-6-23G-6-29G-6-32X-8X誦43
谷氨酸產(chǎn)量(g/L)66.7053.2562.8067.卯71.8055.2570.25 實(shí)施例6微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中低產(chǎn)酸菌株的搖瓶檢驗(yàn) 從實(shí)施例2-4的96孔微孔細(xì)胞培養(yǎng)板中產(chǎn)酸少于對(duì)照株的負(fù)突變株中，隨機(jī)選取
15株，編號(hào)為-1、 _2、 _3、到-15。按實(shí)施例5的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3(表中
數(shù)據(jù)為兩個(gè)平行樣的平均值)，負(fù)突變組的15株菌產(chǎn)量均少于原菌，說(shuō)明利用微孔板發(fā)酵
篩選谷氨酸高產(chǎn)菌的方法出現(xiàn)漏篩的可能小。 表3負(fù)突變株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果
菌號(hào)SW07-1 (對(duì)照)_1_2_3-4_5_6_7
谷氨酸產(chǎn)量(g/U64. 2527. 3015. 1538. 551. 3015. 654. 8015. 60
菌號(hào)-8_9-10-11-12-13-14-15
谷氨酸產(chǎn)量(g/U11. 601. 807. 4516. 7521. 106. 950. 550. 40
權(quán)利要求
一種高通量篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于(1)從自然界分離或通過(guò)人工改造的谷氨酸產(chǎn)生菌樣品，涂布到選擇平板，28-35℃培養(yǎng)48-72h；(2)微孔培養(yǎng)板初篩挑選在平板生長(zhǎng)的單菌落，接種到含種子培養(yǎng)基的微孔培養(yǎng)板，28-35℃搖床培養(yǎng)12-24h，轉(zhuǎn)接至含發(fā)酵培養(yǎng)基的微孔培養(yǎng)板，28-35℃搖床培養(yǎng)32-48h，測(cè)定液體中谷氨酸的含量；(3)搖瓶復(fù)篩將上述產(chǎn)谷氨酸含量高的菌株接種到含種子培養(yǎng)基的搖瓶中，28-35℃搖床培養(yǎng)8-12h后，轉(zhuǎn)接至含發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵40-50h，檢測(cè)發(fā)酵液中谷氨酸含量，選出高產(chǎn)菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的選擇平板，平板培養(yǎng)基是含有限制因素的選擇性平板，篩選限制因素為高糖，或高谷氨酸，或谷氨酸唯一碳源、或抗性磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素抗性，或琥珀酸敏感型，或營(yíng)養(yǎng)缺陷型異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸缺陷型，或低pH耐受性，或高pH耐受性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖15-25g、 K2HP04 0 . 5-2 . 5g、 MgS04 0 . 3-6g、 FeS04 l-10mg、 MnS04l-15mg、尿素l-3g、玉米槳20-35g，定容至1L， pH 7. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖100-150g、K2HP04 0. 5-1. 5g、MgS04 0. l_6g、 FeS04 l_5mg、 MnS04l-5mg、硫胺素0. 01-0. lmg、尿素3-10g、玉米漿l-10g，定容至1L， pH 7. 0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用微孔培養(yǎng)板初篩時(shí)，采用的微孔培養(yǎng)板是24孔或48孔或96孔或384孔的方形深孔板，裝液量為0. 8_1. 2mL，發(fā)酵培養(yǎng)的接種量是5% _10%，搖床轉(zhuǎn)速是200-300rpm，并在發(fā)酵培養(yǎng)12_24h時(shí)，補(bǔ)加質(zhì)量濃度10% -20 %的尿素50-100 ii L，繼續(xù)發(fā)酵20-36h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于搖瓶復(fù)篩時(shí)，種子培養(yǎng)采用250mL三角瓶，裝液量10-30mL ;發(fā)酵培養(yǎng)采用500mL三角瓶，裝液量10-50mL，接種量2. 5% _10%，培養(yǎng)在200-250rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床、或90-150rpm的往復(fù)式搖床上進(jìn)行，根據(jù)發(fā)酵液中指示劑顏色變化，補(bǔ)加質(zhì)量濃度10 % -40 %的尿素3-8次，每次加量100-800 y L，發(fā)酵40_50h后，檢測(cè)發(fā)酵液中谷氨酸含量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.01-0. lg/L的酸堿指示劑，酸堿指示劑選用酚紅、中性紅、甲酚紅或溴甲酚紫。
全文摘要
一種高通量篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。高產(chǎn)菌株的篩選一直是產(chǎn)谷氨酸菌種選育的瓶頸。傳統(tǒng)的篩選方法是從平板上挑取單菌落，然后通過(guò)試管或小搖瓶發(fā)酵初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的篩選進(jìn)行了改良，根據(jù)高產(chǎn)谷氨酸菌株的特點(diǎn)，在平板上挑取單菌落，用微孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。本發(fā)明方法有效地增加了每次篩選的菌落數(shù)量，降低篩選工作強(qiáng)度，提高了整個(gè)篩選工作的效率。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101735971SQ20101001813
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者孫志浩, 杜巧燕, 鄭璞 申請(qǐng)人:江南大學(xué)