使用?；?CoA合成酶生物合成生成?；?CoA的方法
【專利摘要】一種從長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其包括在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)ACS、供應(yīng)長(zhǎng)鏈羧酸至細(xì)胞系統(tǒng)、使細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、以及生成羧基CoA。
【專利說明】
使用?；?CoA合成酶生物合成生成?；?CoA的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本公開是標(biāo)題為Methods of Using Acyl-CoA Synthetase for Biosynthetic Production of Acyl-CoAs的PCT專利申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求2013年11月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專 利申請(qǐng)No. 61/898，944的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開適用于食品、醫(yī)藥和藥理學(xué)行業(yè)。本公開總體涉及使用酰基-CoA合成酶(酰 基輔酶A合成酶，ACS)生物合成生成酰基-CoA的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 辣椒素，8-甲基-N-香草基-反式-6-壬稀酰胺是在辣椒(辣椒屬物種（Capsicum spp .))中產(chǎn)生的導(dǎo)致其辛辣味的次級(jí)代謝物。如圖1中所指出，辣椒素?fù)?jù)信由辣椒素合酶 (CS)合成，辣椒素合酶(CS)是一種從8-甲基壬烯酰-CoA將8-甲基壬烯酰部分轉(zhuǎn)移至香草基 胺以形成酰胺綴合物的酰基轉(zhuǎn)移酶，盡管編碼CS的基因在提交相關(guān)臨時(shí)申請(qǐng)時(shí)尚未經(jīng)明確 鑒定。再次，如圖1所詳述，CS的底物，8-甲基壬烯酰-CoA通過酰基-CoA合成酶(ACS)的活性 衍生自8-甲基-反式-6-壬烯酸。
[0005] ACS催化羧酸通過ATP-依賴性兩步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其酰基-CoA硫酯。在第一步中，游離 脂肪酸通過釋放焦磷酸根被轉(zhuǎn)化為?；?AMP中間體。在第二步中，經(jīng)活化的?；鶊F(tuán)被偶 聯(lián)至CoA的硫醇基團(tuán)，從而釋放AMP和酰基-CoA產(chǎn)物(Groot等，1976) ACS和其它相關(guān)的蛋白 質(zhì)的特征在于形成AMP結(jié)合基序(PROSITE PS00455)核心的高度保守的12個(gè)氨基酸序列。約 44個(gè)推測(cè)的ACS基因在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中得以鑒定（Shockey等， 2003)。當(dāng)前，它們中的約一半具有已知的生化功能，其包括長(zhǎng)鏈酰基-CoA合成酶、?；?ACP (?；d體蛋白）合成酶、4-香豆酰-CoA連接酶、乙酰基-CoA合成酶、0PC-8: OCoA連接酶、琥 ?白酰苯甲酰-CoA連接酶、丙二酰-CoA合成酶及草酰-CoA合成酶(Shockey等，2003; Koo等， 2005;Κοο等，2006; Kim等，2008; Lin和01 iver，2008; Chen等，2011; Foster等，2012)。在辣椒 (Capsicum annuum)中，已克隆了三個(gè)全長(zhǎng)推測(cè)的ACS基因（Lee等，2001 ;Mazourek等， 2009)。然而，認(rèn)為這些蛋白質(zhì)中沒有任一種具有生化活性。
[0006]
【申請(qǐng)人】著手鑒定辣椒素生物合成、特別是ACS中涉及的基因。因?yàn)槔苯坊蚪M序列 在研究開始時(shí)不可獲得，所以
【申請(qǐng)人】采用RNA測(cè)序（RNA-Seq)技術(shù)用于魔鬼辣椒（ghost chili pepper，一種黃燈籠辣椒(C. chinense)和木本辣椒(C. frutescens)的種間雜交種） 的綠果的轉(zhuǎn)錄組分析。RNAseq實(shí)驗(yàn)通過M0gene，LC(St Louis，M0)進(jìn)行。
