應(yīng)用于北極絲狀真菌生產(chǎn)二萜類化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及用于北極絲狀真菌Eutypella sp.生產(chǎn)二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneH的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，通過培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高 LibertellenoneH的產(chǎn)量。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于病原體對各種藥物耐藥性的加強以及一些常用藥物嚴重且長期的副作用，開 發(fā)新的治療藥物尤為迫切。極地地區(qū)由于常年低溫、氣候干燥、反復(fù)凍融、強紫外輻射、光照 時間長及營養(yǎng)貧乏等嚴重限制了植物和動物的生長，耐受力強的微生物卻在極地生態(tài)系統(tǒng) 中發(fā)揮著重要作用。近年來，由于極地微生物能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝物，逐漸成為開發(fā) 新藥物的重要的潛在資源。
[0003] 彎孢聚殼菌D-l(EutypellaSP.D-1，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2013144)是分離自北極高煒度（78° 55'N)仙女木根基土壤的一株絲狀真菌，該屬真菌 在全球分布較為廣泛，且能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的次級代謝物，比如桉烷型倍半 萜、海松烷型二萜、三萜、細胞松弛素類、聚酮類和環(huán)二肽類化合物。從該菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離 鑒定的兩種新型異海松燒型二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneG和LibertellenoneH對人肺 癌細胞株H460、人膠質(zhì)瘤細胞株U251、人胃癌細胞株SG7901、人胰腺癌細胞株SW1990、人 子宮頸癌細胞株Hela和人肝癌細胞株Huh-7這7種腫瘤細胞株均有一定抑制活性。其中 LibertellenoneH對Mcf-7乳腺癌的抑制作用最強，IC5Q達到了 3. 31ymol/L，和陽性對照 紫杉醇的IC5(I相當(dāng)，具有開發(fā)應(yīng)用前景。
[0004] 然而LibertellenoneH的原始產(chǎn)量極低（低于HPLC檢出限），嚴重限制了后續(xù)的 藥理藥效及臨床研宄，因此需要通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化來提高LibertellenoneH的產(chǎn)量，為 其后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵及作為抗癌候選藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于北極絲狀真菌Eutypellasp.生產(chǎn)二貓類化合物 LibertellenoneH的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及制備方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種北極絲狀真菌（Eutypellasp.)的培養(yǎng)基，所述培 養(yǎng)基包括以下組分：
[0007] 蔗糖 30-120 g/L; 硝酸鈉 0.5-6 g/L; 三水磷酸氫二鉀 0.01-0.15 g/L; 七水硫酸鎂 0.1-1 g/L; 氯化鉀 0.05-1.5 g/L; 酵母提取物 0.05-1.5 g/L; 硫酸亞鐵 0.005-0.08 g/L; 尿素 0.4-10 g/L; 六水氣化鉆 0.001-0.006 g/L； 氣化餌 0.002-0.01g/La
[0008] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：
[0009] 鹿糖 45-95 g/L; 硝酸鈉 1-5 g/L; 三水磷酸氫二鉀 0.02-0.1g/L; 七水硫酸鎂 0.2-0.8g/L; 氯化鉀 0.1-1 g/L; 酵母提取物 0.1-1 g/L; 硫酸亞鐵 0.01-0.03g/L; 尿素 （).5~5g/; 六水氯化鈷 0.002-0.004g/L:
[0010] 氯化鈣 0.004-0.008g/L。
[0011] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：
[0012] 薦糖 50-70 g/L; 硝酸鈉 2-4 g/L; 三水磷酸氫二鉀 0.04-0.08 g/L; 七水硫酸鎂 0.3-0.6 g/L; 氯化鉀 0.3-0.8 g/L; 酵母提取物 0.3-0.8 g/L; 硫酸亞鐵 0.015-0.025 g/L; 尿素 1.5-3.5g/L; 六水氯化鈷 0.002-0.004 g/L; 氯化鈣 0.004-0.008 g/L3
[0013] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：
[0014] 鹿糖 51.4 g/L; 硝酸鈉 3.3 g/L; 三水磷酸氫二鉀 0.07 g/L; 七水硫酸鎂 0.4 g/L; 氯化鉀 0.625 g/L; 酵母提取物 0.7 g/L; 硫酸亞鐵 0.01875 g/L; 尿素 2.5 g/L； 六水氯化鈷 0.003125 g/L； 氯化鈣 0.0065 g/L。
[0015] 其中，各組分在培養(yǎng)基中的含量可在±10% (更佳地±5% )范圍內(nèi)浮動。
[0016] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中，各組分配制于水中；所述的水較佳地是 去離子水。
