專利名稱：改造真菌次級(jí)代謝的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌次級(jí)代謝功能改造相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具體涉及利用超聲波和卡那霉 素改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，以及該技術(shù)方法用于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化 和篩選獲取抗腫瘤活性突變株并供藥源活性產(chǎn)物研究的用途。
背景技術(shù)：
微生物產(chǎn)物是新藥及其先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要來源，而可分離培養(yǎng)微生物迄今一直 是微生物藥物及其先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的主要來源和主流研發(fā)資源。通常，在可分離培養(yǎng)微生物的藥 源菌株資源常規(guī)研發(fā)過程中，分離得到的絕大多數(shù)菌株往往因無活性而不能直接用于藥源 活性產(chǎn)物研究，因而被大量閑置或被選擇銷毀，造成前期投入的極大浪費(fèi)和菌株資源開發(fā) 利用效率嚴(yán)重低下。因此，如何將大量閑置無用的無活性菌株有效轉(zhuǎn)化成活性菌株從而拓 展藥源微生物資源已成為重要研究課題。近幾年微生物基因組學(xué)研究結(jié)果表明，微生物基因組序列所含次級(jí)代謝產(chǎn)物 生合成基因簇或基因遠(yuǎn)比其已知生產(chǎn)的產(chǎn)物多(如文獻(xiàn)S.D.Bentley，et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomycescoelicolor A3 (2). Nature, 2002,417 :141-147 ；文獻(xiàn) H. Ikeda, et al. Completegenome sequence and comparative analysis of the industrialmicroorganism Streptomyces avermitilis. Nat Biotechnol, 2003, 21 (5) :526_531 ；文獻(xiàn) M. Oliynyk, et al. Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Sacchropolyspora erthraea NRRL23338. Nat Biotechnol,2007(4) :447_453 ；文獻(xiàn) Y.Ohnishi, et al.Genome sequenceof the streptomycin-producing microorganism Streptomyces griseus IF013350. J Bcteriol, 2008,190(11) :4050-4060等所記載)，因而具備合成更多次級(jí)產(chǎn)物的潛在能力(參見 文獻(xiàn) S. Donadio, et al. Impact of the firstStreptomyces genome sequence on the discovery and production ofbioactive substances. Appl Microbiol Biotechnol, 2002,60 :377_380 以及文獻(xiàn) H. B. Bode, et al. The impact of bacterial genomics on natural productresearch. Angew Chem Int Ed，2005，44 (12) :6828_6846 所記述相關(guān)內(nèi) 容)。因此，無活性菌株具有轉(zhuǎn)化成活性菌株的基因組基礎(chǔ)，只要所采用的方法得當(dāng)，完全有 可能實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化并從中發(fā)現(xiàn)藥源活性化合物，從而拓展藥源微生物新菌株資源。這也正 是下述無活性放線菌具有活性化轉(zhuǎn)化潛能的基因組基礎(chǔ)，而核糖體工程技術(shù)則是激發(fā)放線 菌這種潛能的一種簡便有效手段。微生物核糖體具有調(diào)控次級(jí)代謝的功能，通過干預(yù)和改變核糖體這些功能，可 改造微生物次級(jí)代謝，從而挖掘利用微生物的相關(guān)有用潛能。核糖體工程(參見文獻(xiàn) K. Ochi, et al. Ribosome engineering and secondarymetabolite production. Advan Appl Microbiol，2004，56 :155_184 以及文獻(xiàn) Ochi K. From microbial differentiation to ribosome engineering. BiosciBiotechnol Biochem，2007，71 (6) :1373_1386 記載)相 關(guān)研究表明，無活性放線菌野生菌株可通過抗生素抗性篩選轉(zhuǎn)化為活性突變株(參見文獻(xiàn)“于志斌，等.利用核糖體工程技術(shù)開拓海洋微生物藥用資源的研究.高技術(shù)通訊，2005， 15(5) :87-90”以及文獻(xiàn)“孫玉雯，等.海洋微生物的分離培養(yǎng)及其野生型與突變型抗腫瘤 活性菌株的篩選.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32 (6) :532-536”的相關(guān)內(nèi)容)，而轉(zhuǎn)化獲取 的活性突變株可用于突變株新產(chǎn)藥源活性產(chǎn)物研究，從而有效拓展微生物藥源活性新菌株 資源(參見文獻(xiàn)“于志彬，等.用核糖體工程技術(shù)二次開發(fā)海洋微生物菌株資源的研究.高 技術(shù)通訊，2006，16 (11) :1190-1194”以及文獻(xiàn)“韓曉，等.放線菌野生株代謝功能的核糖體 工程改造與新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物研究.國際藥學(xué)研究雜志，2009，36(6) :435-442&446”中 相關(guān)內(nèi)容)。真菌是核糖體工程研究至今尚未觸及的一類微生物，不僅與核糖體功能相關(guān)真菌 核糖體工程研究至今未見文獻(xiàn)報(bào)道，而且有關(guān)無活性真菌野生株的活性化轉(zhuǎn)化相關(guān)研究尤 其是有關(guān)本發(fā)明涉及的利用超聲波和卡那霉素改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法及 其用于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤活性突變株并用于篩選藥源活性產(chǎn)物 的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的真菌次級(jí)代謝功能改造相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和/或方 法。本發(fā)明人曾嘗試采用常規(guī)核糖體工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，選用作用于核糖體的各種抗生素， 對真菌探索開展了改造次級(jí)代謝功能相關(guān)抗性篩選實(shí)驗(yàn)。但由于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，作用 于核糖體的抗生素?zé)o法透過真菌細(xì)胞壁進(jìn)入到作用部位，因此利用常規(guī)的核糖體工程抗性 篩選方法，根本無法篩選得到次級(jí)代謝功能獲得改造的真菌抗生素抗性突變株。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過系統(tǒng)考查冷凍、高溫、超聲、微波、pH、乙酸乙酯、丙酮、 DMS0、甲醇、乙醇、丁醇等多種理化學(xué)因素對真菌細(xì)胞壁膜通透性的影響以及組合鏈霉素、 氯霉素、新霉素、利福平、慶大霉素、卡那霉素等多種抗生素和(或)亞硝基胍(NTG)、硫酸 二乙酯(DES)、超聲、微波、紫外等多種物理化學(xué)誘變因子共同作用對真菌次級(jí)代謝的影響， 摸索到了可人為改造真菌次級(jí)代謝的組合實(shí)驗(yàn)條件，并建立了利用超聲波和卡那霉素改造 真菌次級(jí)代謝功能的相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。同時(shí)，利用該實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，成功轉(zhuǎn)化無活性真菌 野生菌株，高效篩選獲得了具有抗腫瘤活性的活性突變株，同時(shí)還研究闡明了活性突變株 新產(chǎn)活性產(chǎn)物。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，本發(fā)明有關(guān)改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方 法可用于有效改造無活性真菌野生株的次級(jí)代謝功能，并從中高效轉(zhuǎn)化獲取藥源活性突變 株，從而有效拓展真菌藥源活性新菌株資源，同時(shí)通過系統(tǒng)闡明突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物，還可 以深入開發(fā)利用真菌藥源活性新產(chǎn)物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。概括地說，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)項(xiàng)目1、一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在水混懸液狀 態(tài)下超聲波處理0. 5分鐘 5小時(shí)(例如0. 5分鐘 4小時(shí)，例如0. 5分鐘 3小時(shí)，例 如0. 5分鐘 2小時(shí)，例如0. 5分鐘 1小時(shí)；例如1分鐘 5小時(shí)，例如5分鐘 5小時(shí)， 例如10分鐘 5小時(shí)，例如20分鐘 5小時(shí)，例如30分鐘 5小時(shí)，例如45分鐘 5小 時(shí)，例如1小時(shí) 5小時(shí)，例如1小時(shí) 4小時(shí)，例如1小時(shí) 3小時(shí)，例如1小時(shí) 2小 時(shí))，再將超聲波處理后的菌懸液置于0 8°C溫度下(例如0 8°C，例如0 6°C，例如 0 5°C，例如0 4°C ；例如1 8°C，例如2 8°C，例如3 8°C，例如3 7°C，例如3 60C，例如3 5°C，例如約4°C，例如在約4°C冰箱中)處理2 50天(例如2 45天，例 如2 40天，例如2 35天，例如2 30天，例如2 25天；例如3 50天，例如5 50 天’例如7 50天，例如10 50天，例如15 50天，例如18 50天；例如3 45天，例 如5 40天，例如10 30天，例如15 25天，例如約18天、約19天、約20天、約21天、 約22天，特別是例如約20天)的期間，并在該期間適時(shí)取樣(例如，取樣間隔可以為1小 時(shí) 20天，例如約1小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約15小時(shí)、約20小時(shí)、約1天、約2天、約 3天、約5天、約10天、約15天、約20天的間隔)，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與 分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。