專利名稱：真菌次級代謝功能改造相關(guān)實驗技術(shù)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌次級代謝功能改造相關(guān)實驗技術(shù)，具體涉及DMSO介導的真菌次 級代謝功能改造實驗技術(shù)方法，以及該技術(shù)方法用于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取 抗腫瘤、抗病原真菌等活性突變株并供藥源活性產(chǎn)物研究的用途。
背景技術(shù)：
微生物產(chǎn)物是新藥及其先導結(jié)構(gòu)的一個重要來源，而可分離培養(yǎng)微生物迄今一直 是微生物藥物及其先導結(jié)構(gòu)的主要來源和主流研發(fā)資源。通常，在可分離培養(yǎng)微生物的藥 源菌株資源常規(guī)研發(fā)過程中，分離得到的絕大多數(shù)菌株往往因無活性而不能直接用于藥源 活性產(chǎn)物研究，因而被大量閑置或被選擇銷毀，造成前期投入的極大浪費和菌株資源開發(fā) 利用效率嚴重低下。因此，如何將大量閑置無用的無活性菌株有效轉(zhuǎn)化成活性菌株從而拓 展藥源微生物資源已成為重要研究課題。近幾年微生物基因組學研究結(jié)果表明，微生物基因組序列所含次級代謝產(chǎn)物 生合成基因簇或基因遠比其已知生產(chǎn)的產(chǎn)物多(如文獻S.D.Bentley，et al. Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature,2002,417 :141-147 ； 文 獻 H. Ikeda, et al. Completegenome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. NatBiotechnol, 2003,21 (5) :526_531 ；文獻M. Oliynyk, et al. Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Sacchropolyspora erthraea NRRL23338. Nat Biotechnol, 2007 (4) :447_453 ；文獻 Y. Ohnishi, et al. Genome sequence of the streptomycin-producing microorganismStreptomyces griseus IFO 13350. J Bcteriol, 2008,190(11) :4050-4060等所記載)，因而具備合成更多次級產(chǎn)物的潛在能力(參見 文 獻 S.Donadio, et al.Impact of the first Streptomyces genome sequence on thediscovery and production of bioactive substances. Appl Microbiol Biotechnol, 2002,60 :377_380 以及文獻 H. B. Bode, et al. The impact of bacterial genomics on natural product research. Angew Chem Int Ed，2005，44 (12) :6828_6846 所記述相關(guān)內(nèi) 容)。因此，無活性菌株具有轉(zhuǎn)化成活性菌株的基因組基礎(chǔ)，只要所采用的方法得當，完全有 可能實現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化并從中發(fā)現(xiàn)藥源活性化合物，從而拓展藥源微生物新菌株資源。這也正 是下述無活性放線菌具有活性化轉(zhuǎn)化潛能的基因組基礎(chǔ)，而核糖體工程技術(shù)則是激發(fā)放線 菌這種潛能的一種簡便有效手段。微生物核糖體具有調(diào)控次級代謝的功能，通過干預和改變核糖全這些功能，可 改造微生物次級代謝，從而挖掘利用微生物的相關(guān)有用潛能。核糖體工程(參見文獻 K. Ochi, et al. Ribosome engineeringand secondary metabolite production. Advan Appl Microbiol，2004，56 :155_184 以及文獻 Ochi K. From microbial differentiation to ribosome engineering. Biosci Biotechnol Biochem，2007，71 (6) : 1373-1386 記載) 相關(guān)研究表明，無活性放線菌野生菌株可通過抗生素抗性篩選轉(zhuǎn)化為活性突變株(參見文獻“于志斌，等.