專利名稱：大白菜phk4蛋白編碼序列及其功能驗證的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學和基因工程領(lǐng)域。具體涉及到大白菜PHK4蛋白的編碼序 列及其功能驗證。
背景技術(shù)：
在高等植物中，細胞分裂素廣泛參與了對植物生長發(fā)育的調(diào)控，包括參與配子細 胞與胚胎發(fā)育；促進芽的分化；調(diào)控頂端優(yōu)勢、抑制主根的伸長；促進維管束的形成、花和 果實的發(fā)育；參與脅迫反應和病原抵抗以及延緩開花時間和葉片衰老等。細胞分裂素的調(diào)控作用是通過信號網(wǎng)絡實現(xiàn)的。細胞分裂素受體負責細胞分裂素 信號的感應和轉(zhuǎn)導，是信號傳遞的起始點。大白菜是一種重要的蔬菜作物。分離大白菜的細胞分裂素受體基因，將為利用基 因工程手段調(diào)控大白菜的株型、單株重、生育期、根系發(fā)育，提高大白菜耐生物/非生物脅 迫能力奠定重要基礎。目前已公布的大白菜基因組測序結(jié)果尚不完整，大白菜細胞分裂素受體 PHK4(pekinensis histidin kinase4)蛋白的編碼序列至今在國內(nèi)外未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了大白菜細胞分裂素受體PHK4蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及該蛋白的編 碼基因的核苷酸序列及其功能驗證。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明分離出了多核苷酸，其序列特征是序列全長3156bp，編號為SEQ ID NO 1。該分子含有大白菜細胞分裂素受體PHK4蛋白的編碼序列。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)多肽，其特征是具有SEQ IDNO 2氨基酸序列。本發(fā)明提供了包含上述多核苷酸的載體。本發(fā)明提供了一種上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞，在實例中該宿主細胞是大腸 桿菌感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞、酵母Aslnl突變體和擬南芥ahk4-l突變體。本發(fā)明提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將PHK4基因轉(zhuǎn)化入酵母突變體Δ slnl和擬南 芥ahk4-l突變體來驗證PHK4具有細胞分裂素受體功能的方法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。實施例1大白菜細胞分裂素受體PHK4的基因組編碼序列的分離用已知的十字花科植物細胞分裂素受體基因cDNA序列，通過比較，得到相似性較 高的一段大白菜的EST序列，在其上設計引物進行反向PCR擴增，得到該EST序列兩側(cè)未知序列，通過染色體步移技術(shù)進一步向一端延伸，擴增出3，端未知序列，再通過與基因序列庫 的比對分析，尋找基因相似性較高的序列，在其上設計引物，通過常規(guī)PCR擴增獲得5’端序 列，拼接后獲得一段全長為8474bp的DNA序列。該序列包含PHK4蛋白的基因組編碼序列。詳細過程如下1、植物基因組DNA的環(huán)化提取植物基因組DNA，利用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，然后通過T4DNA Ligase使酶切片段進行自身環(huán)化。2、反向 PCR設計反向PCR引物，引物序列為Pl :5，-GGATATTCAAATGCCACAG-3，(SEQ ID NO 3)P2 :5，-ATGAAGCAAGCATCGAAAG-3‘ (SEQ ID NO 4)以環(huán)化DNA作為模板，以P1，P2作為引物進行反向PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行嵌套 PCR，嵌套PCR擴增引物為P3 :GATTCTAGCCATGACAGC(SEQ ID NO 5)P4:TGTTGGAGGTGTCGTGCTT(SEQ ID NO 6)回收擴增產(chǎn)物，連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克 隆，提取質(zhì)粒，測序，與已知片段重復序列拼接。以此片段再次設計反向PCR引物，引物序列 為P5 :CATGGGAGACTTAGACGTGG(SEQ ID NO 7)P6 :CTCGAAGTGGAGCTATCCGC(SEQ ID NO 8)進行反向PCR擴增，回收擴增產(chǎn)物，連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) 細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序，將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，獲得了長度為3249bp的 DNA片段。比對分析結(jié)果表明該序列包括PHK4基因完整3’端。