項(xiàng)目2、一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在含有1 1000mg/mL (例如 1 800mg/mL，例如 1 600mg/mL，例如 1 500mg/mL，例如 1 400mg/ mL,例如 1 300mg/mL,例如 1 200mg/mL,例如 1 200mg/mL ；例如 1 1000mg/mL,例 如 2 800mg/mL,例如 5 600mg/mL,例如 10 500mg/mL,例如 15 250mg/mL ；例如 2 750mg/mL，例如 5 500mg/mL，例如 10 250mg/mL，例如 15 100mg/mL 或 15 75mg/mL 或 2 50mg/mL ；例如約 2mg/mL、約 5mg/mL、約 10mg/mL、約 15mg/mL、約 20mg/mL、約 25mg/ mL、約 30mg/mL、約 40mg/mL、約 50mg/mL、約 60mg/mL、約 75mg/mL、約 100mg/mL,例如 20 或 50mg/mL)卡那霉素的水混懸液狀態(tài)下于0 8°C溫度下(例如0 8°C，例如0 6°C，例 如0 5°C，例如0 4°C ；例如1 8°C，例如2 8°C，例如3 8°C，例如3 7°C，例如 3 6°C，例如3 5°C，例如約4°C，例如在約4°C冰箱中)處理2 50天(例如2 45 天，例如2 40天，例如2 35天，例如2 30天，例如2 25天；例如3 50天，例如 5 50天，例如7 50天，例如10 50天，例如15 50天，例如18 50天；例如3 45天，例如5 40天，例如10 30天，例如15 25天，例如約18天、約19天、約20天、 約21天、約22天，特別是例如約20天)的期間，并在該期間適時(shí)取樣(例如，取樣間隔可 以為1小時(shí) 20天，例如約1小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約15小時(shí)、約20小時(shí)、約1天、 約2天、約3天、約5天、約10天、約15天、約20天的間隔)，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌 落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。項(xiàng)目3、一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在含有1 1000mg/mL (例如 1 800mg/mL，例如 1 600mg/mL，例如 1 500mg/mL，例如 1 400mg/ mL,例如 1 300mg/mL,例如 1 200mg/mL,例如 1 200mg/mL ；例如 1 1000mg/mL,例 如 2 800mg/mL,例如 5 600mg/mL,例如 10 500mg/mL,例如 15 250mg/mL ；例如 2 750mg/mL，例如 5 500mg/mL，例如 10 250mg/mL，例如 15 100mg/mL 或 15 75mg/mL 或 2 50mg/mL ；例如約 2mg/mL、約 5mg/mL、約 10mg/mL、約 15mg/mL、約 20mg/mL、約 25mg/ mL、約 30mg/mL、約 40mg/mL、約 50mg/mL、約 60mg/mL、約 75mg/mL、約 100mg/mL,例如 20 或 50mg/mL)卡那霉素的水混懸液狀態(tài)下首先超聲波處理0. 5分鐘 5小時(shí)(例如0. 5分鐘 4小時(shí)，例如0. 5分鐘 3小時(shí)，例如0. 5分鐘 2小時(shí)，例如0. 5分鐘 1小時(shí)；例如1分 鐘 5小時(shí)，例如5分鐘 5小時(shí)，例如10分鐘 5小時(shí)，例如20分鐘 5小時(shí)，例如30 分鐘 5小時(shí)，例如45分鐘 5小時(shí)，例如1小時(shí) 5小時(shí)，例如1小時(shí) 4小時(shí)，例如1 小時(shí) 3小時(shí)，例如1小時(shí) 2小時(shí))，再將超聲處理后的菌懸液置于0 8°C溫度下(例 如0 8°C，例如0 6°C，例如0 5°C，例如0 4°C ；例如1 8°C，例如2 8°C，例如 3 8°C，例如3 7°C，例如3 6°C，例如3 5°C，例如約4°C，例如在約4°C冰箱中)處理2 50天(例如2 45天，例如2 40天，例如2 35天，例如2 30天，例如2 25天；例如3 50天，例如5 50天，例如7 50天，例如10 50天，例如15 50天， 例如18 50天；例如3 45天，例如5 40天，例如10 30天，例如15 25天，例如 約18天、約19天、約20天、約21天、約22天，特別是例如約20天)的期間，并在該期間適 時(shí)取樣(例如，取樣間隔可以為1小時(shí) 20天，例如約1小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約15 小時(shí)、約20小時(shí)、約1天、約2天、約3天、約5天、約10天、約15天、約20天的間隔)，經(jīng) PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。項(xiàng)目4、改造真菌(例如真菌野生菌株，例如無活性的真菌野生菌株)的次級(jí)代謝 功能并從中篩選獲取抗腫瘤活性突變株的方法，其特征是，用項(xiàng)目1至3任一項(xiàng)所述方法首 先獲得次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株，再經(jīng)突變株的抗腫瘤活性篩選，獲得活性突變株。項(xiàng)目5、項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的真菌突變株新產(chǎn) 活性產(chǎn)物的快速分離純化制備方法，其特征是，分別發(fā)酵原始菌及其活性突變株，對所得發(fā) 酵物用丙酮水溶液(例如丙酮體積百分?jǐn)?shù)為30 95%、或?yàn)?5 90%、或?yàn)?0 85%、 或?yàn)?0 85%、或?yàn)?5 80%、或?yàn)?0% 80%的丙酮水溶液)提取，然后對該含水丙 酮提取液減壓回收丙酮，然后將殘留水層用乙酸乙酯萃取，分別獲得原始菌乙酸乙酯萃取 物和含有突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的突變株乙酸乙酯萃取物，然后對突變株乙酸乙酯萃取物的 每一步分離操作均采用活性跟蹤與化學(xué)檢測分析結(jié)合、微量預(yù)試先導(dǎo)一放大實(shí)驗(yàn)制備的實(shí) 驗(yàn)?zāi)Ｊ?，通過與所述原始菌樣品直接比較對照，從突變株發(fā)酵物樣品中快速跟蹤分離原始 菌樣品中沒有的突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的原始菌例如是G59。項(xiàng)目6、項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的真菌活性突變株 用于制備突變株新產(chǎn)藥源活性化合物的用途。項(xiàng)目7、項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法在用于轉(zhuǎn)化無活性真菌野生株的次級(jí)代謝功 能，從而將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源以有效拓展藥源活性新菌株資源的用途。項(xiàng)目8、項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的突變株?；蛘撸?項(xiàng)目8’、項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改良的突變株。項(xiàng)目9、說明書的全部實(shí)施例任一項(xiàng)所述的方法、過程、試驗(yàn)條件、檢測方法、檢測 條件、所用菌株、獲得的突變株、次級(jí)代謝產(chǎn)物、以及項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的式I 化合物或式II化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法、過程、試驗(yàn)條件、檢測方法、檢測條 件、所用菌株、獲得的突變株、次級(jí)代謝產(chǎn)物、以及項(xiàng)目1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的式I化 合物或式II化合物如說明書所述。下面對本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文 獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和 短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和 短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表 述的含義為準(zhǔn)。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及用超聲波改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，其特 征是，將原始真菌在水混懸液狀態(tài)下超聲波處理0. 5 60分鐘，再將超聲處理后的菌懸液 置于4°C冰箱中處理20天，并在期間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用卡那霉素改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，其 特征是，將原始真菌在含有20或50mg/mL卡那霉素的水混懸液狀態(tài)下于4°C冰箱中處理20 天，并在期間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代 謝功能獲得改造的突變株。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及組合利用超聲波和卡那霉素改造真菌次級(jí)代謝功能的 實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，其特征是，將原始真菌在含有20或50mg/mL卡那霉素的水混懸液狀態(tài)下首 先超聲波處理0. 5 60分鐘，再將超聲處理后的菌懸液置于4°C冰箱中處理20天，并在期 間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲 得改造的突變株。本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及改造真菌(例如真菌野生菌株，例如無活性的真菌野生 菌株)的次級(jí)代謝功能并從中篩選獲取抗腫瘤活性突變株的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，其特征是，利 用上述本發(fā)明的第一方面至第三個(gè)方面所涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首先獲得次級(jí)代謝功能獲得改 造的突變株，再經(jīng)突變株的抗腫瘤活性篩選，獲得活性突變株。