【申請(qǐng)人】通過從頭組 裝原始RNAseq數(shù)據(jù)獲得約18，987個(gè)重疊群，所述重疊群中的33個(gè)被注釋為酰基-CoA合成 酶-樣蛋白質(zhì)。在這些重疊群中，Comp2147-l顯示出與CaSIG4的良好匹配（圖2)，CaSIG4是來 自辣椒中的編碼推測(cè)的酰基-CoA合成酶的病原體-誘導(dǎo)型cDNA(Lee等，2001)。此外， <：〇1^66462和(：〇1^79520定位至辣椒（？6??6〇4051(6611831^41]616571)(圖3)，并且 Compl67_cO、Compl67_cl 和 Comp46218 定位至辣椒 ACS2(GenBank:EU616572)(圖4)。因此， ACS1和ACS2是從質(zhì)體輸出脂肪酸的?；?CoA合成酶的兩種候選物(Mazourek等，2009)。
[0007]
【申請(qǐng)人】證明了 ACS1是中鏈/長(zhǎng)鏈?；?CoA合成酶，其將8-甲基-反式-6-壬烯酸轉(zhuǎn) 化為相應(yīng)的8-甲基-6-壬烯酰-C〇A(辣椒素生物合成途徑中的一種關(guān)鍵中間體）。
【申請(qǐng)人】在 本文申請(qǐng)中公開了使用ACS、特別是ACS1用于生物合成生成?；?CoA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本公開解決了在細(xì)胞系統(tǒng)諸如酵母或細(xì)菌中生成酰基-CoA的技術(shù)問題。
【申請(qǐng)人】已 分離了ACS的基因，并在促進(jìn)?；?CoA生成的細(xì)胞系統(tǒng)中獨(dú)特地使該基因表達(dá)。一種特殊的 酰基 -CoA，8-甲基_6_壬稀酰-CoA是辣椒素合酶(CS)的必需底物，其然后生成辣椒素。因此， 本公開提供了 8-甲基-6-壬烯酰-CoA的工業(yè)生產(chǎn)，并有助于促進(jìn)辣椒素的隨后生成。
[0009] 本公開是從中鏈/長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其包括在細(xì)胞系統(tǒng)中表 達(dá)ACS、向該細(xì)胞系統(tǒng)供應(yīng)長(zhǎng)鏈羧酸、使該細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、以及生成羧基CoA。
[0010] 另一個(gè)實(shí)施方式是制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其包括在細(xì)胞系統(tǒng)中 表達(dá)ACS、向該細(xì)胞系統(tǒng)供應(yīng)8-甲基-反式-6-壬烯酸、使該細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、以及 生成8-甲基壬烯酰-CoA。
【附圖說明】
[0011] 為了更好地理解本公開，可參考附圖，其中：
[0012] 圖1示出了辣椒素的生物合成途徑，其包括通過ACS從8-甲基-6-壬烯酸制備8-甲 基-6-壬稀酰-CoA的反應(yīng)(從Stewart等(2007)改進(jìn)而來）。
[0013] 圖 2 示出了 Comp2147-l 與 CaSIG4(GenBank:AF354454)之間的序列比較。
[0014] 圖 3示出了 Comp66462、Comp79520 與 ACS1 (GenBank: EU616571)之間的序列比較。
[0015] 圖 4 示出了 (：〇1^167_。0、(：〇1^167_。1、(：〇1^46218與厶〇52(66118&吐41]616572)之間 的序列比較。
[0016] 圖5示出了魔鬼辣椒ACS1與ACSl(GenBank:ACF17663)之間的序列比較。
[0017] 圖6示出了魔鬼辣椒ACS1、擬南芥屬植物L(fēng)ACS4(GenBank:AEE84812)和LACS5 (GenBank: AAM28872)的序列比對(duì)。
[0018] 圖 7 示出了 BL21(DE3)細(xì)胞中 His-SUM〇-ACSl 表達(dá)的 SDS-PAGE 分析。0,20:IPTG 誘導(dǎo) 后的總蛋白；C:可溶性粗蛋白提取物；E1至E4:來自Ni-NTA柱的級(jí)分。ACS 1的分子量為約 73.5Kd，并且His-SUMO標(biāo)簽的分子量為約12Kd。
[0019] 圖8示出了ACS1針對(duì)各種羧酸的活性。C2，乙酸;C4，丁酸;C6，己酸，C8，辛酸;C10， 癸酸;C12，月桂酸;C14，肉豆蔻酸;C16，棕櫚酸;C18，硬脂酸。在100mM的pH 8.0的Tri緩沖液 中進(jìn)行測(cè)定。
[0020] 圖9示出了用8-甲基-反式-6-壬烯酸或8-甲基壬酸分別作為底物的ACS1的酶促產(chǎn) 物的HPLC圖。
[0021] 圖10示出了經(jīng)純化的8-甲基-反式-6-壬烯酰-CoA的負(fù)離子模式下的MS/MS分析。 [0022]圖11示出了經(jīng)純化的8-甲基壬酰-CoA的負(fù)離子模式下的MS/MS分析。
