專利名稱：一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法
一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種器官培養(yǎng)物的應(yīng)用，尤其涉及利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿
道下裂模型。背景技術(shù)：
尿道下裂是一種常見的先天性畸形，是由于尿道發(fā)育不全而致的尿道開口異常， 可位于陰莖至?xí)幉磕虻佬薪?jīng)的任何部位，導(dǎo)致患者排尿障礙，陰莖發(fā)育不良、陰莖屈曲畸 形、包皮發(fā)育異常等，對患者的生理和心理都會產(chǎn)生一定程度的影響。 尿道下裂在男性新生兒中的發(fā)病率達1/125 1/250，我國的發(fā)病率為3/1000。近 年來，尿道下裂發(fā)病率不明原因地增加了一倍，引起了國外健康機構(gòu)和專家的關(guān)注，美國已 啟動了這方面的研究。近幾年來，我國的一些學(xué)者也逐漸開始了對該疾病的研究。目前尿 道下裂動物模型建立的方法多種多樣，沒有一個公認的標(biāo)準。建立理想的尿道下裂動物模 型，對研究該病的病因和發(fā)病機制至關(guān)重要?，F(xiàn)在已建立的尿道下裂動物模型，主要是在孕 期給予母鼠藥物干預(yù)，導(dǎo)致仔鼠發(fā)生先天性尿道下裂。目前常用的藥物包擴干擾內(nèi)分泌因 素的藥物，雌激素類、孕激素和抗雄激素等；皮質(zhì)類固醇類藥物，強的松等；還有抗組胺類 藥物，氯雷他定等和環(huán)境中的內(nèi)分泌活性藥物，臨苯二甲酸二丁酯、DDT等。
上述不同類型的動物模型，所選動物的種類、誘導(dǎo)尿道下裂發(fā)生所用的藥物、藥物 的劑型、劑量、給藥途徑、給藥時間和頻率等都沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準。目前研究報道的尿道 下裂動物模型缺乏標(biāo)準化，每一項研究都只能代表某一種特定條件下的尿道下裂，從而使 得所有研究難以在一個相同的標(biāo)準下進行橫向比較。 此外，動物實驗，陰莖和尿道的發(fā)育深藏于子宮內(nèi)，不易觀察，機體內(nèi)存在的復(fù)雜 內(nèi)分泌環(huán)境也很難闡明其機制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法
及其利用該方法培養(yǎng)建立的體外尿道下裂模型。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案 —種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，將雄性生殖結(jié)節(jié)置于 親水性PTFE膜器官型細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為BGJB，同時加入雙氫睪酮和17-13 乙炔基雌二醇； 所述雄性生殖結(jié)節(jié)為受孕14. 5天的胚胎生殖結(jié)節(jié)； 所述雙氫睪酮和17-P乙炔基雌二醇的用量為質(zhì)量比1 : 10;所述雙氫睪酮的用量為10nM，所述17-13乙炔基雌二醇的用量為100nM。 利用上述方法即可培養(yǎng)得到所需的體外尿道下裂模型。 高濃度雌激素對在體外培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)的生長具有明顯的抑制作用。在10nM雙 氫睪酮和100nM 17-13乙炔雌二醇條件下培養(yǎng)72小時后，生殖結(jié)節(jié)的長度和表面積分別增
3加了 20. 1%，23. 8% ;而在無17-13乙炔雌二醇培養(yǎng)條件下，生殖結(jié)節(jié)的長度和表面積分別 增加了 42. 0%，45. 5%。因此乙炔雌二醇誘導(dǎo)的尿道下裂模型，其生長被顯著抑制，明顯低 于無雌激素培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)。如圖1所示，lOOnM雌激素處理的生殖結(jié)節(jié)基底部包皮生長明 顯受抑，尿道外口 (Me)的延伸受到阻礙，還停留于結(jié)節(jié)干腹側(cè)中段，而無雌激素組尿道外 口已到達生殖結(jié)節(jié)頂端，包皮發(fā)育良好，包繞結(jié)節(jié)干生長并向遠端延伸，整個生殖結(jié)節(jié)已有 出生后陰莖的雛形。 本發(fā)明提供的生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)模型，該尿道下裂模型冠狀面HE染色表現(xiàn)為如 圖2所示，整個尿道仍呈實性細胞索，上皮增生不良，排列混亂，細胞形態(tài)較圓，與培養(yǎng)前受 孕14.5天的類似。而體內(nèi)正常發(fā)育和單純加入雄激素培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)尿道近端出現(xiàn)明顯 的管化趨勢，尿道上皮細胞增生明顯，形成分層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，細胞呈現(xiàn)立方形的成熟分 化表現(xiàn)。 本發(fā)明的積極效果 本發(fā)明采用生殖結(jié)節(jié)體外培養(yǎng)，加以雌激素誘導(dǎo)，建立器官水平的尿道下裂模型， 這一模型有利于為建立標(biāo)準化的尿道下裂模型起到良好的示范作用。該模型造模成功率 高，重復(fù)性好，應(yīng)用價值高，值得推廣。