利用核糖體工程技術(shù)開拓海洋微生物藥用資源的研究.高技術(shù)通訊，2005， 15(5) :87-90”以及文獻“孫玉雯，等.海洋微生物的分離培養(yǎng)及其野生型與突變型抗腫瘤 活性菌株的篩選.軍事醫(yī)學科學院院刊，2008，32 (6) :532-536”的相關(guān)內(nèi)容)，而轉(zhuǎn)化獲取 的活性突變株可用于突變株新產(chǎn)藥源活性產(chǎn)物研究，從而有效拓展微生物藥源活性新菌株 資源(參見文獻“于志彬，等.用核糖體工程技術(shù)二次開發(fā)海洋微生物菌株資源的研究.高 技術(shù)通訊，2006，16 (11) :1190-1194”以及文獻“韓曉，等.放線菌野生株代謝功能的核糖體 工程改造與新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物研究.國際藥學研究雜志，2009，36(6) :435-442&446”中 相關(guān)內(nèi)容)。真菌是核糖體工程研究至今尚未觸及的一類微生物，不僅與核糖體功能相關(guān)真菌 核糖體工程研究至今未見文獻報道，而且有關(guān)無活性真菌野生株的活性化轉(zhuǎn)化相關(guān)研究尤 其是有關(guān)本發(fā)明涉及的改造真菌次級代謝功能的實驗技術(shù)方法及其用于無活性真菌野生 株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤、抗病原真菌等活性突變株并用于篩選藥源活性產(chǎn)物的研究尚 未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的真菌次級代謝功能改造相關(guān)實驗技術(shù)和/或方 法及其用途。本發(fā)明人曾嘗試采用常規(guī)核糖體工程實驗技術(shù)方法，選用作用于核糖體的各 種抗生素，對真菌探索開展了改造次級代謝功能相關(guān)抗性篩選實驗。但由于細胞壁的特殊 結(jié)構(gòu)，作用于核糖體的抗生素無法透過真菌細胞壁進入到作用部位，因此利用常規(guī)的核糖 體工程抗性篩選方法，根本無法篩選得到次級代謝功能獲得改造的真菌抗生素抗性突變 株。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過系統(tǒng)考查冷凍、高溫、超聲、微波、pH、乙酸乙酯、丙酮、 DMS0、甲醇、乙醇、丁醇等多種理化學因素對真菌細胞壁膜通透性的影響以及組合鏈霉素、 氯霉素、新霉素、利福平、慶大霉素、卡那霉素等多種抗生素和/或亞硝基胍(NTG)、硫酸二 乙酯(DES)、超聲、微波、紫外等多種物理化學誘變因子共同作用對真菌次級代謝的影響，摸 索到了可人為改造真菌次級代謝的組合實驗條件，并建立了 DMSO介導的抗生素抗性篩選、 DMSO介導的人工化學誘變等改造真菌次級代謝功能的實驗技術(shù)方法。同時，利用該實驗技 術(shù)方法，成功轉(zhuǎn)化無活性真菌野生菌株，高效篩選獲得了具有抗腫瘤、抗病原真菌等生物活 性的活性突變株，研究闡明了活性突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物，并在此過程中研究建立了通過與 原始菌發(fā)酵產(chǎn)物直接對照比較，快速跟蹤分離活性突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的分離提純制備方 法。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，本發(fā)明有關(guān)改造真菌次級代謝功能的實驗技術(shù)方法可用于有 效改造無活性真菌野生株的次級代謝功能，并從中高效轉(zhuǎn)化獲取藥源活性突變株，從而有 效拓展真菌藥源活性新菌株資源，同時通過系統(tǒng)闡明突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物，還可以深入開 發(fā)利用真菌藥源活性新產(chǎn)物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。概括地說，本發(fā)明提供以下各項項目1、一種DMSO介導的改造真菌次級代謝功能的方法，其特征是，在DMSO溶液 中，將被處理原始真菌與可作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素相互作用0.5 200天(例如0. 5 200天，例如0. 5 180天，例如0. 