[0023]圖12示出了pH對(duì)ACS1針對(duì)8-甲基壬酸的活性的影響。四種不同的緩沖液體系用于 不同的pH范圍。
[0024] 盡管本公開易受各種修改和可替代形式的影響，其特定實(shí)施方式通過在附圖中以 例舉的方式顯示并將在本文中詳細(xì)描述。然而，應(yīng)理解本文提出的附圖和詳述不意在限制 本公開為公開的特定實(shí)施方式，但相反意圖覆蓋落入由隨附的權(quán)利要求限定的本公開的精 神和范圍內(nèi)的所有修改、等效物和替代物。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 定義 [0026]細(xì)胞系統(tǒng)
[0027]細(xì)胞系統(tǒng)是提供異位蛋白表達(dá)的任何細(xì)胞。其包括細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì) 胞。其包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩者。其還包括基于細(xì)胞組分(諸如核糖體）的蛋白質(zhì)的體 外表達(dá)。
[0028]使細(xì)胞系統(tǒng)生長(zhǎng)
[0029] 生長(zhǎng)包括提供使細(xì)胞繁殖和分裂的培養(yǎng)基。其還包括提供資源，使得細(xì)胞或細(xì)胞 組分可翻譯和制備重組蛋白。
[0030] 蛋白表達(dá)
[0031] 蛋白生成可在基因表達(dá)后發(fā)生。其由DNA已轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)之后的階段組 成。然后將mRNA翻譯為多肽鏈，其最終折疊為蛋白質(zhì)。DNA通過轉(zhuǎn)染存在于細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染為一 種有意將核酸引入至細(xì)胞中的方法。該術(shù)語通常用于真核細(xì)胞中的非病毒方法。還可涉及 其它方法和細(xì)胞類型，盡管其它術(shù)語是優(yōu)選的："轉(zhuǎn)化"通常用于描述細(xì)菌、非動(dòng)物真核細(xì) 胞，包括植物細(xì)胞中的非病毒DNA轉(zhuǎn)移。在動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染是優(yōu)選的術(shù)語，因?yàn)檗D(zhuǎn)化還用于 指代這些細(xì)胞中的癌性狀態(tài)(致癌作用）的進(jìn)展。轉(zhuǎn)導(dǎo)通常用于描述病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒感染包含在本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)染的定義下。
[0032] 本公開的一個(gè)實(shí)施方式是從中鏈至長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其包 括在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)ACS、向該細(xì)胞系統(tǒng)供應(yīng)中鏈至長(zhǎng)鏈羧酸、使該細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)、以及生成羧基CoA。
[0033] 另一個(gè)實(shí)施方式是從由魔鬼辣椒克隆的ACS1表達(dá)ACS。替代的實(shí)施方式是ACS基于 LCAS4或LCAS5從擬南芥屬植物表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，ACS從由辣椒屬物種克隆的ACS2 表達(dá)。此外，ACS是與從魔鬼辣椒克隆的ACS1共享至少66%的序列同一性的ACS。在另一個(gè)變 型中，ACS是與從魔鬼辣椒克隆的ACS1共享至少97%的序列相似性的ACS。
[0034] 另一個(gè)實(shí)施方式是中鏈或長(zhǎng)鏈羧酸是8-甲基-反式-6-壬烯酸。長(zhǎng)鏈羧酸通常具有 14個(gè)至18個(gè)碳，而中鏈羧酸通常具有8個(gè)至13個(gè)碳。在一個(gè)實(shí)施方式中，供應(yīng)中鏈至長(zhǎng)鏈羧 酸至細(xì)胞系統(tǒng)包括添加中鏈至長(zhǎng)鏈羧酸至細(xì)胞系統(tǒng)。在一個(gè)可替代的實(shí)施方式中，供應(yīng)中 鏈至長(zhǎng)鏈羧酸至細(xì)胞系統(tǒng)包括在細(xì)胞系統(tǒng)中從生物合成途徑表達(dá)中鏈至長(zhǎng)鏈羧酸。