3、染色體步移在3249bp片段的5’端設計三條特異性嵌套引物，引物序列為P-SPl :TTTGGAAGCGGCGGTTATGTCT(SEQ ID NO :9)P-SP2 :TCCTCCGACGAGAGTAAGTGTTT(SEQ ID NO :10)P-SP3 :TCAAACCAATCCCAGTGCCTCC(SEQ ID NO :11)與大連寶生物公司的染色體步移試劑盒中提供的四種經(jīng)過獨特設計的退火溫度 較低的兼并引物，即API，AP2，AP3，AP4進行熱不對稱PCR反應。通過三次巢式PCR反應， 得到向3249bp片段5，端延伸的產(chǎn)物，片段長度為2627bp，回收擴增產(chǎn)物，連接到pMD19_T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序，與已知片段重復序列拼 接后得到長度為M93bp序列。4、常規(guī) PCR將實驗得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，設計引物RL-F，2-SP2 ；RL-F :TGTTATTGGGTCTCGCCTGG(SEQ ID NO :12)2-SP2 :GTTGTTCATCTTCACCGCCACTG(SEQ ID NO :13)進行常規(guī)PCR擴增，得到長度為3148bp的基因片段。將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，獲得了全長為8474bp的DNA序列。該序列包含PHK4蛋白的基因組編碼序列。實施例2大白菜細胞分裂素受體PHK4基因CDS序列的克隆1、大白菜總RNA的分離取大白菜新鮮的幼嫩葉片，用液氮速凍，充分研磨。將樣品粉末轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管 中，加入Trizol提取總RNA02、RT-PCR將實施例1中獲得的PHK4蛋白的基因組編碼序列用GENSCAN分析，預測到了該基 因的⑶S序列。在預測的外顯子序列上設計一對引物PHK4A-F和PHK4A-R，序列為PHK4A-F :GTTCACGCTTTGGCTATTCT(SEQ ID NO :14)PHK4A-R :CTTCCTTCTCCATCATCCTT(SEQ ID NO :15)以提取的大白菜總RNA為模板，PHK4A-F和PHK4A-R為引物，進行RT-PCR反應，擴 增得到2065bp的cDNA片段。回收擴增產(chǎn)物，連接到pMD19_T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) 細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序。3、3，-RACE按照AMBIONRACE cDNA Amplification Kit 的引物設計原則，在得到的 2065bp 的 cDNA上設計兩個正向嵌套引物SPl和SP2，按照試劑盒的操作說明進行實驗，先以3’ RACE adaptor (GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN)進行反向 PCR,獲得 cDNA 第一鏈，然后以Adaptorl和SPl為引物，進行第一輪PCR反應；Adaptorl和SPl引物序列 如下SPl :CCTTCAGGAACAACGAAACTGG(SEQ ID NO :16)Adaptorl :GCGAGCACAGAATTAATACGACT(SEQ ID NO :17)以Adaptor2和SP2為引物，進行第二輪PCR反應，得到854bp的片段。Adaptor2 和SP2引物序列如下SP2 :CACAAGACACCGAAACTCGC(SEQ ID NO :18)Adaptor2 :C GCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO :19)將擴增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提 取質(zhì)粒，測序。將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，與2065bp片段拼接后長度為^74bp，比對分析表 明結(jié)果表明其中包括PHK4基因cDNA完整的3’端序列。4、PHK4基因CDS的獲得分析實施例1獲得的PHK4基因的基因組DNA序列，預測起始密碼子，以預測的密 碼子為起始設計正向引物5’ -229，在得到的PHK4基因cDNA的3’端序列上的UTR區(qū)設計 一個反向引物PHK4H-R ；引物5’ -229和PHK4H-R的序列如下5，-229 :ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :20)PHK4H-R ggTACAAATCgAACTCCggT(SEQ ID NO 21)以cDNA為模板進行PCR擴增，得到3156bp的cDNA的片段，在本說明書中編號為 SEQ ID N01。將擴增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆， 提取質(zhì)粒，測序。其中1-2985為PHK4的CDS。實施例3 PHK4可以恢復酵母Δ slnl突變體對細胞分裂素的應答