5 150天，例如0. 5 125天，例 如0. 5 100天，例如0. 5 90天，例如1 90天，例如1 75天，例如1 50天，例如1 40天，例如1 30天；例如0. 5 200天，例如1 180天，例如2 150天，例如5 120天，例如5 100天，例如5 75天，例如5 50天，例如5 30天)的期間，并在該 期間適時取樣(例如，取樣間隔可以為1小時 20天或Ih 30天，例如約lh、約5h、約 10h、約15小時、約20小時、約1天、約2天、約3天、約5天、約10天、約15天、約20天、約 30天的間隔)，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲 得改造的突變株。項目2、一種DMSO介導的改造真菌次級代謝功能的方法，其特征是，在DMSO溶液 中，將原始真菌與化學誘變劑相互作用0. 5 200天(例如0. 5 200天，例如0. 5 180 天，例如0. 5 150天，例如0. 5 125天，例如0. 5 100天，例如0. 5 90天，例如1 90天，例如1 75天，例如1 50天，例如1 40天，例如1 30天；例如0. 5 200天， 例如1 180天，例如2 150天，例如5 120天，例如5 100天，例如5 75天，例如 5 50天，例如5 30天)的期間，并在該期間適時取樣(例如，取樣間隔可以為1小時 20天或Ih 30天，例如約lh、約5h、約10h、約15小時、約20小時、約1天、約2天、約3 天、約5天、約10天、約15天、約20天、約30天的間隔)，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落 挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲得改造的突變株。項目3、一種DMSO介導的由真菌(例如真菌野生菌株，例如無活性的真菌野生菌 株)轉(zhuǎn)化以獲取抗腫瘤抗病原真菌活性突變株的方法，其特征是，在DMSO溶液中，將所述真 菌(例如真菌野生菌株，例如無活性的真菌野生菌株)與作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作 用的抗生素和/或化學誘變劑相互作用0. 5 200天(例如0. 5 200天，例如0. 5 180 天，例如0. 5 150天，例如0. 5 125天，例如0. 5 100天，例如0. 5 90天，例如1 90天，例如1 75天，例如1 50天，例如1 40天，例如1 30天；例如0. 5 200天， 例如1 180天，例如2 150天，例如5 120天，例如5 100天，例如5 75天，例如 5 50天，例如5 30天)的期間，并在該期間適時取樣(例如，取樣間隔可以為1小時 20天或Ih 30天，例如約lh、約5h、約10h、約15小時、約20小時、約1天、約2天、約3 天、約5天、約10天、約15天、約20天、約30天的間隔)，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落 挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲得改造的突變株，再經(jīng)突變株的抗腫瘤抗病原 真菌活性篩選，獲得具有抗腫瘤抗病原真菌活性的突變株。項目4、項目1至3任一項所述方法，其中所述DMSO溶液是DMSO水溶液(例如DMSO 體積百分數(shù)(％，ν/ν)為2 100%、或為5 100%、或為10 100%、或為15 100%、 或為20 100%、或為25 100%、或為30 95%、或為30 90%、或為35 90%、或為 40 90%、或為50 90%、或為60 90%、或為70 90%的DMSO水溶液；或者為、或 為5 90%、或為10 80%、或為15 75%、或為20 70%、或為25 60%、或為30 50%的DMSO水溶液)，所述作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素是選自鏈霉素、新 霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、利福平中的一種或多種，所述化學誘變劑是選自硫酸二 乙酯、亞硝基胍中的一種或多種。