本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及活性突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)與可快速分離提 純的突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的制備方法。所述可快速分離提純的方法是，采用活性跟蹤與化 學(xué)檢測分析結(jié)合、微量預(yù)試先導(dǎo)-放大實(shí)驗(yàn)制備的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑ㄟ^將突變株發(fā)酵產(chǎn)物與原 始菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行直接對照比較，在微量預(yù)試快速確定突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的TLC斑點(diǎn)或 HPLC洗脫峰的基礎(chǔ)上，經(jīng)TLC或HPLC指導(dǎo)下的放大實(shí)驗(yàn)制備，快速分離提純原始菌發(fā)酵物 中沒有的突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物。所述新產(chǎn)活性產(chǎn)物的制備方法是，通過活性突變株的發(fā)酵培養(yǎng)與發(fā)酵物的含水丙 酮提取和減壓回收丙酮，獲得含有新產(chǎn)活性產(chǎn)物的水混懸液，再用分離手段，純化制備其中 所含突變株新產(chǎn)活性化合物。所述含水丙酮是60% 90% (ν/ν)的含水丙酮，所述分離手 段包括天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人士所熟知的液_液萃取、柱層析、薄層層析、高效液相層 析及重結(jié)晶等。本發(fā)明采用人白血病細(xì)胞Κ562，用MTT法測試評(píng)價(jià)了原始菌及其突變株發(fā)酵提取 樣品以及所得化合物的抗腫瘤活性，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法由無活性真菌 野生株轉(zhuǎn)化獲取的活性突變株樣品及其新產(chǎn)活性化合物有明顯的抗腫瘤活性，從而實(shí)驗(yàn)證 實(shí)了，本發(fā)明的利用超聲波和卡那霉素改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法可用于無活 性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤活性突變株并供藥源活性產(chǎn)物研究，因而具有有效 拓展真菌藥源活性新菌株資源的用途。如本文使用的，術(shù)語“次級(jí)代謝”具有本領(lǐng)域公知的含義，例如是指在一定的生長 時(shí)期(例如是在穩(wěn)定生長期)，微生物以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體合成的對微生物本身的生命 活動(dòng)沒有明確功能的物質(zhì)的過程。如本文使用的，術(shù)語“原始真菌”具有本領(lǐng)域公知的含 義，例如是指，包括但不限于，已知真菌、未知真菌、從天然來源的真菌、經(jīng)人工突變的真菌、 有活性真菌、無活性真菌等等；相對于用本發(fā)明方法經(jīng)改造的真菌突變株而言，所述“原始 真菌”可以理解為是該突變株的前體物。本發(fā)明的方法可以有效地用于從一種真菌例如無活性真菌改造成為工業(yè)可用的真菌。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。在以下實(shí)施例中，以下稱為G59的菌株是從采自天津塘沽驢駒河渤海灣潮間帶海 泥樣品(于2004年9月29日清晨4 7時(shí)趁退潮至縱深約5km處的潮間帶采集)分離的 海洋來源真菌野生菌株。所述G59菌株于2009年12月30日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3560，建議的分類命名為產(chǎn)紫 青霉，Penicillium purpurogenum。在以下實(shí)施例中，以下稱為真菌PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成 是葡萄糖2%、瓊脂2%、NaCl 1.5%，用200g/L馬鈴薯的水煮液配制，調(diào)pH 6.0;以下稱 為真菌液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成是葡萄糖2%、麥芽糖1%、甘露醇2%、谷氨酸1%、蛋白 胨0.5%、酵母浸粉0.3%，用200g/L馬鈴薯的水煮液配制，調(diào)pH 6.0。^MM 1. G59軺聲i秀奪突奪株的篩詵獲取欠級(jí)產(chǎn)物檢測丨么1 斤真菌原始菌株G59的菌懸液制備取原始菌G59適量，接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)活化3 10天，待孢子形 成，刮取孢子適量，置于裝有IOmL無菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，震蕩打碎分散孢子，即 成孢子懸浮液。取該懸浮液100 μ L，置于96孔板中，用酶標(biāo)儀監(jiān)測600nm波長下的OD值， 用無菌水稀釋至OD值達(dá)0. 35。按照酶標(biāo)儀監(jiān)測下的稀釋倍數(shù)，用無菌水將全部孢子懸液同 倍比稀釋，獲得原始菌G59的菌懸液。G59的超聲誘變突變株篩選超聲誘變采用天津雙龍責(zé)任有限公司產(chǎn)CX-300型超聲清洗機(jī)，工作頻率為 30 士 2kHz，工作功率為300W。將原始菌G59的菌懸液7份各2mL,分別超聲0. 5、1. 0、1. 5、5、10、30、60分鐘，并將
超聲處理后的菌懸液進(jìn)一步分別置于4°C冰箱中處理20天。期間，在被處理第1小時(shí)、第 1、3、6、10、20天，取被處理菌懸液各90 μ L，分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)5天。在培養(yǎng)過程中每天觀察被試菌的生長情況，待菌落形成，適時(shí)挑取形態(tài)、菌體色澤 或產(chǎn)物顏色等不同的單菌落，用PDA平板培養(yǎng)基反復(fù)劃線培養(yǎng)、分離純化，直至分離得到純 菌株。所得突變株接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，4°C冰箱中保存并適時(shí)傳代。發(fā)酵培養(yǎng)與提取制備原始菌G59及其突變株的發(fā)酵培養(yǎng)均采用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將各菌株適量分 別接種于含有200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng) 10 15天，根據(jù)微生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液 體積的丙酮，使丙酮的體積百分含量達(dá)約66 %，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至 不含丙酮，用等體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突變 株的發(fā)酵提取樣品。突變株與原始菌形態(tài)比較將原始菌G59及其突變株分別劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 7天，肉眼觀察菌落形狀、菌體色澤、產(chǎn)生色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況等形態(tài)與外觀 特征。
次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測分析樣品溶液配制稱取G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用甲醇分別配成IOmg/ mL的樣品溶液，供次級(jí)產(chǎn)物檢測分析使用。薄層色譜條件薄層色譜采用青島海洋化工有限公司產(chǎn)硅膠GF254薄層板 (20cmX IOcmX 0. 25mm)，斑點(diǎn)采用254或365nm紫外線照射、硫酸鈰鉬酸銨試劑噴灑加熱或 噴灑三氯化鐵試劑顯色檢測。點(diǎn)樣用G59及其突變株發(fā)酵提取樣品的上述lOmg/mL甲醇 溶液，展開劑分別采用環(huán)己烷-丙酮(3 1、1 1、1 2)、氯仿-甲醇(20 1、9 1、 8 2、7 3) ,bp 60 90°C石油醚-丙酮(5 1、2 1、1 1、1 3) ,bp 60 90°C石 油醚-氯仿(4 1、2 1、1 1、1 2)、氯仿-丙酮(9 1、7 1、5 1、1 1)或氯 仿-甲醇-氨水(27 6 1、90 10 2)等。色譜實(shí)驗(yàn)方法各薄層板均采用同一根毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)上相同體積的G59及其突 變株發(fā)酵提取樣品溶液，各薄層板均點(diǎn)上原始菌G59的樣品作為對照，待所點(diǎn)樣品溶液斑 點(diǎn)的溶劑充分揮干，置于用相應(yīng)展開劑預(yù)飽和并裝有適量展開劑的層析缸中，采用斜立薄 層板展開方式進(jìn)行薄層色譜層析分離。展開結(jié)束即刻取出薄層板，待溶劑揮干，采用上述顯 色方式檢測薄層斑點(diǎn)，比較分析各突變株與原始菌G59以及各突變株之間次級(jí)產(chǎn)物薄層斑 點(diǎn)的差異，判斷是否為突變株新產(chǎn)次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)以及是否為不同突變株之間重復(fù)檢測到的 相同斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果G59的超聲誘變突變株篩選獲取原始菌G59經(jīng)上述超聲誘變處理后在PDA平板 上生長受到明顯抑制，形成為數(shù)有限、形態(tài)不同的菌落，可以挑取單菌落。因此，經(jīng)超聲和低 溫處理不同時(shí)間后的單菌落挑選與分離純化實(shí)驗(yàn)，篩選獲得了 G59的超聲誘變突變株共38 株，具體結(jié)果詳見表1。表1 G59的超聲誘變突變株篩選獲取統(tǒng)計(jì)結(jié)果
超聲時(shí)間低溫處理不同時(shí)間取樣獲取突變林?jǐn)?shù)突變林?jǐn)?shù)
