專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)樣品空腸彎曲 桿菌的檢測(cè)試劑盒其使用方法。
背景技術(shù)：
空腸彎曲桿菌是彎曲桿菌屬成員之一，屬革蘭氏陰性菌，是近年來國(guó)內(nèi)外廣泛重 視的人畜共患病原菌，主要引起人類發(fā)熱、急性腸炎、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病，即 格林巴利綜合征。該菌可以通過帶菌動(dòng)物或患者的糞便進(jìn)入環(huán)境中，并在水環(huán)境中進(jìn)入一 種稱為“活的非可培養(yǎng)(viable but noncultureable,VBNC)狀態(tài)的休眠期，處于VBNC狀態(tài) 的細(xì)菌在特定條件下可以復(fù)蘇，且具有致病性。接觸帶菌動(dòng)物，或攝入受到污染的禽制品、 水源和牛奶是該菌感染人體的主要途徑。由于空腸彎曲桿菌培養(yǎng)條件苛刻，在25°C不生長(zhǎng)，42°C生長(zhǎng)良好，但容易進(jìn)入 VBNC狀態(tài)，使得常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度不高，所需時(shí)間藏，而不利于 爆發(fā)疫情時(shí)的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測(cè)所要求的快速、準(zhǔn)確的原則。因此，建立 一種快速、簡(jiǎn)、可靠的檢測(cè)方法十分必要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)是 Notomi 等 在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫65°C左右，幾十分 鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。4條引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)域的識(shí)別，保證了 LAMP 擴(kuò)增的高度特異性。LAMP不需要模板的熱變性，長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì) 因溫度改變而造成時(shí)間的浪費(fèi)。有無肉眼可見的焦磷酸鎂的白色沉淀，成為判斷核酸是否 擴(kuò)增的最簡(jiǎn)單的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原核酸檢測(cè)技術(shù)上具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是目 前還未見有應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)空腸彎曲桿菌的方法和檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplicatio of DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒，可廣泛用于食品、獸醫(yī)等 領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組可由下述八套引物組中的任一引物組組成，每套引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引 物、外引物組成，分別如下引物序列如下引物組一內(nèi)引物1:
TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTCCTCAATCTCGCTTTGGGA內(nèi)引物2:CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA外引物1 :ACAAAATTTCAGCCTTTGGT外引物2 :CCTTGAGCACGTTCTTTG或引物組二內(nèi)引物1:TCCGTGTGTGCCTACTTTTATTTTATTCACGATGTTTTAGGGATTAACG內(nèi)引物2:TGTTGATAGAAATGTCATCTTAGGCTTTTCGACAAGTGCATTATCGAGTA外引物1 :CAGCCTTTGGTCCTCAA外引物2 TTTGCGCTGCTTTGGTT或引物組三內(nèi)引物1:TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTGCTTTGGGATTATTCACGAT內(nèi)引物2:CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA外引物1 CAGCCTTTGGTCCTCAA外引物2 CATTATCGAGTATGCCTTGAG或引物組四內(nèi)引物1:CGGTCGATTTTGTTCCAAATTATGATTTTAACCCTAGAAGGTAAAACATCAG內(nèi)引物2:TGCTTCAGTATAACGCATCGCTTTTACAAGGCAACTTTGGATCT外引物1 AGCTATACCACTTGAACCATT外引物2 CTATGAGATATCCAAGTATTACAGG或引物組五內(nèi)引物1:GAACGGCTAAAGGAAAAGCAGTGTTTTATAGCCATGATTTTTTCTTCAGC內(nèi)引物2:CTGTCCACGATCTGTTACAAACATTTTATAGAAAGTTTCTTTACGGCAA外引物1 CATCAAAATCCGTGGTTGG外引物2 CCGTTACGACTTATGATGATGA或引物組六內(nèi)引物1:CGTGAGGCTATGAGTGAAATTGTTTTTTTTTGCCAACATAATCACACC內(nèi)引物2:ACAACGCGGATTCCTTCTTTATTTTTGCAGAGCTTGTTAAAGAAAGG外引物1 CCAACAAAGAGAAAATTTTAGGTTC