項目5、項目1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的真菌突變株新產(chǎn) 活性產(chǎn)物的快速分離純化制備方法，其特征是，分別發(fā)酵原始菌及其活性突變株，對所得發(fā) 酵物用丙酮水溶液(例如丙酮體積百分數(shù)為30 95%、或為35 90%、或為40 85%、 或為50 85%、或為55 80%、或為60% 80%的丙酮水溶液)提取，然后對該含水丙酮提取液減壓回收丙酮，然后將殘留水層用乙酸乙酯萃取，分別獲得原始菌乙酸乙酯萃取 物和含有突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的突變株乙酸乙酯萃取物，然后對突變株乙酸乙酯萃取物的 每一步分離操作均采用活性跟蹤與化學檢測分析結(jié)合、微量預試先導一放大實驗制備的實 驗?zāi)Ｊ剑ㄟ^將突變株發(fā)酵產(chǎn)物與原始菌發(fā)酵產(chǎn)物進行直接對照比較，在微量預試快速確 定突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的TLC斑點或HPLC洗脫峰的基礎(chǔ)上，經(jīng)TLC或HPLC指導或檢測下 的放大實驗，快速分離制備突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物。項目6、項目1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的真菌活性突變株 用于制備突變株新產(chǎn)藥源活性化合物的用途。項目7、項目1至4任一項所述方法在用于轉(zhuǎn)化無活性真菌野生株的次級代謝功 能，從而將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源以有效拓展藥源活性新菌株資源的用途。項目8、項目1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的突變株。或者， 項目8’、項目1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改良的突變株。項目9、說明書的全部實施例任一項所述的方法、過程、試驗條件、檢測方法、檢測 條件、所用菌株、獲得的突變株、次級代謝產(chǎn)物、以及項目1至4任一項所述方法獲得的式I 化合物或式II化合物。在一個實施方案中，所述的方法、過程、試驗條件、檢測方法、檢測條 件、所用菌株、獲得的突變株、次級代謝產(chǎn)物、以及項目1至4任一項所述方法獲得的式I化 合物或式II化合物如說明書所述。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進一步的描述。本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文 獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和 短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和 短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表 述的含義為準。本發(fā)明的第一個方面涉及DMSO介導的改造真菌次級代謝功能的實驗技術(shù)方法， 其特征是，在DMSO溶液中，將被處理原始真菌與作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生 素相互作用1 90天，并在期間適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培 養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲得改造的突變株。本發(fā)明的第二個方面涉及通過DMSO介導的人工化學誘變改造真菌次級代謝功能 的實驗技術(shù)方法，其特征是，在DMSO溶液中，將原始真菌與化學誘變劑相互作用1 90天， 并在期間適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝 功能獲得改造的突變株。本發(fā)明的第三個方面涉及DMSO介導的由無活性真菌野生菌株轉(zhuǎn)化獲取抗腫瘤抗 病原真菌活性突變株的實驗技術(shù)方法，其特征是，在DMSO溶液中，將無活性真菌野生菌株 與作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素或化學誘變劑相互作用1 90天，并在期間 適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲得 改造的突變株，再經(jīng)突變株的抗腫瘤抗病原真菌活性篩選，獲得相關(guān)活性突變株。