專利名稱：具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具有涉及具有分子內親合力效應的人IgA免疫球 蛋白結合分子及其制備方法和應用。
背景技術：
IgA是人體粘膜表面和分泌液中的主要免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，它不 僅在機體的免疫防御中起重要作用，而且與許多疾病的診斷和預后密切相關，因此研究開 發(fā)高效特異性人IgA(hlgA)純化和檢測試劑具有重要的應用價值。金黃色葡萄球菌蛋白 A(SPA)是具有Ig結合活性的細菌表面蛋白之一。據(jù)文獻報道，利用蛋白A的5個Ig結合 單結構域各位置中出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，合成新的含58個氨基酸的蛋白A單結構域(命 名為 Z 結構域)[Nord K,Gunneriusson E，Ringdahl J，et al. (1997)Nat Biotechnol 15: 772-777.]，其空間構型更為穩(wěn)定，呈三股反向α螺旋結構，其中參與IgG Fc段恒定區(qū)結 合的2個α螺旋表面具有13個溶劑可及殘基(solvent accessible residues)。國外學 者選擇Z結構域作為類似抗體的支架，將這13個表面殘基模擬抗體結合位點進行隨機突 變，建立噬菌體展示突變文庫，并以不同的靶蛋白(如重組人VIII因子、呼吸道合胞病毒 A亞類的G蛋白、人表皮生長因子受體胞外區(qū)和人CD^分子等)對該文庫進行親和篩選， 分別獲得與這些靶蛋白特異性結合的分子，并將這些類似抗體的結合分子命名為親和體 (affibody)。人IgA(hlgA)親和體是以IgA單克隆抗體為誘餌，經(jīng)噬菌體展示Z結構域突 變文庫進化篩選獲得的失去對人IgG、IgD、IgE、IgM的結合能力，而對hlgA具有很高的結 合活性的結合分子。hlgA親和體只存在一個hlgA結合位點，而細菌天然的Ig結合蛋白是由多個高度 同源的Ig結合單結構域串聯(lián)而成，如蛋白A和大芬戈爾德菌(原名大消化鏈球菌)蛋白L 的抗體結合區(qū)分別由5個序列高度同源的單結構域組成。本實驗室曾以蛋白A、鏈球菌蛋白 G及大芬戈爾德菌蛋白L的單結構域為基本單位，構建了由4個Ig結合單結構域隨機組合 而成的噬菌體展示文庫，并以不同的Ig分子為配基進行親和篩選，結果表明Ig結合單結構 域有機串聯(lián)，可產生明顯高于單一單結構域的結合活性；并且各單結構域的組合方式和結 構域之間不同的隨機連接肽序列，對于其Ig結合功能均具有重要影響。國外學者用基因工 程方法將兩個hlgA親和體頭尾相連，形成人工二聚體，可從正常人血漿中回收純化hlgA蛋 白，同時也有少量IgG和IgM吸附回收，指出可能是污染所致，未給予合理解釋[Rormmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA. (2002)Eur J Biochem 269(11) :2647-2655. ] 基于 此，進一步獲得高親合力的新的hlgA親和體組合分子以實質性提高與hlgA的結合活性是 值得深入研究的問題，目前國內外尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明通過將具有較高hlgA結合活性的hlgA親和體SEGl (其氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示)和SEG2 (其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示)序列作為基本結構單元，分
3別在其3'端引入3個氨基酸大小的隨機連接肽序列，構建噬菌體展示hlgA親和體隨機組 合文庫，然后以hlgA分子為篩選配基，通過“吸附-洗滌-洗脫-擴增”的生物淘洗方法， 對噬菌體展示hlgA親和體隨機組合文庫進行多輪定向進化篩選，并結合PCR方法檢測每 輪篩選后各代噬菌體文庫插入片段的分布情況，根據(jù)每次篩選結果來判斷占主導優(yōu)勢的噬 菌體中含有的hlgA親和體重復體片段的數(shù)量；然后測定篩選出的含有不同數(shù)量hlgA親和 體重復體片段的陽性單克隆噬菌體的DNA序列，推導所含外源氨基酸序列；最后通過ELISA 檢測、Western blot試驗、表面等離子共振檢測以及競爭ELISA檢測等檢測方法，篩選出 與hlgA具有最高結合能力的hlgA親和體重復體。