外引物2 GCTAGGCTTATAGAGCAGAT或引物組七內(nèi)引物1:GTCGATGTGAATTTTAATGCGGTATTTTGTCAAGCACAACTATTCCTC內(nèi)引物2:AGCATTTAAAACCTTTTGCCCTTCTTTTTCACTTTAGACACTGGTATTGC外引物1 ACATAAGGTGAATTTTGATCGTT外引物2 CAATGTTGTGCCAATAAACG或引物組八內(nèi)引物1:AGGGCAAAAGGTTTTAAATGCTAAATTTTAATACCGCATTAAAATTCACATC內(nèi)引物2:CAAAGCAATACCAGTGTCTAAAGTGTTTTGGGCTTTTATACATTAGCGATG外引物1 CTCTAGCTTCAAGTTCTTGTT外引物2 GGTGGTTTTGAAGCAAAGA優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl (pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的IYis-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。本發(fā)明建立了改良的空腸彎曲桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，本試劑盒根據(jù)空腸彎曲桿 菌保守區(qū)的設(shè)計(jì)了內(nèi)引物、外引物。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與 鈣黃綠素錳絡(luò)合物當(dāng)中的錳結(jié)合，釋放出鈣黃綠素，即可通過顏色變化觀察結(jié)果。本發(fā)明采 用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)，且使用的鈣黃綠 素錳絡(luò)合物染料具有簡(jiǎn)單、方便、便宜、產(chǎn)物不容易污染等特點(diǎn)，可廣泛用于食品、獸醫(yī)等領(lǐng) 域本發(fā)明的有益效果是(1)不需要特殊試劑與設(shè)備；O)高特異性應(yīng)用6個(gè)區(qū)域，兩對(duì)引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否了( 快速、高效擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間 60min左右(4)鑒定簡(jiǎn)便結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，在反應(yīng)中預(yù)先加入鈣黃綠素錳 絡(luò)合物，錳與dNTP析出的焦磷酸跟離子結(jié)合，釋放出鈣黃綠素，可通過肉眼觀察鑒定，陽性 結(jié)果為黃綠色，陰性結(jié)果為淺黃色。下面提供具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，但本發(fā)明的技術(shù)應(yīng) 用不限于實(shí)例。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTCCTCAATCTCGCTTTGGGA內(nèi)引物2:CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA外引物1 ACAAAATTTCAGCCTTTGGT外引物2 CCTTGAGCACGTTCTTTG優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl (pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的IYis-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例二本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；⑵弓丨物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1:TCCGTGTGTGCCTACTTTTATTTTATTCACGATGTTTTAGGGATTAACG內(nèi)引物2:TGTTGATAGAAATGTCATCTTAGGCTTTTCGACAAGTGCATTATCGAGTA外引物1 :CAGCCTTTGGTCCTCAA外引物2 TTTGCGCTGCTTTGGTT優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例三本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1:TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTGCTTTGGGATTATTCACGAT內(nèi)引物2:CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA外引物1 CAGCCTTTGGTCCTCAA外引物2 CATTATCGAGTATGCCTTGAG優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例四本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1:CGGTCGATTTTGTTCCAAATTATGATTTTAACCCTAGAAGGTAAAACATCAG內(nèi)引物2:TGCTTCAGTATAACGCATCGCTTTTACAAGGCAACTTTGGATCT外引物1 :AGCTATACCACTTGAACCATT外引物2 CTATGAGATATCCAAGTATTACAGG優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (ρΗ8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例五本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1:GAACGGCTAAAGGAAAAGCAGTGTTTTATAGCCATGATTTTTTCTTCAGC內(nèi)引物2:CTGTCCACGATCTGTTACAAACATTTTATAGAAAGTTTCTTTACGGCAA外引物1 :CATCAAAATCCGTGGTTGG外引物2 CCGTTACGACTTATGATGATGA優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、16 μ L ddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L0[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例六本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下(各引物有無濃度要求)引物序列如下內(nèi)引物1:CGTGAGGCTATGAGTGAAATTGTTTTTTTTTGCCAACATAATCACACC內(nèi)引物2:
ACAACGCGGATTCCTTCTTTATTTTTGCAGAGCTTGTTAAAGAAAGG外引物1 CCAACAAAGAGAAAATTTTAGGTTC外引物2 GCTAGGCTTATAGAGCAGAT優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (pH8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例七本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下引物序列如下內(nèi)引物1:GTCGATGTGAATTTTAATGCGGTATTTTGTCAAGCACAACTATTCCTC內(nèi)引物2:AGCATTTAAAACCTTTTGCCCTTCTTTTTCACTTTAGACACTGGTATTGC外引物1 ACATAAGGTGAATTTTGATCGTT外引物2 CAATGTTGTGCCAATAAACG優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl(pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (ρΗ8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟
[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、 16 μ LddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L。[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。實(shí)施例八本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述 引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如下(各引物有無濃度要求)引物序列如下內(nèi)引物1:AGGGCAAAAGGTTTTAAATGCTAAATTTTAATACCGCATTAAAATTCACATC內(nèi)引物2:CAAAGCAATACCAGTGTCTAAAGTGTTTTGGGCTTTTATACATTAGCGATG外引物1 :CTCTAGCTTCAAGTTCTTGTT外引物2 GGTGGTTTTGAAGCAAAGA優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的Tris-HCl (pH 8. 8)、濃度為50mM的KC1、 濃度為50mM的(NH4)2S04、濃度為1. 6U的Bst DNA聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為 6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM_40mM的MgS04、濃度為0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。 優(yōu)選的，所述樣品預(yù)處理液包括裂解液和中和液。優(yōu)選的，所述裂解液由濃度為25mmol/L的NaOH組成。優(yōu)選的，所述中和液由濃度為IM的Tris-HCl (ρΗ8. 0)組成。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入 50 μ L裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4 μ L中和液，混懸液4°C 20, OOOg離心5min，去 沉淀，上清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、16 μ L ddH20于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L0[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待 檢DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則 為陰性。以上各實(shí)施例中的內(nèi)引物、外引物的濃度為，內(nèi)引物12 μ Μ-20 μ Μ、外引物濃度為 2 μ Μ-5 μ Μ。
序列表<110>江蘇省家禽科學(xué)研究所<120>基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒及其使用方法<160>32<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>1內(nèi)引物 FIP :TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTCCTCAATCTCGCTTTGGGA<210>2<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>2內(nèi)引物 BIP :CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3外引物F3 ACAAAATTTCAGCCTTTGGT<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4外引物B3 CCTTGAGCACGTTCTTTG<210>5<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>5內(nèi)引物 FIP :TCCGTGTGTGCCTACTTTTATTTTATTCACGATGTTTTAGGGATTAACG<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列
<400>6
內(nèi)引物 BIP :TGTTGATAGAAATGTCATCTTAGGCTTTTCGACAAGTGCATTATCGAGTA
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
外引物 F3 :CAGCCTTTGGTCCTCAA