本發(fā)明的第四個方面涉及實施對真菌次級代謝功能的成功改造所必須的關(guān)鍵因 素，其中，上述改造真菌次級代謝功能的實驗技術(shù)方法中所述DMSO溶液是DMSO含量為 20% 100% (ν/ν)的DMSO水溶液，所述作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素是鏈霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、利福平，所述化學誘變劑是硫酸二乙酯、亞硝基 胍。本發(fā)明的第五個方面涉及次級代謝功能獲得改造的真菌突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的 快速分離純化制備方法，其特征是，分別發(fā)酵原始菌及其活性突變株，經(jīng)對所得發(fā)酵物的丙 酮體積百分數(shù)為60% 80%的含水丙酮提取和對含水丙酮提取液減壓回收丙酮后殘留水 層的乙酸乙酯萃取，分別獲得原始菌乙酸乙酯萃取物和含有突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的突變株 乙酸乙酯萃取物，此后對突變株乙酸乙酯萃取物的每一步分離操作均采用活性跟蹤與化學 檢測分析結(jié)合、微量預試先導一放大實驗制備的實驗?zāi)Ｊ?，通過將突變株發(fā)酵產(chǎn)物與原始 菌發(fā)酵產(chǎn)物進行直接對照比較，在微量預試快速確定突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的TLC斑點或 HPLC洗脫峰的基礎(chǔ)上，用分離手段，經(jīng)TLC或HPLC指導下的放大實驗，快速分離制備突變株 新產(chǎn)活性產(chǎn)物。所述分離手段包括天然產(chǎn)物化學領(lǐng)域的專業(yè)人士所熟知的液_液萃取、柱 層析、薄層層析、高效液相層析及重結(jié)晶等。本發(fā)明的第六個方面涉及所述次級代謝功能獲得改造的真菌活性突變株用于制 備突變株新產(chǎn)藥源活性化合物的用途。本發(fā)明的第七個方面涉及所述真菌次級代謝功能改造相關(guān)實驗技術(shù)方法用于轉(zhuǎn) 化無活性真菌野生株的次級代謝功能，從而將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源有效拓 展藥源活性新菌株資源的用途。根據(jù)本發(fā)明上述的任一方面，其中所述的抗生素在所述DMSO溶液中的濃度為 0. 01 20% (w/v)，例如為 0. 02 18% (w/v)，例如為 0. 02 15% (w/v)，例如為 0. 02 12% (w/v)，例如為0.05 12% (w/v)，例如為0. 1 12% (w/v) 0在一個實施方案中，所 述的抗生素為鏈霉素；在一個實施方案中，所述的抗生素為鏈霉素，其在所述DMSO溶液中 的濃度為0. 1 15% (w/v)，例如為0. 15 10% (w/v)。在一個實施方案中，所述的抗生 素為新霉素；在一個實施方案中，所述的抗生素為新霉素，其在所述DMSO溶液中的濃度為 0. 1 10% (w/v)，例如為0. 1 5% (w/v)，例如為0. 1 2% (w/v)，例如為0. 1 1 % (w/v)，例如為0.2 0.67% (w/v) 0在一個實施方案中，所述的抗生素為卡那霉素；在一 個實施方案中，所述的抗生素為卡那霉素，其在所述DMSO溶液中的濃度為0. 01 20% (w/ ν)，例如為 0.01 15% (w/v)，例如為 0.015 15% (w/v)，例如為 0. 02 12 % (w/v)。 在一個實施方案中，所述的抗生素為慶大霉素；在一個實施方案中，所述的抗生素為慶大霉 素，其在所述DMSO溶液中的濃度為0. 01 20% (w/v)，例如為0. 02 15% (w/v)，例如為 0. 03 12% (w/v)，例如為 0. 05 10% (w/v)。根據(jù)本發(fā)明上述的任一方面，其中所述的化學誘變劑在所述DMSO溶液中的濃度 為0.01 20% (w/v)，例如為0.05 15% (w/v)，例如為0. 1 10% (w/v)，例如為0. 2 5% (w/v)，例如為 0. 5 5% (w/v)，例如為 0. 5 4% (w/v)，例如為 0. 5 2% (w/v)。在 一個實施方案中，所述的抗生素為硫酸二乙酯；在一個實施方案中，所述的抗生素為硫酸二 乙酯，其在所述DMSO溶液中的濃度為0. 1 10% (w/v)，例如為0. 2 5% (w/v)，例如為 0. 5 2% (w/v)。