[0035] 至于實(shí)施方式中的細(xì)胞系統(tǒng)，其選自由以下組成的組：細(xì)菌、酵母及其組合，或者 提供將允許生物合成生成的任何細(xì)胞系統(tǒng)。
[0036] 本公開的一個(gè)實(shí)施方式是制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其包括在細(xì)胞 系統(tǒng)中表達(dá)ACS、供應(yīng)8-甲基-反式-6-壬烯酸至細(xì)胞系統(tǒng)、使細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、以 及生成8-甲基壬烯酰-CoA JCS從由魔鬼辣椒克隆的ACS1表達(dá)。ACS可從由擬南芥屬植物克 隆的LCAS4或LCAS5表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，ACS從由辣椒屬物種克隆的ACS2表達(dá)。此外， ACS是與從魔鬼辣椒克隆的ACS1共享至少66%的序列同一性的ACS。在另一個(gè)變型中，ACS是 與從魔鬼辣椒克隆的ACS1共享至少97%的序列相似性的ACS。
[0037] 實(shí)施例1 [0038] 生成?；?CoA
[0039] 克隆
[0040]
【申請(qǐng)人】使用引物ACSl-sum〇-F:CGC GAA CAG ATT GGA GGT GCAACAGATAAATTTATTATTG和ACSl-sum〇-R:GTG GCG GCC GCT CTA TTA TCACTTGGTACCCTTGTACAT從魔鬼辣椒綠果的cDNA擴(kuò)增ACS1基因。所得的PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂 糖凝膠上純化并與線性pETite N_His SUMO Kan表達(dá)載體(Lucigen，Middleton，WI)混合。 DNA混合物用于通過熱激(Lucigen)轉(zhuǎn)化HI-對(duì)照10G化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。完全測(cè)序基因插入序 列，并將編碼的氨基酸序列與ACS1的氨基酸序列比對(duì)(圖5)。如圖5所示，除了辣椒ACS1中的 I le476被魔鬼辣椒ACS1中的Val的替代外，這兩條序列幾乎是相同的。魔鬼辣椒ACS1的序列 用于搜索比對(duì)(bias)擬南芥數(shù)據(jù)庫（http : //www.arabidopsis · org/)，并鑒定LCAS4和 LACS5為其同系物（圖6)。如圖6所示，這三條序列共享66.7%的序列同一性和97.1 %的序列 相似性。LACS4和LACS5兩者經(jīng)生化表征為參與脂肪酸和甘油脂質(zhì)代謝的長(zhǎng)鏈酰基-CoA合成 酶（Shockey等，2002)。最近，LACS4被證明為擬南芥屬植物中花粉包被脂質(zhì)形成所需 (Jessen等，2011) 〇
[0041 ] 表達(dá)
[0042]
【申請(qǐng)人】使用pETite N-His SUM0-魔鬼辣椒ACS1轉(zhuǎn)化HI-對(duì)照BL21(DE3)細(xì)胞 (Lucigen)，并且His-SUM〇-ACSl的表達(dá)由0.5mM的IPTG在16°C下誘導(dǎo)20小時(shí)。融合蛋白通過 Ni-NTA柱純化（圖7KACS1具有約73.5Kd的分子量，并且His-SUMO標(biāo)簽的尺寸為約12Kd。 SDS-PAGE上的His-SUM〇-魔鬼辣椒ACS1融合蛋白迀移靠近預(yù)測(cè)尺寸(約85Kd)(圖7)。
[0043] 產(chǎn)物
[0044]
【申請(qǐng)人】使用基于HPLC的方法以測(cè)量魔鬼辣椒ACS 1的活性(Chen等，2011)。簡(jiǎn)而言 之，反應(yīng)混合物（400yL)含有0.1M Tris-HCl(pH 7.5)、2mM DTT、5mM ATP、10mM MgCl2、 0.5mM CoA、0.1%Triton和200μΜ羧酸。通過添加20μ1純化酶起始反應(yīng)，并在30分鐘后通過 添加20μ1 乙酸終止反應(yīng)。利用Acclaim?.120C18反相柱（Thermo Scientific ;3μ，120 Α，. 150 X 3mm)的 Dkinex .- U丨ti_Mate? :)>()()〇LC系統(tǒng)（Thermo Sc ientif ic)進(jìn)行HPLC。流動(dòng)相由 溶劑A(0.1 %三氟乙酸)和溶劑B(乙腈)組成。梯度洗脫程序如下:0至5分鐘，5%的B; 5分鐘 至9分鐘，5 %至80 %的B的線性梯度;9分鐘至11分鐘，80 %的B; 11分鐘至12分鐘，5 %的B。流 速是0.6ml/min。二極管陣列檢測(cè)器收集200-nm至400-nm范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)。為了檢測(cè)和定量底 物和產(chǎn)物，在257nm下測(cè)量峰面積。