通過本發(fā)明的篩選方法，獲得了含1個 hlgA親和體的序列為SEQl-m(氨基酸序列如SEQ NO ID 3中所示)或SEQ〗--(氨基酸序 列如SEQ NO ID:4中所示)；含2個hlgA親和體的序列為SEQ2-Mm-SEQ2-iea(氨基酸序列如 SEQ NO ID 5中所示)或SEQl-ail-SEQ2-ies(氨基酸序列如SEQ NO ID 6中所示)；含3個 hlgA親和體的序列為SEQI-^rSEQI-^eg-SEQl氨基酸序列如SEQ NO ID 7中所示)或 SEQl-m-SEQl-,K1-SEQ 1-^(氨基酸序列如SEQ NO ID 8中所示)；含4個hlgA親和體的序 列為 SEQZ-ggg-SEQl-^-SEQZ-j^-SEQl-^^ 氨基酸序列如 SEQ NO ID 9 中所示)；其中，含 3 個hlgA親和體重復體和含4個hlgA親和體重復體與hlgA有明顯結合優(yōu)勢，具有分子內結 合的親合力效應，顯示出很高的與人IgA結合的活性，可用于高效特異性IgA純化和檢測試 劑的研發(fā)，以用于酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和免疫組化等免疫方法對人IgA抗體進行 檢測等領域。上述hlgA親和體中使用的氨基酸單字母縮寫所代表的氨基酸名稱為A，丙氨酸； C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴氨酸；L，亮 氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸； V，頡氨酸；Y，酪氨酸。本發(fā)明的第一個目的，是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種具有分子內親合力效應 的人IgA免疫球蛋白結合分子，及其制備方法。本發(fā)明的第二個目的，是提供編碼上述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋 白結合分子的多核苷酸。本發(fā)明的第三個目的，是提供一種具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結 合分子的定向進化篩選方法。本發(fā)明的第一方面，公開了一種具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合 分子，它是SEQ ID NO :5 9中任一所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性變異蛋白。較佳的，它是SEQ ID NO :7 9中任一所示的氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明第二方面，公開了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼前述具有分子內親 合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子。較佳的，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO 10 14中任一所示的核苷酸序列。編碼所述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的核苷酸序列可 以通過本領域技術人員熟知的任何適當?shù)募夹g制備，包括但不限于重組DNA技術、化學合 成等方法；也可以先合成具有SEQ ID NO 10 14所示的核苷酸序列，然后通過定點突變、 定向誘變或以其它本領域熟知的技術來插入、替換、剔除序列以獲得所需的核苷酸序列。編碼所述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的核苷酸序列可以通過本領域技術人員熟知的任何適當?shù)募夹g制備。編碼人IgA免疫球蛋白結合分子的核苷酸序列和編碼載體蛋白的核苷酸序列之 間的融合技術見于本領域的一般描述，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，科學出版 社，1995)。本發(fā)明的第三個方面，公開了一種表達載體，該表達載體表達上述具有分子內親 合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子，且該表達載體含有上述多核苷酸以及與該多核苷 酸操作性相連的表達調控序列。較佳的，所述表達載體為原核表達載體，優(yōu)選為pET3h(+)原核表達載體。本發(fā)明的第四方面，公開了一種宿主細胞，所述宿主細胞被上述表達載體所轉化。較佳的，所述宿主細胞為原核細胞，如大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第五方面，公開了上述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合 分子的篩選制備方法，包括如下步驟合成編碼上述人IgA免疫球蛋白結合分子的多核苷 酸，將此多核苷酸序列構建至表達載體中，然后將含有編碼上述人IgA免疫球蛋白結合分 子的多核苷酸的表達載體轉化至宿主細胞中誘導表達，通過親和層析制備所述具有分子內 親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子。