本發(fā)明采用人白血病細胞K562，用MTT法測試評價了原始菌及其突變株發(fā)酵提取 樣品以及所得化合物的抗腫瘤活性，采用從頑固性真菌感染者患病部位分離得到的病原真 菌臨床分離株Q-I、W-I、Y-I和白色念珠菌標準株，用8mm紙片法測試評價了原始菌及其突變株發(fā)酵提取樣品以及所得化合物的抗真菌活性，并經(jīng)實驗證實，用本發(fā)明的實驗技術(shù)由 無活性真菌野生株轉(zhuǎn)化獲取的活性突變株樣品及其新產(chǎn)活性化合物有明顯的抗腫瘤或抗 病原真菌活性。從而實驗證實了，本發(fā)明DMSO介導的真菌次級代謝功能改造實驗技術(shù)可用 于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤、抗病原真菌等活性突變株并供藥源活性產(chǎn) 物研究，因而具有有效拓展真菌藥源活性新菌株資源的用途。如本文使用的，術(shù)語“次級代謝”具有本領(lǐng)域公知的含義，例如是指在一定的生長 時期(例如是在穩(wěn)定生長期)，微生物以初級代謝產(chǎn)物為前體合成的對微生物本身的生命 活動沒有明確功能的物質(zhì)的過程。如本文使用的，術(shù)語“原始真菌”具有本領(lǐng)域公知的含 義，例如是指，包括但不限于，已知真菌、未知真菌、從天然來源的真菌、經(jīng)人工突變的真菌、 有活性真菌、無活性真菌等等；相對于用本發(fā)明方法經(jīng)改造的真菌突變株而言，所述“原始 真菌”可以理解為是該突變株的前體物。本發(fā)明的方法可以有效地用于從一種真菌例如無活性真菌改造成為工業(yè)可用的真菌。
具體實施例方式下列實施例將進一步說明本發(fā)明，但并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。在以下實施例中，以下稱為G59的菌株是從采自天津塘沽驢駒河渤海灣潮間帶海 泥樣品(于2004年9月29日清晨4 7時趁退潮至縱深約5km處的潮間帶采集)分離的 海洋來源真菌野生菌株；稱為H4的菌株是從采自湖北省巴東縣偏遠山區(qū)磚窯內(nèi)部窯土樣 品(于2005年11月采集)分離的陸生真菌野生菌株。所述G59菌株于2009年12月30日 保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 3560，建議的分類命名為產(chǎn)紫 青霉，Penicillium purpurogenum。所述H4菌株于2009年12月30日保藏于北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 3559，建議的分類命名為金灰青霉，Penicillium auranti ο gr i s eum。在以下實施例中，以下稱為真菌PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成是葡萄糖2%、瓊脂 2%> NaCl 1.5%，用200g/L馬鈴薯的水煮液配制，調(diào)pH 6. 0 ；以下稱為真菌液體培養(yǎng)基的 培養(yǎng)基組成是葡萄糖2%、麥芽糖1%、甘露醇2%、谷氨酸1%、蛋白胨0. 5%、酵母浸粉 0.3%，用200g/L馬鈴薯的水煮液配制，調(diào)pH 6.0。實施例1. G59的鏈霉素抗性突變株篩選與次級產(chǎn)物檢測分析真菌原始菌株G59的菌懸液制備取原始菌G59適量，接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)活化3 10天，待孢子形 成，刮取孢子適量，置于裝有IOmL無菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，震蕩打碎分散孢子，即 成孢子懸浮液。取該懸浮液100 μ L，置于96孔板中，用酶標儀監(jiān)測600nm波長下的OD值， 用無菌水稀釋至OD值達0. 35。按照酶標儀監(jiān)測下的稀釋倍數(shù)，用無菌水將全部孢子懸液同 倍比稀釋，獲得原始菌G59的菌懸液。DMSO介導的鏈霉素抗性篩選用原始菌G59的菌懸液，加鏈霉素和DMSO適量，分別配制含鏈霉素2、5、10、50mg/mL 的 20% (v/v)DMSO 的 G59 菌懸液和分別含鏈霉素 0. 15,0. 2,0. 3,0. 6、1、2、10、100mg/mL 的50% (v/v) DMSO的G59菌懸液，作被處理組混合液。另取適量原始菌G59的菌懸液，加 DMSO適量，分別配制不含鏈霉素的20% (ν/ν)和50% (v/v)DMSO的G59菌懸液，作被處理 對照組混合液。此外，將適量原始菌G59的菌懸液分別用與所用DMSO相同體積的無菌水稀 釋，制備不含鏈霉素和DMSO的菌懸液，作空白對照組混合液。將這些混合液置于4°C冰箱 中處理1 30天，期間適時各取90 μ L，分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 8天。