專利名稱：一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道發(fā)育模型的方法
一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道發(fā)育模型的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種器官培養(yǎng)物的應(yīng)用，尤其涉及利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿
道發(fā)育模型。背景技術(shù)：
近年來，尿道下裂等男性外生殖器發(fā)育畸形的發(fā)病率在逐漸上升，環(huán)境中有毒污
染物質(zhì)特別是一些內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)(EDCs)的增多被認(rèn)為是罪魁禍?zhǔn)?，一些能干擾內(nèi)
分泌的化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致尿道下裂的動(dòng)物模型已經(jīng)構(gòu)建成功，進(jìn)一步闡明其機(jī)制對(duì)于尿道下裂
等外生殖器發(fā)育畸形的防治至關(guān)重要，但陰莖和尿道的發(fā)育深藏于子宮內(nèi)，不易觀察，另外
機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)分泌環(huán)境也很難闡明其機(jī)制，特別在臨床研究中，陰莖尿道發(fā)育對(duì)一些物質(zhì)
短期毒性暴露的影響很難評(píng)估，而生殖結(jié)節(jié)體外器官培養(yǎng)就為這些研究提供了可能。 沒有下丘腦_垂體_腎上腺軸的影響，體外環(huán)境相對(duì)簡(jiǎn)單，這就為研究一些可疑致
畸物質(zhì)的短期毒性作用提供了方便，也利于闡明一些內(nèi)分泌干擾物質(zhì)對(duì)陰莖尿道發(fā)育的直
接影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道發(fā)育模型的方法
及其利用該方法培養(yǎng)建立的體外尿道發(fā)育模型。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案 —種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道發(fā)育模型的方法，將生殖結(jié)節(jié)置于親水 性PTFE膜器官型細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為BGJB，同時(shí)加入雙氫睪酮；
所述生殖結(jié)節(jié)為受孕14. 5天的胚胎生殖結(jié)節(jié)；
所述雙氫睪酮的用量為10nM。 利用上述方法即可培養(yǎng)得到所需的體外尿道發(fā)育模型。 如圖l所示，該尿道發(fā)育模型同樣獲得了一定程度的生長(zhǎng)，生殖結(jié)節(jié)縱軸最 大長(zhǎng)度和表面積由培養(yǎng)前的1132. 58 ± 61. 27 ii m， 1. 020 ± 0. 037mm2增長(zhǎng)至培養(yǎng)后的 1607. 60 ± 102. 19 ii m， 1. 485 ± 0. 077mm2，縱軸長(zhǎng)度和表面積的增加度分別為42. 0 % ，
45. 6% 。培養(yǎng)前原始的包皮隆起位于生殖結(jié)節(jié)基底部，生殖結(jié)節(jié)在體外培養(yǎng)72小時(shí)后，生 殖結(jié)節(jié)發(fā)生了明顯的形態(tài)變化，還可以看到明顯的包皮分化發(fā)育，向上逐漸包繞生殖結(jié)節(jié)干。 如圖2所示，生殖結(jié)節(jié)中尿道的發(fā)育形態(tài)學(xué)變化與體內(nèi)同期(受孕17.5天)生殖 結(jié)節(jié)中的尿道變化是一致的。通過尿道縱軸的生殖結(jié)節(jié)冠狀面切片HE染色，觀察生殖結(jié)節(jié) 中的尿道發(fā)育，受孕14. 5天的生殖結(jié)節(jié)，尿道為位于生殖結(jié)節(jié)中心偏腹側(cè)的單層實(shí)性上皮 細(xì)胞索，培養(yǎng)3天后，生殖結(jié)節(jié)中尿道近端出現(xiàn)明顯的管化趨勢(shì)，尿道上皮細(xì)胞增生明顯， 形成分層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈現(xiàn)立方形的成熟分化表現(xiàn)。
本發(fā)明的積極效果
本發(fā)明培養(yǎng)體外尿道發(fā)育模型的方法，為研究尿道正常發(fā)育的分子機(jī)制提供一種 可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的研究工具。更重要的是能夠利用該模型體外誘導(dǎo)先天性外生殖器畸形并進(jìn) 一步研究其發(fā)發(fā)病機(jī)理。