優(yōu)選的，所述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的篩選制備方 法的步驟為將hlgA親和體序列克隆至pET3h(+)原核表達載體，轉化BL21(DE!3)受體菌， 經(jīng)異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達后，用Ni-NTA親和層析柱純化表達蛋白。本發(fā)明的第六方面，公開了一種具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合 分子的定向進化篩選方法，包括如下步驟1)以具有較高hlgA結合活性的hlgA親和體SEGl和SEG2序列(其中，所述SEGl 的序列為SEQ ID NO 1所示，所述SEG2的序列為SEQ ID NO 2所示)作為基本結構單元， 分別在其3'端引入長度為3個氨基酸的隨機連接肽序列，構建噬菌體展示hlgA親和體隨 機組合文庫；2)以hlgA分子為篩選配基，通過“吸附-洗滌-洗脫-擴增”的生物淘洗方法，對 步驟1)中得到的噬菌體展示hlgA親和體隨機組合文庫進行3 5輪篩選；3)用PCR方法檢測每輪篩選后各代噬菌體文庫插入片段的分布情況，用PCR方 法檢測每輪篩選后各代噬菌體文庫插入片段的分布情況，分析每輪篩選后噬菌體中含有的 hlgA親和體重復片段的數(shù)量以及含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的噬菌體克隆的百 分比；4)隨機挑取含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的噬菌體克隆進行鑒定，經(jīng)酶 聯(lián)免疫吸附檢測上述噬菌體克隆與hlgA的結合能力；5)測定含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的陽性單克隆噬菌體的DNA序列，推 導所含外源氨基酸序列；6)篩選獲得的hlgA親和體序列克隆至表達載體，轉化受體菌，經(jīng)誘導表達并純化 表達蛋白；7)經(jīng)ELISA檢測、Western blot試驗以及表面等離子共振(surface ρIasmon resonance, SPR)檢測，篩選出與hlgA具有最高結合能力的hlgA親和體重復體；8)分別以含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的親和體重復體作為競爭抑制劑，進一步通過競爭ELASA試驗證實含3或4個hlgA親和體重復體的蛋白與hlgA有明顯 結合優(yōu)勢；9)將hlgA和hlgG分別用二巰基乙醇(β -mercaptoethanol，BME)處理，使抗體解 離為單鏈，檢測其與不同IgA親和體重復分子的結合反應，通過ELISA試驗和Dot blot檢 測表明3-4個親和體重復分子與hlgA的結合方式是分子內結合，產生分子內親合力效應， 而1-2個親和體與hlgA結合方式則是分子間結合；同時，2-4個親和體重復分子與hlgG的 結合方式既存在分子內也存在分子間的結合作用，提示1個以上hlgA親和體重復分子保留 了與hlgG結合的殘留活性；10)將4個IgA親和體重復分子吸附偶聯(lián)于kpharose (瓊脂糖凝膠)，觀察其從 正常人血清中回收hlgA抗體作用，并用Wfestern blot檢測抗hlgA、抗hlgG和抗hlgM分 別與親和層析洗脫液的反應性，結果顯示4個hlgA親和體重復體分子可回收正常人血清中 IgA,也可回收到少量IgG和IgM。優(yōu)選的，所述步驟幻中的生物淘洗方法的具體步驟為將hlgA抗體以每孔200ng 于37°C包被ELISA板條池，加磷酸鹽緩沖液(PBQ配制的封閉液(含10%脫脂奶粉、0. 1% Tween-20,0. 2%柳硫汞)室溫封閉lh，用PBS洗滌3次后，加入噬菌體展示IgA親和體隨 機組合文庫(IX IO12TU)，37°C放置 2h，用 PBST(含 0. 25% Tris,0. 05% Tween-20)洗滌 40 次。每孔加入100 μ 1對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1，37°C培養(yǎng)lh，收集菌液，取10 μ 1測定滴 度，其余菌液接種至50ml 2 X YT培養(yǎng)基(含Amp 100 μ g/ml)，于37°C振蕩培養(yǎng)Ih后加入輔 助噬菌體Mi;3K07 (1 X IO10TU)，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后加入Kana至15 μ g/ml，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。