(rain) 1小時(shí) 1天 3天 6天 10天 20天 合計(jì) 突變株與原始菌形態(tài)、外觀特征所獲取突變株無論在突變株之間還是與原始菌 G59相比，所形成菌落的形態(tài)、表面形狀與顏色，菌體色澤，產(chǎn)色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況 等外觀形態(tài)特征均有明顯差異。發(fā)酵提取樣品中次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測經(jīng)對38株突變株與原始菌G59發(fā)酵樣品的薄層色譜分析，從大多突變株發(fā)酵樣品中檢測到原始菌G59發(fā)酵樣品中沒有的次級(jí)產(chǎn) 物斑點(diǎn)，特別地，從下述實(shí)施例2中所述14株抗腫瘤活性突變株尤其是10株高活性抗腫瘤 活性突變株發(fā)酵樣品中均檢測到原始菌G59發(fā)酵樣品中沒有的且在各突變株樣品之間呈 現(xiàn)不同層析行為的次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述對G59的超聲誘變實(shí)驗(yàn)已改變了所獲大多突變株的次級(jí) 代謝功能，使次級(jí)產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的超聲誘變實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以用于 人為改造真菌的次級(jí)代謝功能。實(shí)施仿I丨2. G59的軺聲i秀奪杭腫瘤活t牛突奪株的f帝詵獲取實(shí)驗(yàn)菌株原始菌G59以及在上述實(shí)施例1中通過超聲誘變實(shí)驗(yàn)得到的38株G59的超聲誘
變突變株。發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備發(fā)酵培養(yǎng)與樣品提取制備將原始菌G59與其突變株菌體適量分別接種于含有 200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵10 15天，根據(jù)微 生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液體積的丙酮(丙酮 的體積百分含量達(dá)約66 % )，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，用等體 積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突變株的發(fā)酵提取樣
P
ΡΠ O活性測試用樣品溶液的配制精密稱量G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用 甲醇分別配成lOOmg/mL和10mg/mL的樣品溶液，供篩選抗腫瘤活性?？鼓[瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與傳代維護(hù)人白血病K562細(xì)胞用含10%胎牛血清和青霉素與鏈霉素 各100 μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37°C通入5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 和傳代維護(hù)?；钚詼y試方法收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基，配制成 細(xì)胞密度為2 X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μ L。將接種后的細(xì)胞于 37°C、通入5%的CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，每孔加2 μ L樣品溶液，每個(gè)樣 品溶液設(shè)三個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)三孔陰性對照。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后首先在光學(xué) 顯微鏡下觀察藥物處理后引起的細(xì)胞形態(tài)變化，判斷有無細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死或細(xì)胞異形 等形態(tài)特征，必要時(shí)拍照，繼而每孔加入20 μ L MTT溶液(用0. OlM的PBS液配制的5mg/mL 的MTT溶液)，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)箱中孵育4h。2000rpm離心lOmin，吸去孔內(nèi)上清液。每 孔加150 μ L DMS0,振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，利用酶標(biāo)儀在570nm處測定每孔溶液 的OD值?？瞻讓φ蘸蜆悠方M均分別取平均OD值，按如下公式計(jì)算樣品對細(xì)胞增殖的抑制
率抑制率％= (OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照X 100%。必要時(shí)，相同試驗(yàn)分別獨(dú)立進(jìn)行三次，求算不同濃度樣品對細(xì)胞增殖的平均抑制 率，再利用Bliss法計(jì)算被試樣品的半數(shù)抑制濃度IC5(I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果原始菌樣品的活性測試結(jié)果原始菌G59樣品即使在1000 μ g/mL的高濃度下對K562細(xì)胞也不顯示任何抗腫瘤活性，1000 μ g/mL和100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率 分別為實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)的6. 9%和4.8%。經(jīng)數(shù)次反復(fù)傳代，在用不同傳代次數(shù)的菌株從發(fā) 酵培養(yǎng)開始獨(dú)立進(jìn)行的反復(fù)的活性篩選中，G59樣品1000 μ g/mL或100 μ g/mL對K562細(xì) 胞的抑制率均在小于6. 9%的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)波動(dòng)。突變株樣品的活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)對38株突變株樣品的抗腫瘤活性篩選，對 K562細(xì)胞有抗腫瘤作用的共有14株，其中100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率在30% 40%之間的活性突變株4株、抑制率大于40%的高活性突變株10株，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表 2。表2 G59的超聲誘變突變株對K562細(xì)胞的抗腫瘤活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系根據(jù)100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性測試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)檢測結(jié)果顯微鏡下觀測到，K562細(xì)胞經(jīng)原始菌G59樣品 1000 μ g/mL和100 μ g/mL或除14株活性菌株以外的無活性突變株樣品100 μ g/mL處理24 小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，呈與空白對照細(xì)胞相同的形態(tài)特征，表明這些樣品對K562細(xì) 胞無影響。而經(jīng)14株具有抗腫瘤活性的活性突變株樣品尤其是高活性突變株樣品100 μ g/ mL處理24小時(shí)后，有些樣品處理的部分細(xì)胞的形態(tài)則與空白對照細(xì)胞相比發(fā)生了顯著變 化，有些呈胞體膨脹、細(xì)胞膜昏暗膨大、細(xì)胞質(zhì)凝縮、部分胞膜破裂等典型的壞死性細(xì)胞形 態(tài)特征，有些呈散碎的胞膜裹著的細(xì)胞碎片或雪花瓣?duì)畹鹊湫偷牡蛲黾?xì)胞形態(tài)特征，而有 些則呈棒狀或2聯(lián)3聯(lián)細(xì)胞體等異型形狀，與下述MTT法活性測試結(jié)果吻合。活性突變株的MTT法活性測試結(jié)果對所獲取的原始菌G59的38株超聲誘變突變 株，全部都分別進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)與發(fā)酵樣品的提取制備，并在此基礎(chǔ)上利用所制備樣品，采 用MTT法，測試評(píng)價(jià)了全部樣品100 μ g/mL對K562細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)果表明，在所獲 取的38株突變株中，14株為抗腫瘤活性突變株，其中100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率 大于40%的有10株、抑制率在30% 40%之間的有4株，活性測試結(jié)果詳見表3。表3 G59及其超聲誘變突變株樣品的MTT法抗腫瘤活性測試結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性測試結(jié)果以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及上述實(shí)施例1中所述原始菌G59及其突變株次級(jí)產(chǎn)物的薄層色 譜檢測分析結(jié)果表明，本發(fā)明的上述14株活性突變株已代謝產(chǎn)生了無活性原始真菌野生 株G59所不生產(chǎn)的具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的超聲誘變 實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法可以成功改造無活性真菌野生株的代謝功能，并從中高效篩選獲得抗腫瘤活 性突變株，因而具有將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓展藥源活性新菌株資源 的實(shí)際利用價(jià)值。實(shí)施例3. G59的自發(fā)突變卡那霉素抗件突變株的篩詵獲取與次級(jí)產(chǎn)物檢測分析真菌原始菌株G59的菌懸液制備取原始菌G59適量，接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)活化3 10天，待孢子形 成，刮取孢子適量，置于裝有IOmL無菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，震蕩打碎分散孢子，即 成孢子懸浮液。取該懸浮液100 μ L，置于96孔板中，用酶標(biāo)儀監(jiān)測600nm波長下的OD值， 用無菌水稀釋至OD值達(dá)0. 35。按照酶標(biāo)儀監(jiān)測下的稀釋倍數(shù)，用無菌水將全部孢子懸液同 倍比稀釋，獲得原始菌G59的菌懸液。G59自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株篩選取原始菌G59的菌懸液2份各2mL，加適量卡那霉素，配制分別含卡那霉素20mg/ mL和50mg/mL的菌懸液，作被處理菌懸液。將該被處理菌懸液置于4°C冰箱中處理20天。 期間在被處理第1小時(shí)、第1、3、6、10、20天，取被處理菌懸液各90 μ L，分別涂布于PDA固 體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。在培養(yǎng)過程中每天觀察被試菌的生長情況，待菌落 形成，適時(shí)挑取形態(tài)、菌體色澤或產(chǎn)物顏色等不同的單菌落，用PDA平板培養(yǎng)基反復(fù)劃線培養(yǎng)、分離純化，直至分離得到純菌株。所得突變株接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，4°C冰箱中 保存并適時(shí)傳代。