[0045] 如圖8所示，ACS1針對(duì)各種中鏈至長(zhǎng)鏈羧酸具有活性，其中針對(duì)癸酸(C10)具有最 高活性。相反，ACS1針對(duì)乙酸(C2)或丁酸(C4)-短鏈羧酸不顯示任何活性。
[0046]
【申請(qǐng)人】然后使用8-甲基-反式-6-壬烯酸(6E)(辣椒素生物合成途徑中的內(nèi)源性中 間體)或其還原產(chǎn)物8-甲基壬酸(8M)作為底物來測(cè)定ACS1的活性。如圖9所示，ACS1顯示對(duì) 兩種底物具有活性，其中針對(duì)6E具有更高的活性。
【申請(qǐng)人】收集了產(chǎn)物峰相應(yīng)的HPLC級(jí)分，并 將它們經(jīng)SpeedVac濃縮器(SpeedVac Concentrator)干燥以用于進(jìn)一步的MS/MS鑒定。 [0047] 確認(rèn)產(chǎn)物
[0048]將每種干燥的樣品重懸于40yL的1:1:2的甲醇：水：乙腈緩沖液中。使用TriVersa Nanotnate? (Advion，I thaca，NY)，將 1 OyL用于直接輸注。質(zhì)譜儀LTQ-〇rbi trap Ve 1 os (Thermo Fisher Scientif ic，Waltham，MA)以負(fù)離子模式運(yùn)行。在FT細(xì)胞中在300m/z至2， OOOm/z質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行MS測(cè)量掃描。解析度被設(shè)定為60,000@400m/Z<XID片段化用于MS/ MS，并且檢測(cè)在離子阱中進(jìn)行，其分離窗為1.5m/z。片段化用35%的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量進(jìn)行。 如圖10至圖11所示，MS數(shù)據(jù)分別匹配8-甲基-反式-6-壬烯酰-CoA和8-甲基壬酰-CoA的分子 量。
[0049] 還研究了 ACS1針對(duì)8-甲基壬酸的pH最優(yōu)值。乙酸鹽、磷酸鹽、Tris和甘氨酸/NaOH 緩沖液用于提供4.0至10.5的pH范圍。如圖12所示，ACS1的pH最優(yōu)值為約9.5。
[0050] 因此，
【申請(qǐng)人】已經(jīng)鑒定了提供辣椒素合酶的底物的魔鬼辣椒中的新型中鏈/長(zhǎng)鏈 ?；?CoA合成酶。此外，所述新型酶還可應(yīng)用于生物燃料業(yè)中用于制備中鏈脂肪酸衍生物。
[0051] 另外的實(shí)施方式包括通過利用基因過表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)已知技術(shù)過表達(dá)ACS1，使用ACS1改 變辣椒植物中辣椒素類物質(zhì)的水平。另一個(gè)實(shí)施方式包括通過利用標(biāo)準(zhǔn)的已知敲除或敲低 基因表達(dá)技術(shù)來敲除或敲低ACS1，使用ACS1調(diào)控辣椒植物中辣椒素類物質(zhì)的水平。再次，通 過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)的分子細(xì)胞策略和技術(shù)進(jìn)行過表達(dá)或敲除/敲低。另一 個(gè)實(shí)施方式包括使用ACS1生成?；?CoA及其包括脂肪酸的下游代謝物，涉及ACS1的表達(dá)或 過表達(dá)。另一個(gè)變型是使用ACS1調(diào)控酰基-CoA及其包括脂肪酸的下游代謝物的水平，包括 敲除或敲低ACS1。
[0052]可利用由所述方法制備的?；鵆oA制備辣椒素，并且所制備的酰基CoA通常具有中 鏈多樣性。再次，盡管ACS1可介導(dǎo)中鏈-羧酸和長(zhǎng)鏈-羧酸兩者轉(zhuǎn)化為?；?CoA，但中鏈活性 比長(zhǎng)鏈活性重要得多，因?yàn)橹墟溁钚允墙袢丈锶加蜆I(yè)中的必需組成。如上針對(duì)ACS1所述 的另一個(gè)重要性是其可用于通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變植物中的辣椒素水平。然而，ACS1不被排 除在關(guān)于長(zhǎng)鏈?；?CoA的用途之外。
