料）均為商業(yè)化的普通化學(xué)產(chǎn)品，價(jià)格比較低， 制備也非常簡(jiǎn)單，與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的新型培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)北極絲狀真 菌（Eutypellasp.)發(fā)酵生產(chǎn)LibertellenoneH，LibertellenoneH的產(chǎn)量得到顯著提 高，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0038] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在配制所述的北極絲狀真菌（Eutypellasp.)(更佳的是 Eutypellasp.D-1)培養(yǎng)基時(shí)，先分別準(zhǔn)確稱取各組分，將它們混合于水中。所述的水較佳 地為去離子水。更優(yōu)選的，提供一種用于制備上述培養(yǎng)基的方法，包括步驟：
[0039] (a)配制微量元素六水氯化鈷和氯化鈣的高濃度（1000倍）母液；
[0040](b)將所述蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、酵母提取物、硫酸 亞鐵、尿素用適量的水溶解；
[0041] (c)在上述溶液中添加六水氯化鈷和氯化鈣微量元素的母液；
[0042] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟（c)之后，進(jìn)一步包括：將pH調(diào)至5. 8±0. 5,在 115°C滅菌 20min。
[0043] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，還提供了使用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)北極絲狀真菌 (Eutypellasp.)(更佳的是Eutypellasp.D-1)發(fā)酵生產(chǎn)LibertellenoneH的發(fā)酵方法， 包括步驟：
[0044] (a)用接種環(huán)挑取保種管中的菌絲垂直插入固體培養(yǎng)基中央，于28°C條件下培養(yǎng) 7 ~8d;
[0045] (b)采用普通錐形瓶培養(yǎng)種子液，8層紗布保證無(wú)菌透氣。用直徑1cm的打孔器在 固體平板上打孔，用接種鏟將瓊脂圓塊均勻切割成4塊，接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的錐 形瓶中，置于28°C、180r/min搖床中培養(yǎng)3. 5d(視種子的具體生長(zhǎng)情況而定），按照5% (v/ v)接種量接入相同種子培養(yǎng)基，于28°C、180r/min搖床培養(yǎng)2. 5d，獲得新鮮二級(jí)種子液，用 于發(fā)酵培養(yǎng)；
[0046] (c)采用普通錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在裝液量為50ml的錐形瓶中按照5% (v/v)的接 種量接入新鮮種子液，置于20°C、180r/min搖床培養(yǎng)10d獲得發(fā)酵液。
[0047] 較佳地，將_80°C保存的菌種解凍后，用無(wú)菌接種環(huán)挑取菌絲，垂直插入固體培養(yǎng) 基中央，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中，活化培養(yǎng)7~8d，獲得新鮮固體平板，然后置于4°C冰箱保 存待用，以后固體平板每隔30d重新活化一次。
[0048] 較佳地，每升活化培養(yǎng)基包含有葡萄糖20g/L，馬鈴薯浸出粉10g/L，其余為去離 子水，在121°C滅菌20-30min。較佳地，每升固體平板活化培養(yǎng)基是在活化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上 添加瓊脂粉15_20g。
[0049] 本發(fā)明還提供了一種上述發(fā)酵方法生產(chǎn)的Libertellenone H的檢測(cè)方法，其操作 步驟包括：
[0050] 取培養(yǎng)至10d的發(fā)酵液10ml，加入等體積乙酸乙醋，并加入30顆玻璃珠（直徑為 3_5mm)，封口后，于搖床20°C、180r/min條件下萃取36h，將其全部轉(zhuǎn)移到50ml離心管中， 4500r/min離心lOmin后，取上層有機(jī)相進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（37°C)，旋干后，在茄形燒瓶中 加入1. 5ml的甲醇，超聲助溶，將洗滌液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，于13400g離心10min后取 上清，置于4°C保存，并用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)。
[0051] 本發(fā)明的有益效果具體如下：
[0052] 1.本發(fā)明的新型培養(yǎng)基成分包括蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯 化鉀、酵母提取物、硫酸亞鐵、尿素，以及可選的六水氯化鈷、氯化鈣，均為常見(jiàn)試劑，原料易 得，用量少，成本低；
[0053] 2.制備本發(fā)明的新型培養(yǎng)基時(shí)，先將蔗糖、硝酸鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、 氯化鉀、酵母提取物、硫酸亞鐵、尿素用適量去離子水溶解，再添加少量微量元素液，定容即 可，制備簡(jiǎn)單；
[0054] 3.采用本發(fā)明的新型發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)北極絲狀真菌Eutypellasp.D-1，發(fā)酵結(jié)束 時(shí)，從該菌株發(fā)酵萃取物中檢測(cè)到的LibertellenoneH的產(chǎn)量有顯著提高，最終產(chǎn)量從原 來(lái)的0. 18mg/L提高到10. 7mg/L，大約是原始水平的59倍。該發(fā)明對(duì)于后續(xù)北極絲狀真菌 Eutypellasp.D-1的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)及LibertellenoneH的藥理藥效研宄具有重要的指 導(dǎo)意義。