在培養(yǎng)過程中每天觀察被試菌的生長情況，待菌落形成，適時挑取形態(tài)、顏色不同 的單菌落，用PDA平板培養(yǎng)基反復劃線培養(yǎng)、分離純化，直至分離得到純菌株。所得突變株 接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，4°C冰箱中保存并適時傳代。發(fā)酵培養(yǎng)與提取制備原始菌G59及其突變株的發(fā)酵培養(yǎng)均采用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將各菌株適量分 別接種于含有200mL真菌液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于28°C、200rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng) 10 13天，根據(jù)微生物生長狀況適時終止培養(yǎng)，下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加2倍發(fā)酵液 體積的丙酮，使丙酮的體積百分含量達約66 %，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至 不含丙酮，用相同體積EtOAc萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc，冷凍干燥，得G59及其突 變株的發(fā)酵提取樣品。突變株與原始菌形態(tài)比較將原始菌G59及其突變株分別劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 8天，肉眼觀察菌落形狀、菌體色澤、產(chǎn)生色素顏色及其滲透培養(yǎng)基情況等形態(tài)與外觀 特征。次級產(chǎn)物的薄層色譜檢測分析樣品溶液配制稱取G59及其突變株的發(fā)酵提取樣品適量，用甲醇分別配成IOmg/ mL的樣品溶液，供次級產(chǎn)物檢測分析使用。薄層色譜條件薄層色譜采用青島海洋化工有限公司產(chǎn)硅膠GF254薄層板 (20cmX IOcmXO. 25mm)，斑點采用254或365nm紫外線照射、硫酸鈰鉬酸銨試劑噴灑加熱或 噴灑三氯化鐵試劑顯色檢測。點樣用G59及其突變株發(fā)酵提取樣品的上述lOmg/mL甲醇 溶液，展開劑分別采用環(huán)己烷-丙酮(3 1、1 1、1 2)、氯仿-甲醇(20 1、9 1、 8 2、7 3) ,bp 60 90°C石油醚-丙酮(5 1、2 1、1 1、1 3) ,bp 60 90°C石 油醚-氯仿(4 1、2 1、1 1、1 2)、氯仿-丙酮(9 1、7 1、5 1、1 1)或氯 仿-甲醇-氨水(27 6 1、90 10 2)等。色譜實驗方法各薄層板均采用同一根毛細管點樣，點上相同體積的G59及其突 變株發(fā)酵提取樣品溶液，各薄層板均點上原始菌G59的樣品作為對照，待所點樣品溶液斑 點的溶劑充分揮干，置于用相應(yīng)展開劑預飽和并裝有適量展開劑的層析缸中，采用斜立薄 層板展開方式進行薄層色譜層析分離。展開結(jié)束即刻取出薄層板，待溶劑揮干，采用上述顯 色方式檢測薄層斑點，比較分析各突變株與原始菌G59以及各突變株之間次級產(chǎn)物薄層斑 點的差異，判斷是否為突變株新產(chǎn)次級產(chǎn)物斑點以及是否為不同突變株之間重復檢測到的 相同斑點。實驗結(jié)果G59鏈霉素抗性突變株的篩選獲取在被處理對照組和空白對照組實驗中，G59生長不受抑制，生長旺盛而滿平板成片生長，不形成可挑取的菌落。與此相反，在被處理組實 驗中，被處理菌生長受到明顯抑制，形成為數(shù)有限、形態(tài)不同的菌落，可以挑取單菌落。因 此，經(jīng)不同體積百分數(shù)DMSO介導作用下的鏈霉素抗性篩選實驗，篩選獲得了 G59的鏈霉素 抗性突變株共112株，其中通過50% (v/v)DMSO介導獲取的66株、20% (v/v)DMSO介導獲 取的46株，具體結(jié)果詳見表1。表1G59的DMSO介導鏈霉素抗性突變株篩選統(tǒng)計結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種DMSO介導的改造真菌次級代謝功能的方法，其特征是，在DMSO溶液中，將被處 理原始真菌與可作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素相互作用0. 5 200天的期 間，并在該期間適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級 代謝功能獲得改造的突變株。