圖1為生殖結(jié)節(jié)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)圖 圖中A、B分別為培養(yǎng)前和培養(yǎng)7天后生殖結(jié)節(jié)(解剖顯微鏡X30)，C、D、E、F分 別為培養(yǎng)前和培養(yǎng)2、4、7天的生殖結(jié)節(jié)(倒置顯微鏡X40);
圖2為生殖結(jié)節(jié)體外細(xì)胞分化發(fā)育圖 圖中A為體內(nèi)發(fā)育至14. 5天的生殖結(jié)節(jié)，B為體內(nèi)發(fā)育至17. 5天的生殖結(jié)節(jié)，C
為體外培養(yǎng)3天的生殖結(jié)節(jié)； 圖3為生殖結(jié)節(jié)的獲取及培養(yǎng)圖； 圖4為胎鼠性別鑒定性腺解剖示意圖 圖中A、B為雌性，C、D為雄性，t為卵巢，A為睪丸。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說明。 1.生殖結(jié)節(jié)的切取，每個(gè)孕鼠體內(nèi)平均有6 IO個(gè)胚胎，呈串珠狀排列，解剖顯微 鏡下切開胎膜，即可見胚胎。如圖3所示，于會(huì)陰部?jī)珊笸戎g臍血管根部下方可見局部隆 起樣生殖結(jié)節(jié)，受孕14. 5天胚胎生殖結(jié)節(jié)約長(zhǎng)0. 5 0. 8mm，結(jié)節(jié)腹側(cè)有尚未閉合的尿道 溝。在生殖結(jié)節(jié)根部用膜狀內(nèi)障剪迅速切下生殖結(jié)節(jié)，保證切緣光滑平整，將離體的生殖結(jié) 節(jié)暫時(shí)浸在培養(yǎng)液中，待性別鑒定完成后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
2.性別鑒定 對(duì)每個(gè)胎鼠進(jìn)行性別鑒定，生殖結(jié)節(jié)切下后即刻解剖性腺，如圖4所示，見到睪丸 者為雄性，無睪丸或見到卵巢者為雌性，解剖成功率達(dá)到90%。
3.培養(yǎng)尿道發(fā)育模型 將步驟2中鑒定的雄性胎鼠的生殖結(jié)節(jié)，置于30mm Millicell-CM親水性PTFE膜 器官型細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在BGJB培養(yǎng)液(Gibco公司，貨號(hào)12591)中加入10nM雙氫睪 酮(International Library公司，貨號(hào)IL1050632)，在5% C02， 37。C條件下培養(yǎng)，每24小 時(shí)換液一次，培養(yǎng)3天即可造模成功。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道發(fā)育模型的方法，其特征在于，將生殖結(jié)節(jié)置于親水性PTFE膜器官型細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為BGJB，同時(shí)加入雙氫睪酮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述生殖結(jié)節(jié)為受孕14. 5天的胚胎生殖結(jié)節(jié)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)建立體外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述雙氫睪酮的用量為10nM。
4. 利用權(quán)利要求1-3中任一方法培養(yǎng)的體外尿道發(fā)育模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用器官培養(yǎng)物建立尿道發(fā)育模型的方法以及利用該方法培養(yǎng)得到的體外尿道發(fā)育模型。所述的尿道發(fā)育模型能夠完成類似體內(nèi)發(fā)育的尿道生長(zhǎng)和發(fā)育，其長(zhǎng)度和表面積獲得一定程度的增加，表面包皮發(fā)育成熟，尿道細(xì)胞發(fā)生了分化，形成了尿道。該模型的建立避免了在尿道發(fā)育相關(guān)研究過程中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)和研究結(jié)果易受體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌因素影響的特點(diǎn)。該模型重復(fù)性好，應(yīng)用價(jià)值高，值得推廣。
文檔編號(hào)C12N5/073GK101792736SQ200910248050
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日 公開號(hào)200910248050.0
發(fā)明者周娟, 王 忠, 達(dá)駿, 馬利民 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院