1、含有PHK4基因的酵母表達載體的構(gòu)建在獲得大白菜cDNA基因序列的基礎上，設計引入限制性內(nèi)切酶位點的引物 PHK4H-R(Notl)和5' -229 (Spel)，以大白菜cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆 到pMD19T-載體上，進一步克隆到酵母表達載體pCUY315上，構(gòu)建成pCUY315_3k酵母融合 表達載體。PHK4H-R(Notl) :ata aga atg egg ccg egg TACAMTCgAACTCCggT (SEQ ID NO :22)5' -229(Spel) :gga cta gt ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :23)2、酵母Δ slnl突變體菌株TM182的轉(zhuǎn)化挑取酵母八81111突變體菌株111182單克隆于液體￥ 0培養(yǎng)基，于301，160印111條 件下過夜培養(yǎng)，制備酵母感受態(tài)，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有PHK4基因的酵母表達載 體pCUY315-3k、對照表達載體pCUY315、或含有擬南芥AHK4基因的pCUY90載體轉(zhuǎn)化到酵母 TM182菌株中。3、檢測轉(zhuǎn)基因酵母Δ slnl突變體對細胞分裂素的應答將pCOT315_3k、或pCUY90、或pCOT315轉(zhuǎn)化到酵母Δ slnl突變體菌株TM182中以 后，均勻涂到含有2%葡萄糖的SC培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基的中間放置一張無菌過濾滅菌膜，在 膜上滴加細胞分裂素(濃度為50μΜ，采用DMSO溶解)，30°C培養(yǎng)2-3天。在細胞分裂素的 刺激下，轉(zhuǎn)化了 pCUY315-3k和pCUY90的培養(yǎng)基均長出菌落，而轉(zhuǎn)化了 pCUY315的培養(yǎng)基則 未長菌落。說明大白菜PHK4蛋白和擬南芥AHK4蛋白均能使Aslnl突變體恢復對細胞分 裂素的應答，PHK4與AHK4具有相似的作用，即具有細胞分裂素受體的功能。實施例4PHK4可以恢復擬南芥ahk4_l突變體對細胞分裂素的應答1、含有PHK4基因的農(nóng)桿菌表達載體的構(gòu)建根據(jù)大白菜PHK4基因的ORF序列，設計引入限制性內(nèi)切酶位點的引物 PHK4H-R(BglII)禾口 5' -229(Spel)；PHK4H-R(Bgl II) :gaa gat ctg g TACAAATCgAACTCCggT(SEQ ID NO :24)5' -229(Spe 1) :gga cta gt ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :25)擴增出帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點的PHK4基因ORF全長，克隆到pMD19_T載體 上，進一步克隆到農(nóng)桿菌表達載體P35S 1300上，并將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。2、利用葉盤法轉(zhuǎn)化擬南芥取生長兩周左右的擬南芥突變體和野生型的根組織，接到愈傷誘導培養(yǎng)基上預培 養(yǎng)2-3天；利用無菌牙簽挑取YEB選擇培養(yǎng)基上的陽性菌落(攜帶含PHK4基因的農(nóng)桿菌表 達載體)，接種于2ml液體YEB培養(yǎng)基中(Kan+，Rif+)，160rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。同 時培養(yǎng)對照菌株(攜帶不含有PHK4基因的p35S 1300質(zhì)粒)。室溫下4000轉(zhuǎn)離心lOmin，收集菌體；菌體用V2MS液體培養(yǎng)基重懸，使菌液的0D600 = 0. 3-0. 5 ；將經(jīng)過預培養(yǎng)的葉片浸于制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌 液；把經(jīng)侵染的葉片接于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2天；共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)到含有抑菌抗生素及具有選擇壓的愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天左右，然后轉(zhuǎn)到含有細胞分裂素的分化培養(yǎng)基上，可見野生型愈傷組織以及轉(zhuǎn)化了 PHK4基因的ahk4_l突變體愈傷組織轉(zhuǎn)綠，而用對照菌株轉(zhuǎn)化的突變體愈傷組織不轉(zhuǎn)綠。說 明PHK4恢復了擬南芥ahk4-l突變體感受細胞分裂素的功能，PHK4具有細胞分裂素受體的 功能。


附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定本發(fā)明的范圍。圖1 轉(zhuǎn)基因酵母Δ slnl突變體對細胞分裂素應答的檢測圖中1、含有pCUY315_3k融合載體的酵母轉(zhuǎn)化體在滴加了細胞分裂素的膜上形 成的菌落。2 含有pCUY90融合載體的酵母轉(zhuǎn)化體在滴加了細胞分裂素膜上形成的菌落。3 含有pCUY315的酵母轉(zhuǎn)化體在滴加了細胞分裂素的膜上未形成菌落。序列表<110>遼寧師范大學<120>大白菜PHK4蛋白編碼序列及其功能驗證<160>25<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>3156<212>DNA〈213〉大白菜(BrassiesL pekinensis Rupr.)