2.—種DMSO介導的改造真菌次級代謝功能的方法，其特征是，在DMSO溶液中，將原始 真菌與化學誘變劑相互作用0. 5 200天的期間，并在該期間適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和 反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代謝功能獲得改造的突變株。
3.—種DMSO介導的由真菌(例如真菌野生菌株，例如無活性的真菌野生菌株)轉(zhuǎn)化以 獲取抗腫瘤抗病原真菌活性突變株的方法，其特征是，在DMSO溶液中，將所述真菌與作用 于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素和/或化學誘變劑相互作用0. 5 200天的期間， 并在該期間適時取樣，經(jīng)PDA平板涂板和反復的單菌落挑選與分離培養(yǎng)，純化得到次級代 謝功能獲得改造的突變株，再經(jīng)突變株的抗腫瘤抗病原真菌活性篩選，獲得具有抗腫瘤抗 病原真菌活性的突變株。
4.權(quán)利要求1至3任一項所述方法，其特征在于以下一項或多項i)所述DMSO溶液是 DMSO水溶液；ii)所述作用于微生物核糖體發(fā)揮抗菌作用的抗生素是選自鏈霉素、新霉素、 卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、利福平中的一種或多種；和iii)所述化學誘變劑是選自硫酸 二乙酯、亞硝基胍中的一種或多種。
5.權(quán)利要求1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的真菌突變株新產(chǎn)活 性產(chǎn)物的快速分離純化制備方法，其特征是，分別發(fā)酵原始菌及其活性突變株，對所得發(fā)酵 物用丙酮水溶液提取，然后對該含水丙酮提取液減壓回收丙酮，然后將殘留水層用乙酸乙 酯萃取，分別獲得原始菌乙酸乙酯萃取物和含有突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的突變株乙酸乙酯萃 取物，然后對突變株乙酸乙酯萃取物的每一步分離操作均采用活性跟蹤與化學檢測分析結(jié) 合、微量預試先導一放大實驗制備的實驗?zāi)Ｊ?，通過將突變株發(fā)酵產(chǎn)物與原始菌發(fā)酵產(chǎn)物 進行直接對照比較，在微量預試快速確定突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的TLC斑點或HPLC洗脫峰的 基礎(chǔ)上，經(jīng)TLC或HPLC指導或檢測下的放大實驗，快速分離制備突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的真菌活性突變株用于 制備突變株新產(chǎn)藥源活性化合物的用途。
7.權(quán)利要求1至4任一項所述方法在用于轉(zhuǎn)化無活性真菌野生株的次級代謝功能，從 而將無活性真菌野生菌株作為原始菌資源以有效拓展藥源活性新菌株資源的用途。
8.權(quán)利要求1至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改造的突變株；或者，權(quán)利 要求i至4任一項所述方法獲得的次級代謝功能經(jīng)改良的突變株。
9.說明書的全部實施例任一項所述的方法、過程、試驗條件、檢測方法、檢測條件、所用 菌株、獲得的突變株、次級代謝產(chǎn)物、以及權(quán)利要求1至4任一項所述方法獲得的式I化合 物或式II化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌次級代謝功能改造相關(guān)實驗技術(shù)及其用途，具體涉及DMSO介導的真菌次級代謝功能改造實驗技術(shù)方法以及該技術(shù)方法用于無活性真菌野生株的轉(zhuǎn)化和篩選獲取抗腫瘤、抗病原真菌等活性突變株并供藥源活性產(chǎn)物研究的用途。本發(fā)明的方法可以有效地用于從一種真菌例如無活性真菌改造成為工業(yè)可用的真菌。
文檔編號C12N1/14GK101993869SQ20101000003
公開日2011年3月30日 申請日期2010年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月4日
發(fā)明者卜秀嫣, 吳長景, 崔承彬, 房士明, 李長偉, 柴云晶, 田從魁 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所