圖1為生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道下裂模型生長情況圖 圖中A為培養(yǎng)前的生殖結(jié)節(jié)，B為單純雙氫睪酮培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)，C為雌激素干預(yù) 建立的尿道下裂模型； 圖2為生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道下裂模型尿道發(fā)育情況圖 圖中A為培養(yǎng)前的生殖結(jié)節(jié)，B為體內(nèi)發(fā)育的17. 5d生殖結(jié)節(jié)，C為單純雙氫睪酮
培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)，D為雌激素干預(yù)建立的尿道下裂模型； 圖3為生殖結(jié)節(jié)的獲取及培養(yǎng)圖； 圖4為胎鼠性別鑒定，性腺解剖示意圖 圖中A、B為雌性，C、D為雄性，t為卵巢，A為睪丸。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細說明。
1.生殖結(jié)節(jié)的切取 每個孕鼠體內(nèi)平均有6 10個胚胎，呈串珠狀排列，解剖顯微鏡下切開胎膜，即可 見胚胎。如圖3所示，于會陰部兩后腿之間臍血管根部下方可見局部隆起樣生殖結(jié)節(jié)，受孕 14. 5天胚胎生殖結(jié)節(jié)約長0. 5 0. 8mm，結(jié)節(jié)腹側(cè)有尚未閉合的尿道溝。在生殖結(jié)節(jié)根部 用膜狀內(nèi)障剪迅速切下生殖結(jié)節(jié)，保證切緣光滑平整，將離體的生殖結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中， 使生殖結(jié)節(jié)位于氣液交界處。
2.性別鑒定 對每個胎鼠進行性別鑒定，生殖結(jié)節(jié)切下后即刻解剖性腺，如圖4所示，見到睪丸 者為雄性，見到卵巢者為雌性，鑒定成功率達到90% 。
3.激素誘導(dǎo)尿道下裂模型
4
將步驟2中鑒定的雄性胎鼠的生殖結(jié)節(jié)，置于30mm Millicell-CM親水性PTFE膜 器官型細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在BGJB培養(yǎng)液(Gibco公司，貨號12591)中加入10nM雙氫睪酮 (International Library公司，貨號IL1050632)和100nM的17-P乙炔基雌二醇(sigma 公司，貨號E1024)，在5% C02， 37t:條件下培養(yǎng)，每24小時換液一次，培養(yǎng)3天即可造模成 功，以單純10nM雙氫睪酮培養(yǎng)為對照判斷造模是否成功。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特征在于，將雄性生殖結(jié)節(jié)置于親水性PTFE膜器官型細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為BGJB，同時加入雙氫睪酮和17-β乙炔基雌二醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述雄性生殖結(jié)節(jié)為受孕14. 5天的胚胎生殖結(jié)節(jié)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述雙氫睪酮和17-13乙炔基雌二醇的用量為質(zhì)量比1 : 10。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述雙氫睪酮的用量為10nM，所述17-13乙炔基雌二醇的用量為100nM。
5. 利用權(quán)利要求1-4中任一方法培養(yǎng)的體外尿道下裂模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用器官培養(yǎng)物建立尿道下裂模型的方法以及利用該方法培養(yǎng)得到的體外尿道下裂模型。利用雌激素干預(yù)體外培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)，該模型的病理表現(xiàn)與目前公認的小鼠尿道下裂動物模型表現(xiàn)相同，生殖結(jié)節(jié)生長受到明顯抑制，整個尿道仍呈實性細胞索，尿道管化不明顯，上皮增生不良，排列紊亂。該模型的建立避免了在尿道發(fā)育相關(guān)研究過程中動物實驗花費高、實驗周期長和研究結(jié)果易受體內(nèi)神經(jīng)-內(nèi)分泌因素影響的特點。該模型造模成功率高，重復(fù)性好，應(yīng)用價值高，值得推廣。
文檔編號C12N5/07GK101792733SQ20091024805
公開日2010年8月4日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日 公開號200910248051.發(fā)明者周娟, 王 忠, 王浩, 陳其, 馬利民 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院