〈220〉
<221>CDS
〈222〉⑴…(2985)
<400>1
atgggtttcgccaagatgcagcattcagtggcggtgaagatgaacaacgg60
gaccaagtgggtaacaaaaaggggtcaactttcatacaggaacacagagctttattacca120
aagggtttgattctatggacaatcattgtcgggtttataagcagagggatttatcagtgg180
atggatgatactagcaaggtcagaagagaagaggttttggttagtatgtgtgatcagaga240
gccaggatgttgcaggatcagtttagtgttagtgttaaccatgttcacgctttggctatt300
cttgtctcaacgtttcattaccacaagaatccatctgcaattgatcaggggacatttgct360
gactatacagcgagaacagcatttgagagaccgttgctaagtggagtggcttacgctgaa420
aaggttgtgaatgctgagagggagatgtttgagagtcagcacaattgggttataaagaca480
atggacacaggagagccttcacctgtgagggacgagtatgctcccgtcatcttctctcaa540
gacagtgtctcttacctcgagtcactagacatgatgtcaggagaggaggatagagagaac600
attctgagagctagagagacagggaaagctgtcttaacaagcccttttagactactggct660
tctcaccatctaggagttgtgttaaccttccctgtgtacaaagcctctcttcctaaaaac720
cccaccgtccaagagcgtatagcagccaccgcagggtacctcggcggcgcgtttgacgtt780
gagtcactcgttgagaatctactcggtcagctcgctggcaaccaggcgatagtagtgcat840
gtgtatgacatcaccaacgcgtcggatcctctcgtcatgtacgggaaccaagacgaagaa900
ggcgacacgtctctctaccacgagagcaag cttgattttg gagaccctttcaggaagcat960
aagatgatctgtaggtacctccagaaggcgcctataccgttgaacgtactcacgaccgtg1020
ccgttgttctttgctattggcttcttggttggttacatactctacggtgcagctgttcat1080
atagttaaagttgaagatgatttccatgagatgcaagagctcaaggtccgagcagaagct1140
gctgacgtggctaaatcgcagtttcttgcgaccgtctctcacgagataaggacgccgatg1200
aatgggattcttggaatgcttgctatgcttcttgatacggagcttagctctacgcagaga1260
gattacgctcagaccgcgcaggtttgtggtaaagctttgattgcgttgataaacgaggtt1320
cttgatcgtgccaagatcgaagctgggaagctggagttggagtctgtgccttttgatata1380
cgttcgatattagatgatgttctttctctcttctctgaggagtcaaggaacaaaggcatt1440
gagcttgcggttttcgtttcagacaaggtacctgagatagtcaaaggagattcagggaga1500
ttcagacagateatcataaaccttgtcggaaactctgttaaattcacagagaaaggacat1560
atctttgtcaaagtccatctggcggaacaatcaaaagacggagctgaatccaaacccgca1620
ctaaacggaggagtagcctctgaagacataaccgccgcttccaaaccttcaagttacaac1680
acactgagcggctacgaagctgctgacggtcgaaacagctgggactcattcaaacactta1740
ctctcgtcggaggagctgttgacatcatcagagttcgaagcttccagtaacgtcaggctt1800
atggtttctatcgaagacacaggcattgggatccctttaaccgcgcaaggacgtgtcttc1860
atgccgtttatgcaagcggatagctccacttcgagaacctacggaggtactgggattggt1920
ttgagtataagcaagtgtcttgtcgagcttatgcgcggtcagataagtttcgtgagcagg1980
cctcgcgttggtagcacgttttggttcactgctgtgtttgagaggtgtgataaatgtagt2040
ctgaagaagcctacggttgagaatctgccttctagttttagagggatgagagctattgtt2100
gttgatgctaagcctgttcgagctgcggtgactaggtatcatatgaagagacttgggatc2160
agtgttgatgtcatgacaagtctcagaaccgctgtttctactgcgtctggaagaaacggt2220
tctcctcttccttcaggaacaacgaaactggatatgatcttggtggagaaagattcatgg2280
atatcaaccgaagatatagacgcggagatacgtcagatgaactcaagaaccaacggaaac2340
gtgcatcacaagacaccgaaactcgctctattcgcaacgaacatcaccaactcagagttc2400
gacagagctaaatccgcagggtttgctgatacggtgataatgaagccgttgagagcaagc2460
atgatcggcgcgtgtttacagcaagttctcgagctgagaaaggcgagacagcagcatcct2520
gagggatcatcaccagcaacgctcaagagtttgcttacagggaagaagattctggtggtt2580
gatgataatatggtgaacaggagagtagctgcaggagctctgaagaagtttggagcagag2640
gtggtgtgtgcagagagtggtcaagttgctttgggtttgcttcagattccacacagtttc2700
gatgcttgcttcatggatattcaaatgccacagatggacgggtttgaagcgactcgtcag2760
ataaggatgatggagaaggaagctaaagagaagacgaagctggaatggcatttaccgatt2820
ctagccatgacagctgatgtgatccacgcgacatacgaggagtgtctgaaaagtggaatg2880
gatggttatgtctctaaaccatttgaagaagagaatctctacaagtctgttgccaaatca2940
ttcaaagctaacccaatctcagattcatcatgtagccaaagttgaagaagaagaagaaac3000
atcgtgtcaggaaaagaaacatgcaacatggttggttcgtgtgtacatatagggctcgga3060
gattttgaaagtttgcttttgaccagtaatagtaatgtttgtgaaacgacggttcaggtg3120
ttgatattaa tccttaccgg agttcgatttgtaccg3156
<210>2
<211>994
<212>PRT
<213>大白菜(Brassica pekinensis Rupr.)