優(yōu)選的，所述步驟6)中的表達載體為pET3h(+)原核表達載體，所述受體菌為 BL21(DE3)，所述誘導表達為經(jīng)異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，所述純化為用 Ni-NTA親和層析柱純化。本發(fā)明中，所述ELISA檢測、Western blot試驗、表面等離子共振(surface plasmonresonance, SPR)檢測以及競爭ELASA試驗均為本領域公知技術，本領域技術人員 可以參考現(xiàn)有技術進行確認。本發(fā)明的第七方面，公開了上述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合 分子的應用，較佳的，所述應用為用于高效特異性IgA的純化和檢測，或者用于酶聯(lián)免疫吸 附法、免疫層析法和免疫組化等免疫方法對人IgA抗體進行檢測。本發(fā)明采用噬菌體隨機組合文庫進行分子定向進化篩選，篩選出具有較高hlgA 結合活性的新型蛋白結合分子。本發(fā)明中公開了幾種人IgA免疫球蛋白結合分子，還公開 了該人IgA結合分子的編碼基因、基于噬菌體分子進化的人IgA結合分子的制備方法及其 應用。本發(fā)明公開的人IgA結合分子，尤其是人IgA親和體的重復體分子，具有與人IgA結 合的分子內親合力效應，顯示出很高的與人IgA結合的活性，可用于高效特異性IgA純化和 檢測試劑的研發(fā)，以用于酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和免疫組化等免疫方法對人IgA抗 體進行檢測和診斷。本發(fā)明公開的基于噬菌體的分子定向進化篩選獲得hlgA蛋白結合分子的制備方 法，使得低成本、快速簡便篩選免疫球蛋白結合分子成為可能。另一方面，本發(fā)明公開的上 述hlgA蛋白結合分子中，含2個以上hlgA親和體重復體與hlgA有明顯結合優(yōu)勢，具有分 子內結合的親合力效應，提示人工結合蛋白的篩選和研究在親合力層次上進行設計、構建
6和評價具有重要意義。


圖1 重組pMD-18T克隆載體的構建流程圖。圖2 噬菌體展示hlgA親和體隨機組合文庫的構建流程圖。圖3 :PCR法檢測hlgA篩選噬菌體文庫后每輪單克隆噬菌體插入片段的大小1-24 隨機挑取的單克隆噬菌體；M :DL2000Marker ；C 陰性對照(pCANTAB5S質 粒)；1、II、III、IV 分別為1-4輪篩選的不同輪次。圖4 經(jīng)hlgA篩選后各代噬菌體文庫中的20個單克隆噬菌體插入片段的組成比 例變化橫坐標原始噬菌體文庫0以及經(jīng)hlgA 1-4輪篩選后子代文庫縱坐標含不同插入片段的噬菌體克隆的百分比例代表不含和含1個hlgA親和體的噬菌體克隆比例；代表含2個hlgA親和 體的噬菌體克隆比例；圃皿代表含3個hlgA親和體的噬菌體克隆比例；代表含4個 hlgA親和體的噬菌體克隆比例。圖5 =ELISA方法檢測含1_4個hlgA親和體的噬菌體分別與hlgA和hlgG的結合 活性橫坐標篩選的噬菌體克隆與hlgA ( Q )、hIgG ( S )和hIgM( □)的結合反應縱坐標A490，即波長490nm的光吸收值Ori-PL 原始噬菌體展示文庫。圖6: hlgA親和體代表序列的原核表達、純化及功能鑒定流程圖。圖7 hlgA親和體表達序列的酶切回收片段的瓊脂糖電泳圖M :DL2000Marker ； 1-4 分別代表 1-4 個 hlgA 親和體 DNA 序列。圖8: hlgA親和體重組表達質粒的酶切鑒定電泳圖1 :SEGl/pET32a(+)質粒；2 :SEGl/pET32a(+)質粒/Nco I+BamHI ；3 :SEGl-SEG2/pET32a(+)質粒；4 :SEGl-SEG2/pET32a(+)質粒/Nco I+BamHI ；5 :SEGl-SEGl-SEGl/pET32a (+)質粒/Nco I+BamHI ；6 :SEGl-SEGl-SEGl/pET32a (+)質粒；7 :SEG2-SEGl-SEG2-SEGl/pET32a (+)質粒/Nco I+BamHI ；8 :SEG2-SEGl-SEG2-SEGl/pET32a (+)質粒；9 :pET32a(+)質粒/Nco I+BamHI ；M :DL2000 Marker。圖9 :hIgA親和體融合蛋白小量表達的SDS-PAGE結果C:空菌對照；M 蛋白 Marker，97400、66200、43000、31000、20100、14400 分別表示 14400-97400Daltons Marker電泳顯色條帶對應的分子量1 代表含1個hlgA親和體的融合蛋白；