[0055] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0056] 實(shí)施例1、培養(yǎng)基1
[0057] L 1實(shí)驗(yàn)菌株及保藏方法
[0058]彎孢聚殼菌D-1(Eutypella sp.D-1，菌種保藏編號(hào)：CCTCCM2013144)由中國(guó)人民 解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)提供。菌株接種于種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)3. 5d后獲得新鮮種子液，50%甘 油與新鮮種子液按2:3比例混合于保種管，-80°C冷凍保藏，并取新鮮種子液于安瓿管中經(jīng) 冷凍真空干燥保存。
[0059] 1. 2固體平板、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基1的配制
[0060] 固體平板及種子液體培養(yǎng)基：
[0061] 葡萄糖 125g/L， 硝酸鈉 3.3g/L， 三水鱗酸氫二鉀 0.07g/L， 七水硫酸鎂 0.4g/L， 氯化鉀 0.625g/L， 酵母提取物 0.7g/L， 六水氯化鈷 0.003125 g/L，
[0062] 硫酸亞鐵 0.01875g/L， 氯化鈣 0.0065g/L， L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽 15g/L;
[0063] 培養(yǎng)基的pH調(diào)至5. 8。固體平板培養(yǎng)基則是在此基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉，于 121°C條件下滅菌20min。
[0064] 發(fā)酵培養(yǎng)基1 :
[0065] 葡萄糖 125g/L， 硝酸鈉 5.3g/L， 三水磷酸氫二鉀 0.1 g/L， 七水硫酸鎂 1 g/L， 氯化鉀 1.125 g/L， 酵母提取物 1.2 g/L, 硫酸亞鐵 0.05875g/L， 氯化鈣 0.0065g/L， 六水氯化鈷 0.003125g/L， L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽 20g/L;
[0066]pH調(diào)至5. 8,于115°C條件下滅菌20min。
[0067] 1. 3發(fā)酵生產(chǎn)二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneH
[0068]固體平板培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取保種管中的菌絲垂直插入固體培養(yǎng)基中央，于28°C條件下培養(yǎng)7~8d。
[0069] 種子培養(yǎng)：種子液均采用500ml普通錐形瓶培養(yǎng)，8層紗布保證無(wú)菌透氣。用直徑 lcm的打孔器在固體平板上打孔，用接種鏟將瓊脂圓塊均勻切割成4塊，接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于28°C、180r/min搖床中培養(yǎng)3. 5d(視種子的具體生長(zhǎng)情況而 定），按照5% (v/v)接種量接入相同種子培養(yǎng)基，于28°C、180r/min搖床培養(yǎng)2. 5d，獲得新 鮮二級(jí)種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)。
[0070] 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)均采用250ml的普通錐形瓶培養(yǎng)，在裝液量為50ml的錐 形瓶中按照5% (v/v)的接種量接入新鮮種子液，置于20± 1°C、180±20r/min搖床培養(yǎng)10 天。
[0071] 1. 4二貓類化合物L(fēng)ibertellenoneH產(chǎn)量的測(cè)定
[0072] 取上一步驟制備的發(fā)酵液10ml，加入等體積乙酸乙酯，并加入30顆玻璃珠（直徑 為3_5mm)，封口后，于搖床20°C、180r/min條件下萃取36h，將其全部轉(zhuǎn)移到50ml離心管 中，4500r/min離心lOmin后，取上層有機(jī)相進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（37°C)，旋干后，在茄形燒瓶 中加入1. 5ml的甲醇，超聲助溶，將洗滌液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，于13400g離心lOmin后 取上清，置于4°C保存，并用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)。
[0073]HPLC檢測(cè)條件：高效液相色譜儀（Agilent1200)，液相色譜柱為 Kromasil-C18(250mmX4. 6mm,1〇〇A:)，柱溫 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng) 332nm，流速lml/min，進(jìn)樣量 為20yl，流動(dòng)相為0. 1%乙酸（A相）和乙腈（B相），洗脫梯度為：0~10min，5~60%B相；10 ~30min，60%B相；30. 1 ~35min，100%B相。LibertellenoneH標(biāo)準(zhǔn)品的停留時(shí)間 為26-27min。對(duì)所得液相峰積分并計(jì)算峰面積，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y= 24. 369x+l. 6144， r2= 〇. 9999)換算得到產(chǎn)物產(chǎn)量，其中y為峰面積，x為進(jìn)樣濃度（