<400>2
MetGlyPheAlaLysMetGlnHisSerValAlaValLysMetAsnAsn
151015
GlyAsnAsnAsnAspGlnValGlyAsnLysLysGlySerThrPhelie
202530
GlnGluHisArgAlaLeuLeuProLysGlyLeulieLeuTrpThrlie
354045
IleValGlyPhelieSerArgGlylieTyrGlnTrpMetAspAspThr
505560
SerLysValArgArgGluGluValLeuValSerMetCysAspGlnArg
65707580
AlaArgMetLeuGlnAspGlnPheSerValSerValAsnHisValHis
81859095
AlaLeuAlalieLeuValSerThrPheHisTyrHisLysAsnProSer
100105110
AlalieAspGlnGlyThrPheAlaAspTyrThrAlaArgThrAlaPhe
115120125
GluArgProLeuLeuSerGlyValAlaTyrAlaGluLysValValAsn
130135140
AlaGluArgGluMetPheGluSerGlnHisAsnTrpVallieLysThr
145150155160
MetAspThrGlyGluProSerProValArgAspGluTyrAlaProVal
161165170175
liePheSerGlnAspSerValSerTyrLeuGluSerLeuAspMetMet
180185190
SerGlyGluGluAspArgGluAsrlieLeuArgAlaArgGluThrGly
195200205
LysAlaValLeuThrSerProPheArgLeuLeuAlaSerHisHisLeu
210215220
GlyValValLeuThrPheProValTyrLysAlaSerLeuProLysAsn
225230235240
ProThrValGlnGluArglieAlaAlaThrAlaGlyTyrLeuGlyGly
245250255
AlaPheAspValGluSerLeuValGluAsnLeuLeuGlyGlnLeuAla
260265270
GlyAsnGlnAlalieValValHisValTyrAsplieThrAsnAlaSer
275280285
AspProLeuValMetTyrGlyAsnGlnAspGluGluGlyAspThrSer
290295300
LeuTyrHisGluSerLysLeuAspPheGlyAspProPheArgLysHis
305311315320
LysMetlieCysArgTyrLeuGlnLysAlaProlieProLeuAsnVal
321325330335
LeuThrThrValProLeuPhePheAlalieGlyPheLeuValGlyTyr
340345350
IleLeuTyrGlyAlaAlaValHislieValLysValGluAspAspPhe
355360365
HisGluMetGlnGluLeuLysValArgAlaGluAlaAlaAspValAla
370375380
LysSerGlnPheLeuAlaThrValSerHisGlulieArgThrProMet
385390395400
AsnGlylieLeuGlyMetLeuAlaMetLeuLeuAspThrGluLeuSer
405410415
SerThr Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys Ala
420425430
LeulieAlaLeulieAsnGluValLeuAspArgAlaLyslieGluAla
435440445
GlyLysLeuGluLeuGluSerValProPheAsplieArgSerlieLeu
450455460
AspAspValLeuSerLeuPheSerGluGluSerArgAsnLysGlylie
465470475480
GluLeuAlaValPheValSerAspLysValProGlulieValLysGly
485490495
AspSerGlyArgPheArgGlnlielielieAsnLeuValGlyAsnSer
500505510
ValLysPheThrGluLysGlyHisliePheValLysValHisLeuAla
515520525
GluGlnSerLysAspGlyAlaGluSerLysProAlaLeuAsnGlyGly
530535540
ValAlaSerGluAsplieThrAlaAlaSerLysProSerSerTyrAsn
545550555560
ThrLeuSerGlyTyrGluAlaAlaAspGlyArgAsnSerTrpAspSer
565570575
PheLysHisLeuLeuSerSerGluGluLeuLeuThrSerSerGluPhe
580585590
GluAlaSerSerAsnValArgLeuMetValSerlieGluAspThrGly
595600605
IleGlylieProLeuThrAlaGlnGlyArgValPheMetProPheMet
610615620
GlnAlaAspSerSerThrSerArgThrTyrGlyGlyThrGlylieGly
625630635640
LauSerlieSerLysCysLeuValGluLeuMetArgGlyGlnlieSer
645650655
PheValSerArgProArgValGlySerThrPheTrpPheThrAlaVal
660665670