2，3 均代表含2個hlgA親和體的融合蛋白；4，5 均代表含3個hlgA親和體的融合蛋白；6，7 均代表含4個hlgA親和體的融合蛋白。圖10 純化的4種hlgA親和體融合蛋白的SDS-PAGE結果M 蛋白 Marker，97400、66200、43000、31000、20100、14400 分別表示 14400-97400Daltons Marker電泳顯色條帶對應的分子量1-4 分別代表含1-4個hlgA親和體的融合蛋白。圖11 =ELISA檢測4種人IgA親和體融合蛋白分別與hlgA (A)、hlgG(B)、 hIgGI-Fc (C)和hlgM(D)的結合活性橫坐標生物素標記的hlgA稀釋度(1)、生物素標記的hlgG稀釋度( 、生物素標 記的hlgGl-Fc稀釋度( 、生物素標記的hlgM稀釋度縱坐標A490，即波長490nm的光吸收值 帶“一■一”線條對應4個hlgA親和體融合蛋白 帶“一▲一”線條對應3個hlgA親和體融合蛋白 帶“一〇一”線條對應2個hlgA親和體融合蛋白 帶“一 一”線條對應1個hlgA親和體融合蛋白 帶“一 一”線條對應pET-32a(+)融合蛋白。
圖12 =Western blot法檢測4種hlgA親和體融合蛋白分別與4種Ig分子的結

合反應
A :hIgA親和體融合蛋白與hlgA的結合反應 B :hIgA親和體融合蛋白與hlgG的結合反應 C :hIgA親和體融合蛋白與hlgGl-Fc的結合反應 D :hIgA親和體融合蛋白與hlgM的結合反應1 :pET_32a(+)融合蛋白2 :1個hlgA親和體融合蛋白3 2個hlgA親和體融合蛋白4 :3個hlgA親和體融合蛋白5 4個hlgA親和體融合蛋白6 金黃色葡萄球菌蛋白A (SPA)。圖13 表面等離子共振(SPR)法檢測4種hlgA親和體融合蛋白分別與3種Ig分 子的結合反應橫坐標作用時間(秒)縱坐標共振單位(RU)A 4種hlgA親和體融合蛋白與hlgA的結合反應B 4種hlgA親和體融合蛋白與hlgG的結合反應C 4種hlgA親和體融合蛋白與hlgM的結合反應SEGl，SEG2 為 2 種 hlgA 親和體每張圖中6條曲線代表6個稀釋度，由上至下按1 2倍比稀釋。圖14 :1-4個hlgA親和體融合蛋白(A，B，C，D)結合生物素標記的hlgA (b_hIgA)的競爭抑制以及2-4個hlgA親和體融合蛋白(E，F(xiàn)，G)結合生物素標記的hlgG(b-hlgG)的 競爭抑制橫坐標l0g(inhibit0r) (nM)，即抑制因子濃度對數(shù)值縱坐標Percent ofinhibition，即抑制百分數(shù)帶“一■一”線條對應4個hlgA親和體融合蛋白帶“一▽—，，線條對應3個hlgA親和體融合蛋白帶“一▼一”線條對應2個hlgA親和體融合蛋白帶“一〇一”線條對應1個hlgA親和體融合蛋白帶“一 一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白。圖15 :hIgA和hlgG經(jīng)二巰基乙醇(BME)處理前后的SDS-PAGE結果M 蛋白 Marker,97. 2,66. 4,44. 3,29. 0,20. 1,14. 3 分別表示 14300_97200Daltons Marker電泳顯色條帶對應的分子量9A(1)變性條件下hlgA和hlgG經(jīng)BME處理前后的SDS-PAGE結果9A(2)非變性條件下hlgA和hlgG經(jīng)BME處理前后的SDS-PAGE結果1 :hIgA ；2 經(jīng) BME 處理后 hlgA ；3 :hIgG ；4 經(jīng) BME 處理后 hlgG。圖16 =ELISA檢測hlgA和hlgG經(jīng)二巰基乙醇(BME)處理前后分別與2個和4個 hlgA親和體融合蛋白的結合反應橫坐標生物素標記的4個hlgA親和體融合蛋白稀釋度[9B(1)]、生物素標記的2 個hlgA親和體融合蛋白稀釋度[9B(》]、生物素標記的hlgA稀釋度[9BC3)]、生物素標記 的hlgG稀釋度[9B (4)]、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgA稀釋度[9B (5) ]、HRP標記 的抗hlgG稀釋度[9B(6)]縱坐標A450，即波長450nm的光吸收值圖 16(A)帶“一■一”線條對應生物素標記的4個hlgA親和體融合蛋白與包板的hlgA的 反應帶“一□一”線條對應生物素標記的4個hlgA親和體融合蛋白與包板的BME處 理的hlgA反應帶“一 一”線條對應生物素標記的4個hlgA親和體融合蛋白與包板的hlgG的 反應帶“一〇一”線條對應生物素標記的4個hlgA親和體融合蛋白與包板的BME處 理的hlgG反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白圖 16(B)帶“一■一”線條對應生物素標記的2個hlgA親和體融合蛋白與包板的hlgA的 反應帶“一□一”線條對應生物素標記的2個hlgA親和體融合蛋白與包板的BME處 理的hlgA反應帶“一 一”線條對應生物素標記的2個hlgA親和體融合蛋白與包板的hlgG的 反應
9