發(fā)酵培養(yǎng)與提取制備原始菌G59及其突變株的發(fā)酵培養(yǎng)均采用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將各菌株適量分 別接種于含有200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng) 10 15天，根據(jù)微生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液 體積的丙酮，使丙酮的體積百分含量達(dá)約66 %，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至 不含丙酮，用相同體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突 變株的發(fā)酵提取樣品。突變株與原始菌形態(tài)比較將原始菌G59及其突變株分別劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 7天，肉眼觀察菌落形狀、菌體色澤、產(chǎn)生色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況等形態(tài)與外觀 特征。次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測分析樣品溶液配制稱取G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用甲醇分別配成IOmg/ mL的樣品溶液，供次級(jí)產(chǎn)物檢測分析使用。薄層色譜條件采用與上述實(shí)施例1完全相同的薄層色譜條件。色譜實(shí)驗(yàn)方法采用與上述實(shí)施例1完全相同的色譜實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)薄層展開和薄 層斑點(diǎn)的顯色檢測，比較分析各突變株與原始菌G59以及各突變株之間次級(jí)產(chǎn)物薄層斑點(diǎn) 的差異，判斷是否為突變株新產(chǎn)次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)以及是否為不同突變株之間重復(fù)檢測到的相 同斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果G59自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株的篩選獲取原始菌G59經(jīng)上述處理后在PDA 平板上生長受到明顯抑制，形成為數(shù)有限、形態(tài)不同的菌落，可以挑取單菌落。因此，經(jīng)在 不同濃度卡那霉素作用下低溫處理不同時(shí)間后的單菌落挑選與分離純化實(shí)驗(yàn)，篩選獲得了 G59的自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株共20株，具體結(jié)果詳見表4。表4 G59的自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果 突變株與原始菌形態(tài)、外觀特征所獲取突變株無論在突變株之間還是與原始菌 G59相比，所形成菌落的形態(tài)、表面形狀與顏色，菌體色澤，產(chǎn)色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況 等外觀形態(tài)特征均有明顯差異。發(fā)酵提取樣品中次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測經(jīng)對20株突變株與原始菌G59發(fā)酵樣品的薄層色譜分析，從大多突變株發(fā)酵樣品中檢測到原始菌G59發(fā)酵樣品中沒有的次級(jí)產(chǎn) 物斑點(diǎn)，特別地，從下述實(shí)施例4中所述7株抗腫瘤活性突變株發(fā)酵樣品中均檢測到原始菌 G59發(fā)酵樣品中沒有的且在各突變株樣品之間呈現(xiàn)不同層析行為的次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述對G59的自發(fā)突變卡那霉素抗性篩選已改變了所獲大多 突變株的次級(jí)代謝功能，使次級(jí)產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的卡那霉素抗性 篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以用于人為改造真菌的次級(jí)代謝功能。實(shí)施例4. G59的自發(fā)突變卡那霉素抗件抗腫瘤活件突變株的篩詵獲取實(shí)驗(yàn)菌株原始菌G59以及在上述實(shí)施例3中通過自發(fā)突變抗性篩選實(shí)驗(yàn)得到的20株G59 的卡那霉素抗性突變株。發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備發(fā)酵培養(yǎng)與樣品提取制備將原始菌G59與其突變株菌體適量分別接種于含有 200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵10 15天，根據(jù)微 生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液體積的丙酮(丙酮 的體積百分含量達(dá)約66 % )，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，用相同 體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突變株的發(fā)酵提取樣
P
ΡΠ O活性測試用樣品溶液的配制精密稱量G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用 甲醇分別配成lOmg/mL的樣品溶液，供篩選抗腫瘤活性?？鼓[瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與傳代維護(hù)人白血病K562細(xì)胞用含10%胎牛血清和青霉素與鏈霉素 各100 μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37°C通入5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 和傳代維護(hù)?；钚詼y試方法采用上述實(shí)施例2中所述MTT法抗腫瘤活性篩選方法，測試樣品對 K562細(xì)胞的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果原始菌樣品的活性測試結(jié)果原始菌G59樣品即使在1000 μ g/mL的高濃度下對 K562細(xì)胞也不顯示任何抗腫瘤活性，1000 μ g/mL和100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率 分別為實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)的6. 9%和4.8%。經(jīng)數(shù)次反復(fù)傳代，在用不同傳代次數(shù)的菌株從發(fā) 酵培養(yǎng)開始獨(dú)立進(jìn)行的反復(fù)的活性篩選中，G59樣品1000 μ g/mL或100 μ g/mL對K562細(xì) 胞的抑制率均在小于6. 9%的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)波動(dòng)。突變株樣品的活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)對20株突變株樣品的抗腫瘤活性篩選，對 K562細(xì)胞有抗腫瘤作用的共7株，其中100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率在30 % 40 % 之間的活性突變株2株、抑制率大于40%的高活性突變株5株，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表5。表5自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株的抗腫瘤活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系根據(jù)100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性測試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)檢測結(jié)果顯微鏡下觀測到，K562細(xì)胞經(jīng)原始菌G59樣品 1000 μ g/mL和100 μ g/mL或無活性突變株樣品100 μ g/mL處理24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)無顯著 變化，呈與空白對照細(xì)胞相同的形態(tài)特征，表明這些樣品對K562細(xì)胞無影響。而經(jīng)活性突 變株樣品尤其是高活性突變株樣品100 μ g/mL處理24小時(shí)后，有些樣品處理的部分細(xì)胞的 形態(tài)與空白對照細(xì)胞相比發(fā)生顯著變化，有些呈胞體膨脹、細(xì)胞膜昏暗膨大、細(xì)胞質(zhì)凝縮、 部分胞膜破裂等典型的壞死性細(xì)胞形態(tài)特征，有些呈散碎的薄膜裹著的細(xì)胞碎片或雪花瓣 狀等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征，而有些則呈棒狀或2聯(lián)3聯(lián)細(xì)胞體等異型形狀，與下述MTT 法活性測試結(jié)果吻合?；钚酝蛔冎甑腗TT法活性測試結(jié)果對所獲取的原始菌G59的20株自發(fā)突變卡那 霉素抗性突變株，全部都分別進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)與發(fā)酵樣品的提取制備，并在此基礎(chǔ)上利用 所制備樣品，采用MTT法，測試了全部樣品100 μ g/mL對K562細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)果表 明，在所獲取的20株突變株中7株為抗腫瘤活性突變株，其中100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞 的抑制率大于40%的5株、抑制率在30% 40%之間的2株，活性測試結(jié)果詳見表6。表6 G59及其自發(fā)突變卡那霉素抗性突變株的抗腫瘤活性測試結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性MTT法測試結(jié)果以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及上述實(shí)施例3中所述原始菌G59及其突變株次級(jí)產(chǎn)物的薄層色 譜檢測分析結(jié)果表明，本發(fā)明的上述7株活性突變株已代謝產(chǎn)生了無活性原始真菌野生株 G59所不生產(chǎn)的具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的卡那霉素抗性篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以改造無活性真菌野生株的代謝功能，并從中篩選獲得抗腫瘤活性突變 株，因而具有將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓展藥源活性新菌株資源的實(shí)際 利用價(jià)值。