[0017] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基的pH值5. 8 ±0. 5。
[0018] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的北極絲狀真菌Eutypella sp?是Eutypella sp.D_l〇
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)北極絲狀真菌 (Eutypella sp.)，生產(chǎn)二貓類化合物L(fēng)ibertellenone H〇
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供制備所述的北極絲狀真菌（Eutypella sp.)的培養(yǎng)基 的方法，所述方法包括：
[0021] (1)配制六水氯化鈷和氯化鈣的母液；
[0022] (2)將蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、酵母提取物、硫酸亞 鐵、尿素用適量的水溶解；與（1)配制的六水氯化鈷和氯化鈣的母液混合；其中，各組分的 用量按照前面任一所述。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的方法還包括：將pH調(diào)至5. 8±0. 5,在15°C滅菌 20min〇
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種利用北極絲狀真菌（Eutypellasp.)生 產(chǎn)LibertellenoneH的方法，所述方法包括：利用所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)北極絲狀真菌 (Eutypellasp.)，從而生產(chǎn)LibertellenoneH〇
[0025] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，將北極絲狀真菌（Eutypellasp.)的種子液按體積比 5-10%的接種量接種入前面任一所述的培養(yǎng)基，置于20°C、180r/min搖床培養(yǎng)8-12天，獲 得發(fā)酵液，其中含有二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneH。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)北極絲狀真菌（Eutypellasp.)的試劑 盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明前面所述的培養(yǎng)基。
[0027] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研宄，研宄開發(fā)了一種新的適合于北極絲狀真菌 Eutypellasp.高效生產(chǎn)二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneH的培養(yǎng)基配方。本發(fā)明的培養(yǎng) 基，適合于北極絲狀真菌Eutypellasp.的生長，且可大幅提高LibertellenoneH的產(chǎn)量。
[0029] 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構(gòu)成"、 "基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成";"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由...... 構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0030] 術(shù)語"本發(fā)明的北極絲狀真菌（Eutypellasp.)的培養(yǎng)基"指含有蔗糖、硝酸鈉、 三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、酵母提取物、硫酸亞鐵、尿素，以及可選的六水氯化 鈷和氯化鈣的組合物；或基本上由蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、酵 母提取物、硫酸亞鐵、尿素，以及可選的六水氯化鈷和氯化鈣組成的組合物。在組合物中， 所述的蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、酵母提取物、硫酸亞鐵、尿素以 及可選的六水氯化鈷、氯化鈣占培養(yǎng)基總重量的80-100%，較佳地占90-100%，更佳地占 95-100%，如 98%，99%。
[0031] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的培養(yǎng)基中還添加六水氯化鈷和氯化鈣，六水氯化 鈷和氯化鈣的添加量以提高菌體生長和生產(chǎn)所需為宜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照經(jīng)驗添加。
[0032] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的北極絲狀真菌（Eutypellasp.)(更佳 的是Eutypellasp.D-1)培養(yǎng)基的各組分的用量如表1所示。
[0033]表1
[0034]
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的揭示，在得知了本發(fā)明的北極絲狀真菌（Eutypellasp.)(更佳的是 Eutypellasp.D-1)培養(yǎng)基所用的組分及其配方以后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地配制所述 的培養(yǎng)基。
[0037] 本發(fā)明的培養(yǎng)基的應(yīng)用的組分（原