帶“一〇一”線條對應生物素標記的2個hlgA親和體融合蛋白與包板的BME處 理的hlgG反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白圖 16(C)帶“一■一”線條對應生物素標記的hlgA與包板的4個hlgA親和體融合蛋白的 反應帶“一□一”線條對應生物素標記的BME處理的hlgA與包板的4個hlgA親和體 融合蛋白反應帶“一 一”線條對應生物素標記的hlgA與包板的2個hlgA親和體融合蛋白的 反應帶“一〇一”線條對應生物素標記的BME處理的hlgA與包板的2個hlgA親和體 融合蛋白反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白圖 16(D)帶“一■一”線條對應生物素標記的hlgG與包板的4個hlgA親和體融合蛋白的 反應帶“一□一”線條對應生物素標記的BME處理的hlgG與包板的4個hlgA親和體 融合蛋白反應帶“一 一”線條對應生物素標記的hlgG與包板的2個hlgA親和體融合蛋白的 反應帶“一〇一”線條對應生物素標記的BME處理的hlgG與包板的2個hlgA親和體
融合蛋白反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白圖 16(E)帶“一■一”線條對應辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgA與包板的hlgA反應帶“一□一”線條對應辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgA與包板的BME處理 的hlgA反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白圖 16(F)帶“一 一”線條對應辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgG與包板的hlgG反應帶“一〇一”線條對應辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgG與包板的BME處理 的hlgG反應帶“一▲一”線條對應pET_32a(+)融合蛋白。圖17 =Dot blot法檢測hlgA和hlgG經(jīng)二巰基乙醇(BME)處理前后分別與2個 和4個hlgA親和體融合蛋白的結合反應BME (-) :hIgA 和 hlgG 未經(jīng) BME 處理BME (+) :hIgA 和 hlgG 經(jīng) BME 處理1 4、1 8、1 16、1 32、1 64、1 1 分別表示 hlgA 和 hlgG 的稀釋度。
圖18 用4個IgA親和體重復分子從正常人血清中回收hlgA親和層析洗脫液的 SDS-PAGE 和 Western blot 結果A 親和層析洗脫液的SDS-PAGE結果B 正常人血清的SDS-PAGE結果C 與辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hlgA單克隆抗體反應的Wfestern blot結果D 與HRP標記的抗hlgG單克隆抗體反應的^festern blot結果E 與HRP標記的抗hlgM單克隆抗體反應的^festern blot結果M 蛋 白 Marker，97. 2、66· 4、44· 3、29· 0、20· 1、14. 3 分另Ij 表示 14300-97200DaltonsMarker電泳顯色條帶對應的分子量1 :hIgA ；2 :hIgG ；3 :hIgM ；E 親和層析洗脫液；N 正常人血清。
具體實施例方式在本發(fā)明中，術語“其保守性變異蛋白，，是指具有分子內親合力效應的人IgA免疫 球蛋白結合分子(其氨基酸序列如SEQ ID NO:或SEQ ID NO 所示)的蛋白的變異形式， 這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-30個，較佳的1-10個，更佳的1-5 個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為 20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸，例如，在本領域中，用性能相近 或相似地氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代 Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一個和數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功 能。此外，這些變異形式還包括成熟蛋白與另一個化合物融合所形成的蛋白，附加的氨基酸 序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列 或蛋白原序列，比如GST)。此外，變異形式還包括(但不限于)進化免疫球蛋白結合分子及 上述蛋白經(jīng)過修飾后的形式化學衍生形式如乙?；螋然惶腔?