實(shí)施例5. G59的超聲誘變卡那霉素抗件突變株的篩詵獲取與次級(jí)產(chǎn)物檢測分析真菌原始菌株G59的菌懸液制備取原始菌G59適量，接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)活化3 10天，待孢子形 成，刮取孢子適量，置于裝有IOmL無菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，震蕩打碎分散孢子，即 成孢子懸浮液。取該懸浮液100 μ L，置于96孔板中，用酶標(biāo)儀監(jiān)測600nm波長下的OD值， 用無菌水稀釋至OD值達(dá)0. 35。按照酶標(biāo)儀監(jiān)測下的稀釋倍數(shù)，用無菌水將全部孢子懸液同 倍比稀釋，獲得原始菌G59的菌懸液。 G59的超聲誘變卡那霉素抗性突變株篩選超聲誘變采用天津雙龍責(zé)任有限公司產(chǎn)CX-300型超聲清洗機(jī)，工作頻率為 30士2kHz，工作功率為300W。取原始菌G59的菌懸液14份各2mL，加適量卡那霉素，分別配 制含卡那霉素20mg/mL的菌懸液7份和含卡那霉素50mg/mL的菌懸液7份。將含卡那霉素 20mg/mL和50mg/mL的菌懸液各7份分別超聲0. 5,1. 0,1. 5、5、10、30、60分鐘，并將超聲處 理后的菌懸液分別置于4°C冰箱中進(jìn)一步處理20天。期間在被處理第1小時(shí)、第1、3、6、10、 20天，取被處理菌懸液各90 μ L，分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。在 培養(yǎng)過程中每天觀察被試菌的生長情況，待菌落形成后適時(shí)挑取形態(tài)、菌體色澤或產(chǎn)物顏 色等不同的單菌落，用PDA平板培養(yǎng)基反復(fù)劃線培養(yǎng)、分離純化，直至分離得到純菌株。所 得突變株接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，4°C冰箱中保存并適時(shí)傳代。發(fā)酵培養(yǎng)與提取制備原始菌G59及其突變株的發(fā)酵培養(yǎng)均采用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將各菌株適量分 別接種于含有200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng) 10 15天，根據(jù)微生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液 體積的丙酮，使丙酮的體積百分含量達(dá)約66 %，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至 不含丙酮，用相同體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突 變株的發(fā)酵提取樣品。突變株與原始菌形態(tài)比較將原始菌G59及其突變株分別劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 7天，肉眼觀察菌落形狀、菌體色澤、產(chǎn)生色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況等形態(tài)與外觀 特征。次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測分析樣品溶液配制稱取G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用甲醇分別配成IOmg/ mL的樣品溶液，供次級(jí)產(chǎn)物檢測分析使用。薄層色譜條件采用與上述實(shí)施例1完全相同的薄層色譜條件。色譜實(shí)驗(yàn)方法采用與上述實(shí)施例完全相同的色譜實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)薄層展開和薄層 斑點(diǎn)的顯色檢測，比較分析各突變株與原始菌G59以及各突變株之間次級(jí)產(chǎn)物薄層斑點(diǎn)的 差異，判斷是否為突變株新產(chǎn)次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)以及是否為不同突變株之間重復(fù)檢測到的相同 斑點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果G59的超聲誘變卡那霉素抗性突變株的篩選獲取原始菌G59經(jīng)上述處理后在PDA 平板上生長受到明顯抑制，形成為數(shù)有限、形態(tài)不同的菌落，可以挑取單菌落。因此，經(jīng)在不 同濃度卡那霉素存在下不同時(shí)間超聲和低溫處理后的單菌落挑選與分離純化實(shí)驗(yàn)，篩選獲 得了 G59的超聲誘變卡那霉素抗性突變株共71株，具體結(jié)果詳見表7。表7 G59的超聲誘變卡那霉素抗性突變株篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果 突變株與原始菌形態(tài)、外觀特征所獲取突變株無論在突變株之間還是與原始菌 G59相比，所形成菌落的形態(tài)、表面形狀與顏色，菌體色澤，產(chǎn)色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況 等外觀形態(tài)特征均有明顯差異。發(fā)酵提取樣品中次級(jí)產(chǎn)物的薄層色譜檢測經(jīng)對71株突變株與原始菌G59發(fā)酵樣 品的薄層色譜分析，從大多突變株發(fā)酵樣品中檢測到原始菌G59發(fā)酵樣品中沒有的次級(jí)產(chǎn) 物斑點(diǎn)，特別地，從下述實(shí)施例6中所述25株抗腫瘤活性突變株發(fā)酵樣品中均檢測到原始 菌G59發(fā)酵樣品中沒有的且在各突變株樣品之間呈現(xiàn)不同層析行為的次級(jí)產(chǎn)物斑點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述對G59的超聲誘變卡那霉素抗性篩選已改變了所獲大多 突變株的次級(jí)代謝功能，使次級(jí)產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的超聲誘變卡那 霉素抗性篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以用于人為改造真菌的次級(jí)代謝功能。實(shí)施例6. G59的超聲誘變卡那霉素抗件抗腫瘤活件突變株的篩詵獲取實(shí)驗(yàn)菌株原始菌G59以及在上述實(shí)施例5中通過超聲誘變抗性篩選實(shí)驗(yàn)得到的71株G59 的卡那霉素抗性突變株。發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備
發(fā)酵培養(yǎng)與樣品提取制備將原始菌G59與其突變株菌體適量分別接種于含有 200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵10 15天，根據(jù)微 生物生長狀況適時(shí)終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液體積的丙酮(丙酮 的體積百分含量達(dá)約66 % )，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，用相同 體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突變株的發(fā)酵提取樣活性測試用樣品溶液的配制精密稱量G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用 甲醇分別配成lOmg/mL的樣品溶液，供篩選抗腫瘤活性?？鼓[瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與傳代維護(hù)人白血病K562細(xì)胞用含10%胎牛血清和青霉素與鏈霉素 各100 μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37°C通入5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 和傳代維護(hù)?；钚詼y試方法采用上述實(shí)施例2中所述MTT法抗腫瘤活性篩選方法，測試樣品對 K562細(xì)胞的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果原始菌樣品的活性測試結(jié)果原始菌G59樣品即使在1000 μ g/mL的高濃度下對 K562細(xì)胞也不顯示任何抗腫瘤活性，在反復(fù)活性篩選中，1000 μ g/mL或100 μ g/mL的抑制 率均小于6.9%。突變株樣品的活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)對71株突變株樣品的抗腫瘤活性篩選，對 K562細(xì)胞有抗腫瘤作用的共25株，其中100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率在30% 40%之間的活性突變株15株、抑制率大于40%的高活性突變株10株，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表 8。表8超聲誘變卡那霉素抗性突變株的抗腫瘤活性篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系根據(jù)100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性測試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)檢測結(jié)果顯微鏡下觀測到，K562細(xì)胞經(jīng)原始菌G59樣品或無 活性突變株樣品處理24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，呈與空白對照細(xì)胞相同的形態(tài)特征， 表明這些樣品對K562細(xì)胞無影響。而經(jīng)活性突變株樣品100 μ g/mL處理24小時(shí)后，部分 細(xì)胞呈胞體膨脹、細(xì)胞膜昏暗膨大、細(xì)胞質(zhì)凝縮、部分胞膜破裂等典型的壞死性細(xì)胞形態(tài)特 征，有些呈散碎的薄膜裹著的細(xì)胞碎片或雪花瓣?duì)畹鹊湫偷牡蛲黾?xì)胞形態(tài)特征，而有些則 呈棒狀或2聯(lián)3聯(lián)細(xì)胞體等異型形狀?；钚酝蛔冎甑腗TT法活性測試結(jié)果在71株突變株中，25株為抗腫瘤活性突變 株，其中100μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率大于40%的10株、抑制率在30% 40%之 間的15株，活性測試結(jié)果詳見表9。表9 G59及其超聲誘變卡那霉素抗性突變株樣品的抗腫瘤活性測試結(jié)果 本表數(shù)據(jù)系100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制活性MTT法測試結(jié)果以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及上述實(shí)施例5中所述原始菌G59及其突變株次級(jí)產(chǎn)物的薄層色 譜檢測分析結(jié)果表明，本發(fā)明的上述25株活性突變株已代謝產(chǎn)生了無活性原始真菌野生 株G59所不生產(chǎn)的具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的超聲誘變 卡那霉素抗性篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以改造無活性真菌野生株的代謝功能，并從中高效篩選獲得 抗腫瘤活性突變株，因而具有將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓展藥源活性新 菌株資源的實(shí)際利用價(jià)值。