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
外引物 B3 :TTTGCGCTGCTTTGGTT
<210>9
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
內(nèi)引物 FIP :TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTGCTTTGGGATTATTCACGAT
<210>10
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
內(nèi)引物 BIP :CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
外引物 F3 :CAGCCTTTGGTCCTCAA
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
外引物 B3 CATTATCGAGTATGCCTTGAG
<210>13
<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>13內(nèi)引物 FIP :CGGTCGATTTTGTTCCAAATTATGATTTTAACCCTAGAAGGTAAAACATCAG<210>14<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>14內(nèi)引物 BIP :TGCTTCAGTATAACGCATCGCTTTTACAAGGCAACTTTGGATCT<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15外引物F3 AGCTATACCACTTGAACCATT<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>16外引物B3 CATTATCGAGTATGCCTTGAG<210>17<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>17內(nèi)引物 FIP :GAACGGCTAAAGGAAAAGCAGTGTTTTATAGCCATGATTTTTTCTTCAGC<210>18<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>18內(nèi)引物 BIP :CTGTCCACGATCTGTTACAAACATTTTATAGAAAGTTTCTTTACGGCAA<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>19
外引物 F3 CATCAAAATCCGTGGTTGG
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
外引物 B3 CCGTTACGACTTATGATGATGA
<210>21
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
內(nèi)引物 FIP :CGTGAGGCTATGAGTGAAATTGTTTTTTTTTGCCAACATAATCACACC
<210>22
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
內(nèi)引物 BIP :ACAACGCGGATTCCTTCTTTATTTTTGCAGAGCTTGTTAAAGAAAGG
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
外引物 F3 CCAACAAAGAGAAAATTTTAGGTTC
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
外引物 B3 GCTAGGCTTATAGAGCAGAT
<210>25
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
內(nèi)引物 FIP :GTCGATGTGAATTTTAATGCGGTATTTTGTCAAGCACAACTATTCCTC
<210>26
<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>26內(nèi)引物 BIP :AGCATTTAAAACCTTTTGCCCTTCTTTTTCACTTTAGACACTGGTATTGC<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>27外引物F3 ACATAAGGTGAATTTTGATCGTT<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28外引物B3 CAATGTTGTGCCAATAAACG<210>29<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>29內(nèi)引物 FIP AGGGCAAAAGGTTTTAAATGCTAAATTTTAATACCGCATTAAAATTCACATC<210>30<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>30內(nèi)引物 BIP :CAAAGCAATACCAGTGTCTAAAGTGTTTTGGGCTTTTATACATTAGCGATG<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>31外引物F3 CTCTAGCTTCAAGTTCTTGTT<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>32外引物B3 GGTGGTTTTGAAGCAAAGA
權(quán)利要求