，如那些在多肽的 合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白，這種修飾可以通過將蛋 白暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；具有磷酸化氨 基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其 抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟悉技 術人員公知的范圍。本發(fā)明中，術語“表達調控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調 控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序 列適當翻譯所需的序列。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性 DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼 序列是操作性相連的。用重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法或熱擊 法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用 電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常 規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。本發(fā)明所述適合表達具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的條
11件與表達所用的宿主細胞有關，重組載體轉化的宿主細胞獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培 養(yǎng)，表達本發(fā)明的具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子。根據(jù)所用的宿主 細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培 養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選 擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。上述方法中的重組蛋白可在細胞內、或在細胞膜上表 達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分 離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不 限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、 分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相 層析技術及這些方法的結合。下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而 非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均 為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實施例1應用噬菌體分子進化獲得具有分子內親合力效應的人IgA親和體重復分子l、hIgA親和體SEG1、SEG2片段的基因合成根據(jù)文獻[Ronnmark J，Gronlund H， Uhlen M, Nygren PA. (2002)Eur J Biochem 269(11) :2647-2655.]提供的 hlgA 親和體的 氨基酸序列設計大腸桿菌偏愛密碼子序列的hlgA親和體SEGl和SEG2基因(均含174個 核苷酸)，委托上海英駿生物技術有限公司合成。2、重組pMD-18T克隆載體的構建將合成的SEGl基因和SEG2基因序列分別克 隆于pMD-18T載體，命名為pMD-18T/SEGl和pMD-18T/SEG2。重組pMD_18T克隆載體的 構建流程見圖1。挑取PMD-18T/SEG1和pMD_18T/SEG2重組質粒各3個，委托上海英駿 生物技術有限公司進行序列測定，測序結果用DNASTAR軟件分析，結果表明合成的序列與 文獻[Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA. (2002)Eur J Biochem 269(11) 2647-2655.]提供的氨基酸序列完全一致(見表1)。表1 hlgA親和體SEGl和SEG2的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列
權利要求
1. 一種具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子，它是SEQ ID N0:5 9 中任一所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性變異蛋白。