t施例7.G59的軺聲i秀奪杭腫瘤活件突奪株mooupi新產(chǎn)的苯并γ吡_酮類 抗腫瘤活件產(chǎn)物研究實(shí)驗(yàn)菌株原始菌G59以及經(jīng)上述實(shí)施例1中對無活性原始真菌野生株G59的超聲誘變和實(shí) 施例2中對所獲突變株的抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)，篩選獲得的G59的超聲誘變抗腫瘤活性突 變株 N3001dl-1。在反復(fù)活性篩選中，原始菌G59的發(fā)酵粗提樣品對K562細(xì)胞無任何抗腫瘤作用， 1000 μ g/mL或100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率均在小于6. 9%的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)波 動(dòng)，而G59的超聲誘變抗腫瘤活性突變株N3001dl-1的發(fā)酵粗提樣品基本穩(wěn)定重現(xiàn)抗腫瘤 活性，如在上述實(shí)施例2中ΙΟΟμ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率為54. 5%，而在以后的反 復(fù)篩選中100 μ g/mL樣品的抑制率一直大于50%。發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備從保存在4°C冰箱中的PDA試管斜面，取G59的超聲誘變突變株N3001dl_l適量， 劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)5天，刮取PDA平板上新生孢子，用 200mL無菌水配制成孢子懸液。將該孢子懸液每份2mL分別接種到100個(gè)內(nèi)含200mL真菌 液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，28°C、200rpm搖床發(fā)酵15天。將發(fā)酵物(約20L)經(jīng)四層 紗布過濾分為濾液和菌體兩部分。濾液直接用等體積乙酸乙酯萃取3次，得濾液的乙酸乙 酯萃取液。而菌體則加適量70% (ν/ν)丙酮水，超聲破碎菌體提取，濾取含水丙酮，減壓濃 縮蒸去丙酮，殘余水層用等體積乙酸乙酯萃取3次，得菌體提取物的乙酸乙酯萃取液。合并 濾液和菌體來源乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，得突變株N3001dl-1的乙酸乙酯浸膏(16g)， 供在以下實(shí)驗(yàn)中跟蹤分離突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物使用。此外，采用完全相同方法，經(jīng)對G59的 200mL發(fā)酵與提取操作，制得G59的乙酸乙酯浸膏(IOSmg)，供在以下實(shí)驗(yàn)中作為對照使用。突變株N3001dl_l新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物的跟蹤分離在以下實(shí)驗(yàn)中，抗腫瘤活性篩選均采用上述實(shí)施例2中所述完全相同的實(shí)驗(yàn)方 法，測試樣品對K562細(xì)胞的抑制活性。以下所述每一步分離操作均采用抗腫瘤活性篩選與 三氯化鐵試劑噴霧顯色的薄層色譜化學(xué)檢測相結(jié)合、微量預(yù)試先導(dǎo)一放大實(shí)驗(yàn)制備的實(shí)驗(yàn) 模式，通過與原始菌G59樣品直接進(jìn)行對照比較，跟蹤分離原始菌G59樣品中沒有的突變株 N3001dl-1新產(chǎn)酚酸類抗腫瘤活性產(chǎn)物。將突變株N3001dl_l的乙酸乙酯浸膏(16g)用適量乙酸乙酯溶解，加35g硅膠 (100 200目)吸附干燥，添加到裝有105g硅膠(100-200目)的玻璃減壓柱中，用二氯 甲烷-甲醇(100 0-0 100)進(jìn)行減壓梯度洗脫。洗脫液每250mL為一個(gè)流份，共接 86個(gè)流份，再根據(jù)硅膠薄層色譜檢測結(jié)果，合并得到11個(gè)組分Fr-I Fr-Il。其中被二氯 甲烷洗脫的組分Fr-2 (1. 4g)為活性組分，100 μ g/mL對K562細(xì)胞的抑制率為56. 6%。組 分Fr-2(1.4g)用適量二氯甲烷-甲醇(v/v= 1 1)溶解，濕法上在二氯甲烷-甲醇(ν/ν =1:1)中預(yù)裝的S印hadex LH-20柱(柱床2 X 150cm)，用相同溶劑洗脫，根據(jù)薄層檢測 結(jié)果收集洗脫液合并濃縮，得8個(gè)組分Fr-21 Fr-28。將其中有活性的組分Fr_24 (40mg) 在二氯甲烷-甲醇(ν/ν = 1 1)中反復(fù)重結(jié)晶，得到原始菌G59樣品中沒有的突變株 N3001dl-1新產(chǎn)的苯并Y吡喃酮類抗腫瘤活性產(chǎn)物式I化合物(8mg)。 式I式I中阿拉伯?dāng)?shù)字表示標(biāo)位式I化合物的波譜數(shù)據(jù)與抗腫瘤活性式I化合物無色針狀結(jié)晶(二氯甲烷-甲醇)，正離子ESI-MS m/z :231[M+H]+， 253 [M+Na]+。1H-WrgoomHzADCI3) δ 12. 16 (1Η，s，Η0-10)，6· 72 (1Η，br s,H-7) ,6. 62 (1H, br s，H-9)，3· 04(2H，m，H-2)，2· 66(2H，m，H-3)，2· 36(3H，s，H—14)。13C-NMR (1 OOMHz， CDCl3) δ 197. 5 (C-I)，189. 7(C_4)，178. 0(C_12)，161. 8 (C-IO)，156. 3 (C_6)，148. 2(C_8)， 117.9 (C-13), 114. 2 (C_9)，108. 6 (C_l 1)，108. 0 (C_7)，33. 8 (C_2)，26. 1 (C_3)，22. 4 (C-14)。經(jīng)抗腫瘤活性篩選，式I化合物對K562細(xì)胞呈一定抗腫瘤活性，100 μ g/mL的抑制 率為37. 9%。綜上，原始真菌野生株G59的發(fā)酵粗提樣品即使在1000 μ g/mL的高濃度下對K562 細(xì)胞也無任何抑制作用，而G59的超聲誘變突變株N3001dl-1的發(fā)酵粗提樣品對K562細(xì)胞 有顯著抗腫瘤活性，100 μ g/mL對K562細(xì)胞的抑制率達(dá)54. 5%。本實(shí)施例從N3001dl_l的 發(fā)酵物中經(jīng)簡單的幾步提取分離和純化精制操作便分離得到了對K562細(xì)胞有抗腫瘤活性 的突變株N3001dl-1新產(chǎn)的苯并γ吡喃酮類抗腫瘤活性產(chǎn)物式I化合物。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從無活性原始真菌野生株G59的超聲誘變抗腫瘤活性突變株 發(fā)酵物中可以比較容易地快速分離得到活性突變株新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí) 了，本發(fā)明經(jīng)對無活性真菌野生株G59的超聲誘變獲取的抗腫瘤活性突變株可作為活性菌 株新資源用于藥源活性新產(chǎn)物的深入研究，從而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方 法具有將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓展藥源活性新菌株資源的實(shí)際利用 價(jià)值。實(shí)施例9. G59的超聲誘變抗腫瘤活性突變株N3001dl_l新產(chǎn)的生物堿類抗腫瘤活 性產(chǎn)物研究實(shí)驗(yàn)菌株原始菌G59以及經(jīng)上述實(shí)施例1中對無活性原始真菌野生株G59的超聲誘變和實(shí) 施例2中對所獲突變株的抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)，篩選獲得的G59的超聲誘變抗腫瘤活性突 變株 N3001dl-1。在反復(fù)活性篩選中，原始菌G59的發(fā)酵粗提樣品對K562細(xì)胞無任何抗腫瘤作用， 1000 μ g/mL或100 μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率均在小于6. 9%的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)波 動(dòng)，而G59的超聲誘變抗腫瘤活性突變株N3001dl-1的發(fā)酵粗提樣品基本穩(wěn)定重現(xiàn)抗腫瘤 活性，如在上述實(shí)施例2中100μ g/mL樣品對K562細(xì)胞的抑制率為54. 5%，而在以后的反 復(fù)篩選中100 μ g/mL樣品的抑制率一直大于50%。發(fā)酵培養(yǎng)與樣品制備采用上述實(shí)施例8中所述完全相同的方法，經(jīng)活性突變株N3001dl_l的15天搖床發(fā)酵(約20L)和提取操作，得突變株N3001dl-1的乙酸乙酯浸膏(17. 2g)，供在以下實(shí)驗(yàn)中 跟蹤分離突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物使用。此外，采用完全相同方法，經(jīng)對G59的200mL發(fā)酵與提 取操作，制得G59的乙酸乙酯浸膏(IlOmg)，供在以下實(shí)驗(yàn)中作為對照使用。突變株N3001dl_l新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物的跟蹤分離在以下實(shí)驗(yàn)中，抗腫瘤活性篩選均采用上述實(shí)施例2中所述完全相同的實(shí)驗(yàn)方 法，測試樣品對K562細(xì)胞的抑制活性。以下所述每一步分離操作均采用抗腫瘤活性篩選與 碘_碘化鉍鉀試劑噴霧顯色的薄層色譜化學(xué)檢測相結(jié)合、微量預(yù)試先導(dǎo)一放大實(shí)驗(yàn)制備的 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，通過與原始菌G59樣品直接進(jìn)行對照比較，跟蹤分離原始菌G59樣品中沒有的突 變株N3001dl-1新產(chǎn)生物堿類抗腫瘤活性產(chǎn)物。將突變株N3001dl_l的乙酸乙酯浸膏(17. 2g)用適量乙酸乙酯溶解，加36g硅膠 (100 200目)吸附干燥，添加到裝有108g硅膠(100-200目)的玻璃減壓柱中，用二氯甲 烷-甲醇(100 0-0 100)進(jìn)行減壓梯度洗脫。洗脫液每250mL為一個(gè)流份，共接91 個(gè)流份，再根據(jù)硅膠薄層色譜檢測結(jié)果，合并得到共15個(gè)組分Fr-I Fr-15。其中，被二氯 甲燒-甲醇(98 2 — 95 5)洗脫的組分Fr-9(0. 86g)為活性組分，100 μ g/mL對K562細(xì) 胞的抑制率為72.8%。組分Fr-9 (0. 