1. 一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒，由(1)反應(yīng)液；(2) 引物組；C3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，其特征在于，所述引物組可由下述八套引 物組中的任一引物組組成，每套引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成，分別如 下引物序列如下 引物組一內(nèi)引物 1 :TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTCCTCAATCTCGCTTTGGGA 內(nèi)引物 2 :CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA 外引物 1 :ACAAAATTTCAGCCTTTGGT 外引物 2 :CCTTGAGCACGTTCTTTG 或引物組二內(nèi)引物 1 :TCCGTGTGTGCCTACTTTTATTTTATTCACGATGTTTTAGGGATTAACG 內(nèi)引物 2 :TGTTGATAGAAATGTCATCTTAGGCTTTTCGACAAGTGCATTATCGAGTA 外引物 1 :CAGCCTTTGGTCCTCAA 外引物 2 :TTTGCGCTGCTTTGGTT 或引物組三內(nèi)引物 1 :TGTGCCTACTTTTATATTCTCATCTTTTTGCTTTGGGATTATTCACGAT 內(nèi)引物 2 :CACGGAAAAAGTATCAATTCTGAATTTTGCCTAAGATGACATTTCTATCAACA 外引物 1 :CAGCCTTTGGTCCTCAA 外引物 2 CATTATCGAGTATGCCTTGAG 或引物組四內(nèi)引物 1 :CGGTCGATTTTGTTCCAAATTATGATTTTAACCCTAGAAGGTAAAACATCAG 內(nèi)引物 2 :TGCTTCAGTATAACGCATCGCTTTTACAAGGCAACTTTGGATCT 外引物 1 :AGCTATACCACTTGAACCATT 外引物 2 CTATGAGATATCCAAGTATTACAGG 或引物組五內(nèi)引物 1 :GAACGGCTAAAGGAAAAGCAGTGTTTTATAGCCATGATTTTTTCTTCAGC 內(nèi)引物 2 :CTGTCCACGATCTGTTACAAACATTTTATAGAAAGTTTCTTTACGGCAA 外引物 1 :CATCAAAATCCGTGGTTGG 外引物 2 CCGTTACGACTTATGATGATGA 或引物組六內(nèi)引物 1 :CGTGAGGCTATGAGTGAAATTGTTTTTTTTTGCCAACATAATCACACC 內(nèi)引物 2 :ACAACGCGGATTCCTTCTTTATTTTTGCAGAGCTTGTTAAAGAAAGG 外引物 1 :CCAACAAAGAGAAAATTTTAGGTTC 外引物 2 GCTAGGCTTATAGAGCAGAT 或引物組七內(nèi)引物 1 :GTCGATGTGAATTTTAATGCGGTATTTTGTCAAGCACAACTATTCCTC 內(nèi)引物 2 :AGCATTTAAAACCTTTTGCCCTTCTTTTTCACTTTAGACACTGGTATTGC 外引物 1 :ACATAAGGTGAATTTTGATCGTT外引物 2 CAATGTTGTGCCAATAAACG 或引物組八內(nèi)引物 1 :AGGGCAAAAGGTTTTAAATGCTAAATTTTAATACCGCATTAAAATTCACATC 內(nèi)引物 2 :CAAAGCAATACCAGTGTCTAAAGTGTTTTGGGCTTTTATACATTAGCGATG 外引物 1 CTCTAGCTTCAAGTTCTTGTT 外引物 2 GGTGGTTTTGAAGCAAAGA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液由濃度為IOOmM的 Tris-HCl (pH 8. 8)、濃度為 50mM 的 KCl、濃度為 50mM 的(NH4) 2S04、濃度為 1. 6U 的 BstDNA 聚合酶、濃度為4M的甜菜堿、濃度為6mM-8mM的dNTP、濃度為30mM-40mM的MgS04、濃度為 0. OlmM-O. ImM的鈣黃綠素錳絡(luò)合物組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述樣品預(yù)處理液包括裂解 液和中和液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述裂解液由濃度為25mmol/ L的NaOH組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述中和液由濃度為IM的 Tris-HCl (pH8. 0)組成。
6.一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以 下步驟[1]DNA模板的制備取一接種環(huán)的過夜培養(yǎng)的增菌液于1.5mL離心管中，加入50yL 裂解液混勻，100°C水浴lOmin，加入4μ L中和液，混懸液4°C 20，OOOg離心5min，去沉淀，上 清作為DNA模板。[2]空腸彎曲桿菌擴(kuò)增試劑的配制方法如下取5μ L反應(yīng)液、2 μ L引物組、16 μ LddH20 于一無菌PCR反應(yīng)管中，加入已制備好的模板2 μ L0[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程在裝有23μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待檢 DNA模板，于65°C溫育60min，80°C滅活I(lǐng)Omin中止反應(yīng)。[4]結(jié)果觀察陽性對(duì)照管發(fā)出黃綠色熒光，樣品管與陽性對(duì)照同色為陽性，否則為陰性。
全文摘要
基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的空腸彎曲桿菌快速檢測(cè)試劑盒及其使用方法。由(1)反應(yīng)液；(2)引物組；(3)樣品預(yù)處理液；(4)陽性對(duì)照液組成，所述引物組可由下述八套引物組中的任一引物組組成，每套引物組包括二對(duì)特異性引物即內(nèi)引物、外引物組成；在反應(yīng)中預(yù)先加入鈣黃綠素錳絡(luò)合物，錳與dNTP析出的焦磷酸跟離子結(jié)合，釋放出鈣黃綠素，可通過肉眼觀察鑒定，陽性結(jié)果為黃綠色，陰性結(jié)果為淺黃色。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102121049SQ20101001729
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者吳敏, 周生, 唐修君, 唐夢(mèng)君, 張小燕, 施祖灝, 葛慶聯(lián), 蒲俊華, 高玉時(shí) 申請(qǐng)人:唐夢(mèng)君, 江蘇省家禽科學(xué)研究所, 高玉時(shí)