2. 一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1中所述的具有分子內親合力效 應的人IgA免疫球蛋白結合分子。
3.如權利要求2中所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有如SEQID NO 10 14中任一所示的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體表達權利要求1中所述的具有分子內親 合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子，且所述表達載體含有如權利要求2或3中任一所 述的多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。
5.如權利要求4中所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為原核表達載體。
6. 一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞被權利要求4-5中任一權利要求所述的 表達載體所轉化。
7.如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為原核細胞。
8.權利要求1中所述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的制備方 法，包括如下步驟合成編碼權利要求1中所述的人IgA免疫球蛋白結合分子的多核苷酸， 將此多核苷酸序列構建至表達載體中，然后將含有編碼權利要求1中所述的人IgA免疫球 蛋白結合分子的多核苷酸的表達載體轉化至宿主細胞中誘導表達，通過親和層析制備所述 具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子。
9.一種具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子的定向進化篩選方法，包 括如下步驟1)以hlgA親和體SEGl和SEG2序列作為基本結構單元，分別在其3'端引入長度為3 個氨基酸的隨機連接肽序列，構建噬菌體展示hlgA親和體隨機組合文庫；2)以hlgA分子為篩選配基，通過生物淘洗方法，對步驟1)中得到的噬菌體展示hlgA 親和體隨機組合文庫進行多輪篩選；3)用PCR方法檢測每輪篩選后各代噬菌體文庫插入片段的分布情況，用PCR方法檢 測每輪篩選后各代噬菌體文庫插入片段的分布情況，分析每輪篩選后噬菌體中含有的hlgA 親和體重復片段的數(shù)量以及含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的噬菌體克隆的百分 比；4)隨機挑取含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的噬菌體克隆進行鑒定，經(jīng)酶聯(lián)免 疫吸附檢測上述噬菌體克隆與hlgA的結合能力；5)測定含有不同數(shù)量hlgA親和體重復體片段的陽性單克隆噬菌體的DNA序列，推導所 含外源氨基酸序列；6)篩選獲得的hlgA親和體序列克隆至表達載體，轉化受體菌，經(jīng)誘導表達并純化表達 蛋白；7)經(jīng)ELISA檢測、Westernblot試驗以及表面等離子共振檢測，篩選出與hlgA具有最 高結合能力的hlgA親和體重復體。
10.權利要求1中所述具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子在高效特 異性IgA的純化和檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有分子內親合力效應的人IgA免疫球蛋白結合分子及其制備方法和應用。本發(fā)明還公開了該人IgA結合分子的編碼基因、基于噬菌體分子進化的人IgA結合分子的制備方法及其應用。本發(fā)明公開的人IgA結合分子，尤其是人IgA親和體的重復體分子，具有與人IgA結合的分子內親合力效應，顯示出很高的與人IgA結合的活性，可用于高效特異性IgA純化和檢測試劑的研發(fā)，以用于酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和免疫組化等免疫方法對人IgA抗體進行檢測。
文檔編號C12N1/21GK102115497SQ20091024771
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權日2009年12月30日
發(fā)明者戚中田, 曹潔, 溫宗梅, 潘衛(wèi), 王錦紅, 蔣少華, 陳秋莉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學