PheGluArgCysAspLysCysSerLeuLysLysProThrValGluAsn
675680685
LeuProSerSerPheArgGlyMetArgAlalieValValAspAlaLys
690695700
ProValArgAlaAlaValThrArgTyrHisMetLysArgLeuGlylie
705710715720
SerValAspValMetThrSerLeuArgThrAlaValSerThrAlaSer
725730735
GlyArgAsrGlySerProLeuProSerGlyThrThrLysLeuAspMet
740745750
IleLeuValGluLysAspSerTrplieSerThrGluAsplieAspAla
755760765
GlulieArgGlnMetAsnSerArgThrAsnGlyAsnValHisHisLys
770775780
ThrProLysLeuAlaLeuPheAlaThrAsnlieThrAsnSerGluPhe
785790795800
AspArgAlaLysSerAlaGlyPheAlaAspThrVallieMetLysPro
805810815
LeuArgAlaSerMetlieGlyAlaCysLeuGlnGlnValLeuGluLeu
820825830
ArgLysAlaArgGlnGlnHisProGluGlySerSerProAlaThrLeu
835840845
LysSerLeuLeuThrGlyLysLyslieLeuValValAspAspAsnMet
850855860
ValAsnArgArgValAlaAlaGlyAlaLeuLysLysPheGlyAlaGlu
865870875880
ValValCysAlaGluSerGlyGlnValAlaLeuGlyLeuLeuGlnlie
885890895
Pro His Ser Phe AspAla Cys PheMet Asp lie Gln Met Pro
900905 910
Asp Gly Phe Glu AlaThr Arg Glnlie Arg Met Met Glu Lys
915920925
Lys Glu Lys Thr LysLeu Glu TrpHis Leu Pro lie Leu Ala
930935940
Ala Asp Val lie HisAla Thr TyrGlu Glu Cys Leu Lys Ser
945950955
Asp Gly Tyr Val SerLys Pro PheGlu Glu Glu Asn Leu Tyr
965970
Val Ala Lys Ser PheLys Ala AsnPro lie Ser Asp Ser Ser
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Gln Ser
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ggatattcaa atgccacag
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tgttggaggt gtcgtgctt
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Gln
Glu
Met
Gly
Lys 975 Cys
Met
Ala
Thr
Met 960
Ser
Ser
12
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ggactagtat gggtttcgccaagatgcagc
權(quán)利要求
1.一種分離的大白菜PHK4蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO 2氨基酸 序列的多肽、或?qū)EQ ID NO :2氨基酸序列的一個或數(shù)個氨基酸殘基缺失、插入或取代而形 成的保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼如權(quán)利要求1所述多肽的 多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQID NO :1中1-3156 位的序列或其互補序列，或具有SEQ ID NO 1中H985位的序列或其互補序列。
4.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利求3所述的多核苷酸或該多核苷酸的部分片段。
5.一種用權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的 載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在大白菜中表達的PHK4蛋白、編碼序列及其所起的細胞分裂素受體的作用。本發(fā)明涉及到所述基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的重組表達載體。還涉及所述基因表達載體轉(zhuǎn)化酵母細胞、植物細胞，以及由轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的所屬基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代、種子及植物組織。本發(fā)明所獲得的蛋白具有細胞分裂素受體的功能。
文檔編號C12N9/12GK102108345SQ20091024896
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者任相亮, 李丹, 梁丹, 王火旭, 鄭萍 申請人:遼寧師范大學