[0053]在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞系統(tǒng)，諸如基于細(xì)菌的系統(tǒng)或基于酵母的系統(tǒng)可經(jīng)改變 以表達(dá)ACS 4CS可以為從魔鬼辣椒克隆的ACS1。其它適合的ACS是基于擬南芥屬植物的 LCAS4和LCAS5的ACS。其它已知的ACS1和ACS2也可在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。然后可將適當(dāng)?shù)牡?物，諸如8-甲基-反式-6-壬烯酸和8-甲基壬酸供應(yīng)至細(xì)胞系統(tǒng)。底物也可作為細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi) 的生物合成途徑的一部分表達(dá)。然后孵育細(xì)胞系統(tǒng)，使得生物合成生成8-甲基-反式-6-壬 烯酰-CoA或8-甲基壬酰-CoA。
[0054] 同一性和相似性
[0055] 同一性是在比對(duì)序列（其可僅使用序列信息或結(jié)構(gòu)信息或一些其它信息進(jìn)行，但 通常其僅基于序列信息）后在一對(duì)序列之間相同的氨基酸的分?jǐn)?shù)，而相似性是基于使用一 些相似性矩陣的比對(duì)指定的評(píng)分。相似性指數(shù)可為以下BL0SUM62、PAM250或G0NNET中的任 一者，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)所用的任何矩陣。
[0056] 同一性是兩條子序列之間一致性的程度(序列之間沒有空位）。25%或更高的同一 性意指功能的相似性，而18%至25%意指結(jié)構(gòu)或功能的相似性。記住兩條完全不相關(guān)或隨 機(jī)序列(其為多于100個(gè)殘基)可具有高于20%的同一性。相似性是當(dāng)比較兩條序列時(shí)，這兩 條序列之間相似的程度。這取決于它們的同一性。
[0057] 如從前文描述顯而易見，本公開的某些方面不限于本文說明的實(shí)施例的特定細(xì) 節(jié)，并且因而考慮到本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)行其它改變和應(yīng)用或其等效形式。因此權(quán)利要求 應(yīng)意欲覆蓋所有不偏離本公開的精神和范圍的此類改變和應(yīng)用。
[0058] 此外，除非另外限定，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本公開所屬 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本公開中可使用與本文 描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是上文描述了優(yōu)選的方法和材 料。
[0059] 本公開的其它方面、目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)可通過研究附圖、公開內(nèi)容和隨附的權(quán)利要求獲 得。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其包括： 在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)酰基-CoA合成酶(ACS); 供應(yīng)中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸或兩者至所述細(xì)胞系統(tǒng)； 使所述細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；以及 生成羧基CoA。2. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述ACS從由魔鬼辣椒克隆的ACSl或由辣椒克隆的CaSIG4或由辣椒克隆的ACSl或其組合表 達(dá)。3. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述ACS從由擬南芥屬植物克隆的基于LCAS4或LCAS5的基因表達(dá)。4. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述ACS從由辣椒植物克隆的ACS2表達(dá)。5. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述ACS是與從魔鬼辣椒克隆的ACSl共享至少66 %的序列同一性的ACS。6. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述ACS是與從魔鬼辣椒克隆的ACSl共享至少97%的序列相似性的ACS。7. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述長(zhǎng)鏈羧酸是8-甲基-反式-6-壬烯酸。8. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述供應(yīng)中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸或兩者至所述細(xì)胞系統(tǒng)包括添加中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸或兩者 至所述細(xì)胞系統(tǒng)。9. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述供應(yīng)中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸或兩者至所述細(xì)胞系統(tǒng)包括在所述細(xì)胞系統(tǒng)中基于所述細(xì)胞 系統(tǒng)中的生物合成途徑表達(dá)所述中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸或兩者。10. 如權(quán)利要求1所述的從中鏈羧酸或長(zhǎng)鏈羧酸制備羧基CoA的生物合成方法，其中，所 述細(xì)胞系統(tǒng)選自由以下組成的組:細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、體外翻譯系統(tǒng)及其組 合。11. 一種制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其包括： 在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)ACS; 供應(yīng)8-甲基-反式-6-壬烯酸至所述細(xì)胞系統(tǒng)； 使所述細(xì)胞系統(tǒng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；以及 生成8-甲基壬烯酰-CoA。12. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述ACS從由 魔鬼辣椒克隆的ACSl或由辣椒克隆的CaSIG4或由辣椒克隆的ACSl或其組合表達(dá)。13. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述ACS從基 于由擬南芥屬植物克隆的LCAS4或LCAS5的基因表達(dá)。14. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述ACS從由 辣椒植物克隆的ACS2表達(dá)。15. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述ACS是與 從魔鬼辣椒克隆的ACSl共享至少66 %的序列同一性的ACS。16. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述ACS是與 從魔鬼辣椒克隆的ACSl共享至少97%的序列相似性的ACS。17. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述供應(yīng)8-甲 基-反式-6-壬烯酸至所述細(xì)胞系統(tǒng)包括添加所述8-甲基-反式-6-壬烯酸至所述細(xì)胞系統(tǒng)。18. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述供應(yīng)8-甲 基-反式-6-壬烯酸至所述細(xì)胞系統(tǒng)包括在所述細(xì)胞系統(tǒng)中基于所述細(xì)胞系統(tǒng)中的生物合 成途徑表達(dá)所述8-甲基-反式-6-壬烯酸。19. 如權(quán)利要求11所述的制備8-甲基壬烯酰-CoA的生物合成方法，其中，所述細(xì)胞系統(tǒng) 選自由以下組成的組:細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、體外翻譯系統(tǒng)及其組合。 20. ACS 1用于調(diào)控辣椒植物中辣椒素類物質(zhì)的水平的用途，所述調(diào)控包括過表達(dá)ACS 1、 或者敲除或敲低ACSl。 21. ACSl用于調(diào)控?；?CoA及其包括脂肪酸的下游代謝物的水平的用途，所述調(diào)控包 括在細(xì)胞系統(tǒng)中過表達(dá)ACSl、或者敲除或敲低細(xì)胞系統(tǒng)中的ACSl。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105916991SQ201480072149
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2014年11月3日
【發(fā)明人】陳輝, 王弘雪, 余曉丹
【申請(qǐng)人】康納根有限公司