86g)用適量二氯甲烷-甲醇(ν/ν =1:1)溶解，濕 法上在二氯甲烷_甲醇(ν/ν = 1:1)中預(yù)裝的S印hadex LH-20柱(柱床2 X 150cm)，并 用相同溶劑洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果收集洗脫液合并濃縮，分為2個(gè)組分Fr-9-l Fr-9-2。 其中有活性的組分Fr-9-1 (350mg)進(jìn)一步用S印hadexLH-20柱(柱床2X 150cm)進(jìn)行反 復(fù)的層析(二氯甲烷-甲醇v/v= 1 1洗脫)分離和純化，再經(jīng)氯仿中重結(jié)晶精制，得 到原始菌G59樣品中沒有的突變株N3001dl-1新產(chǎn)生物堿類抗腫瘤活性產(chǎn)物式II化合物 (6mg)。 式II式II中阿拉伯?dāng)?shù)字表示標(biāo)位式II化合物的波譜數(shù)據(jù)與抗腫瘤活性式II化合物白色針狀結(jié)晶(氯仿)，[a]D31-151° (c 0. 24，CHCl3)。正離 子 ESI-MS m/z 444 [M+H]+ ；負(fù)離子 ESI-MS m/z :442[Μ_ΗΓ。1H-WrGOOMHz, CDCl3) δ 8. 01 (1Η, br s, H—7)，7. 34-7. 18 (7H, m, H_8，H—10，H—14，H—15，H—16，H—17，H-18)，7. 11 (1H, td, J = 7. 6,0. 8Hz, H-9) ,6. 73 (1H, br s, H-2), 6. 01 (1H, br s，H_5a)，5. 69 (1H，dd, J=17. 4,10. 9Hz, H-20),5. 10 (1H, d, J = 10. 9Hz，Hcis-21)，5.08 (1H，d, J = 17. 4Hz, Htrans-21) ,4. 26 (1H, dd, J = 8. 1,3. IHz, H_3)，3· 73 (1Η, dd, J = 11. 9,5. OHz, H-Ila)， 3. 39 (1Η, dd, J = 14. 2,3. 3Hz, Ha-12) ,2. 97 (1Η, dd, J = 14. 2,8. IHz, Hb-12) ,2. 65 (3Η, s, Η「23)，2· 47 (1Η, dd, J = 11. 9,5. OHz, Ha-Il) ,2. 03 (1Η, t, J = 11. 9Hz, Hb-Il)，1. 06 (3Η, s, H3-19a) ,0. 94 (3Η, s, H3_19b)。13C_WR(100 MHz, CDCl3) δ 170. 0 (C-22)，167. 9 (C_l)， 164. 4 (C-4)，143. 2 (C_7a)，142. 8 (C-20)，135. 2 (C-13), 131. 7 (C-IOa)，129. 3 (2C, C—14， 18)，128. 8 (3C, C-15,17，18)，127. 2(C_16)，124. 3 (2C, C_9，10)，118. 7(C_7)，114. 3(C_21)， 79. 1 (C-5a) , 60. 8 (C-IOb) , 58. 8 (C-Ila) , 55. 8 (C_3) , 40. 1 (C_19) , 36. 9 (C_12)， 36. 2 (C-Il)，23. 5 (C—23)，23. 0 (C_19b)，22. 1 (C_19a)。經(jīng)抗腫瘤活性篩選，式II化合物對K562細(xì)胞呈較強(qiáng)抗腫瘤活性，100 μ g/mL的抑 制率為65.0%。綜上，原始真菌野生株G59的發(fā)酵粗提樣品即使在1000 μ g/mL的高濃度下對K562 細(xì)胞也無任何抑制作用，而G59的超聲誘變突變株N3001dl-1的發(fā)酵粗提樣品對K562細(xì) 胞有顯著抗腫瘤活性，100 μ g/mL抑制率達(dá)54. 5%。本實(shí)施例從N3001dl_l的發(fā)酵物中經(jīng) 簡單的幾步提取分離和純化精制操作便分離得到了對K562細(xì)胞有抗腫瘤活性的突變株 N3001dl-1新產(chǎn)的生物堿類抗腫瘤活性產(chǎn)物式II化合物。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從無活性原始真菌野生株G59的超聲誘變抗腫瘤活性突變株 發(fā)酵物中可以比較容易地快速分離得到活性突變株新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物，從而實(shí)驗(yàn)證實(shí) 了，本發(fā)明經(jīng)對無活性真菌野生株G59的超聲誘變獲取的抗腫瘤活性突變株可作為活性菌 株新資源用于藥源活性新產(chǎn)物的研究，從而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法具 有將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓展藥源活性新菌株資源的實(shí)際利用價(jià)值。結(jié)論本發(fā)明的超聲誘變實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及自發(fā)突變和超聲誘變抗生素抗性篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù) 對真菌次級(jí)代謝功能可實(shí)施成功改造，可用于無活性真菌野生株的有效轉(zhuǎn)化和高效篩選獲 取抗腫瘤活性突變株，而所獲得的活性突變株可供開展活性產(chǎn)物的深入研究，并從中發(fā)現(xiàn) 突變株新產(chǎn)藥源活性化合物。因此，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法具有將無活性真菌野生菌株作 為原始菌資源有效拓展藥源活性新菌株資源的實(shí)際利用價(jià)值。
權(quán)利要求
一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在水混懸液狀態(tài)下超聲波處理0.5分鐘～5小時(shí)，再將超聲波處理后的菌懸液置于0～8℃溫度下處理2～50天的期間，并在該期間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。
2.一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在含有1 lOOOmg/mL卡 那霉素的水混懸液狀態(tài)下于0 8°C溫度下處理2 50天的期間，并在該期間適時(shí)取樣，經(jīng) PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。
3.一種改造真菌次級(jí)代謝功能的方法，其特征是，將原始真菌在含有1 lOOOmg/mL卡 那霉素的水混懸液狀態(tài)下首先超聲波處理0. 5分鐘 5小時(shí)，再將超聲處理后的菌懸液置 于0 8°C溫度下處理2 50天的期間，并在該期間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單 菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。
4.改造真菌的次級(jí)代謝功能并從中篩選獲取抗腫瘤活性突變株的方法，其特征是，用 權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述方法首先獲得次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株，再經(jīng)突變株的 抗腫瘤活性篩選，獲得活性突變株。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的真菌突變株新產(chǎn)活 性產(chǎn)物的快速分離純化制備方法，其特征是，分別發(fā)酵原始菌及其活性突變株，對所得發(fā)酵 物用丙酮水溶液提取，然后對該含水丙酮提取液減壓回收丙酮，然后將殘留水層用乙酸乙 酯萃取，分別獲得原始菌乙酸乙酯萃取物和含有突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的突變株乙酸乙酯萃 取物，然后對突變株乙酸乙酯萃取物的每一步分離操作均采用活性跟蹤與化學(xué)檢測分析結(jié) 合、微量預(yù)試先導(dǎo)一放大實(shí)驗(yàn)制備的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑ㄟ^與所述原始菌樣品直接比較對照，從突 變株發(fā)酵物樣品中快速跟蹤分離原始菌樣品中沒有的突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的真菌活性突變株用于 制備突變株新產(chǎn)藥源活性化合物的用途。
7.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法在用于轉(zhuǎn)化無活性真菌野生株的次級(jí)代謝功能，從 而將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源以有效拓展藥源活性新菌株資源的用途。
8.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改造的突變株；或者，權(quán)利 要求i至4任一項(xiàng)所述方法獲得的次級(jí)代謝功能經(jīng)改良的突變株。
9.說明書的全部實(shí)施例任一項(xiàng)所述的方法、過程、試驗(yàn)條件、檢測方法、檢測條件、所用 菌株、獲得的突變株、次級(jí)代謝產(chǎn)物、以及權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的式I化合 物或式II化合物，所述的方法、過程、試驗(yàn)條件、檢測方法、檢測條件、所用菌株、獲得的突 變株、次級(jí)代謝產(chǎn)物、以及權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法獲得的式I化合物或式II化合 物如說明書所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及改造真菌次級(jí)代謝的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其用途。具體地說，本發(fā)明涉及利用超聲波和/或卡那霉素改造真菌次級(jí)代謝功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，其是將原始真菌在水混懸液狀態(tài)下超聲波處理0.5分鐘～5小時(shí)，再將超聲波處理后的菌懸液置于0～8℃溫度下處理2～50天的期間，并在該期間適時(shí)取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復(fù)的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級(jí)代謝功能獲得改造的突變株。本發(fā)明還涉及該技術(shù)方法用于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤活性突變株并供藥源活性產(chǎn)物研究的用途。本發(fā)明的方法可以有效地用于從無活性真菌改造成為工業(yè)可用的真菌。
文檔編號(hào)C12N15/01GK101928705SQ20101000013
公開日2010年12月29日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者卜秀嫣, 崔承彬, 李長偉, 田從魁 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所