專利名稱：一種流化床生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，具體涉及一種流化床生物反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
目前細(xì)胞培養(yǎng)方法有采用流化床生物反應(yīng)器或者固定床生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。固 定床生物反應(yīng)器是在反應(yīng)器中裝配固定的容器，中間裝填載體，載體通常是直徑2-6mm實(shí) 體或多孔球或片狀纖維。培養(yǎng)液循環(huán)通過固定床，依靠攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，使培養(yǎng)基不斷流 經(jīng)填料，以進(jìn)行營養(yǎng)成分和氧的傳遞。剛接種的細(xì)胞生長(zhǎng)在載體的表面，隨著細(xì)胞增殖，細(xì) 胞開始充滿載體間的空隙。固定床生物反應(yīng)器培養(yǎng)溶液流動(dòng)速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)，可減少無 血清培養(yǎng)時(shí)的蛋白用量，適用于增殖懸浮細(xì)胞。固定床培養(yǎng)方式，細(xì)胞培養(yǎng)密度高，且無機(jī) 械損害，但是，由于采用上下兩塊板緊壓載體，使得細(xì)胞的代謝產(chǎn)物及死細(xì)胞很難排出，而 且由于培養(yǎng)載體堆積在一起，培養(yǎng)液不均勻的流動(dòng)，造成溝流現(xiàn)象，導(dǎo)致營養(yǎng)分布不均勻， 細(xì)胞的生長(zhǎng)速度不一致。流化床生物反應(yīng)器包括罐體、控溫部分、通氣部分、進(jìn)出料口、測(cè)量系統(tǒng)及其它附 屬系統(tǒng)，通過罐體內(nèi)的攪拌裝置產(chǎn)生向上的漩流，使支持細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液呈流態(tài)化，從而 使內(nèi)部裝填的載體上下翻動(dòng)，依附載體生長(zhǎng)的大量細(xì)胞在懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，其罐體剖面圖見 圖1。流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液的流動(dòng)性好，細(xì)胞的生長(zhǎng)條件均質(zhì)，細(xì)胞生長(zhǎng)一 致，但容易使細(xì)胞和載體沖出，隨著細(xì)胞的增多，攪拌的懸浮態(tài)變差，放大效應(yīng)小，現(xiàn)有流化 床的床層深度為2m左右，反應(yīng)器放大一般采用增大橫截面積，最大規(guī)模僅為1M3。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有流化床生物反應(yīng)器容易使細(xì)胞和載體沖出、放大效應(yīng)受限的缺 陷，提供一種新的流化床生物反應(yīng)器。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案—種流化床生物反應(yīng)器，包括罐體1、導(dǎo)流管2、固定板3和設(shè)置于罐體1內(nèi)的攪拌 裝置4，在攪拌裝置4外設(shè)置與導(dǎo)流管2相接的多孔圓管5，所述多孔圓管5上設(shè)置多個(gè)通 孔，與罐體1的底部連接。優(yōu)選地，所述導(dǎo)流管2下端口徑擴(kuò)大。優(yōu)選地，所述多孔圓管5上的通孔孔徑小于所用載體的直徑。優(yōu)選地，所述攪拌裝置4的攪拌槳葉41為平葉或螺旋槳形。優(yōu)選地，所述固定板3設(shè)置于罐體上部，為多孔材料制成，所述多孔材料優(yōu)選為多 孔不銹鋼或多孔塑料，特別優(yōu)選為ETFE聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯。所述流化床生物反應(yīng)器還包括控溫部分、通氣部分、進(jìn)出料口、測(cè)量系統(tǒng)及其它附 屬系統(tǒng)。利用本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選地，固定板與罐體底部之間的載體填充量為固定板與罐體底部之間距離的1/2-2/3，上部至少留有1/3的空間。培 養(yǎng)液經(jīng)導(dǎo)流管形成旋流向下流動(dòng)，再由底部的通孔沖出，形成旋流，向上流動(dòng)，當(dāng)向上流的 速度高于載體的沉降速度時(shí)，載體處于懸浮狀態(tài)，形成類似與流化床培養(yǎng)的培養(yǎng)方式，其工 作狀態(tài)圖見圖2 ；改變攪拌裝置的攪拌速度可以改變流體向上運(yùn)動(dòng)速度，當(dāng)攪拌裝置的旋轉(zhuǎn)速度較 低，流體速度低于沖出點(diǎn)，載體沉降下來，形成類似固定床培養(yǎng)的培養(yǎng)方式，其工作狀態(tài)圖 見圖3，載體與載體之間較為疏松，并且可觀察到載體微小的晃動(dòng)，這種晃動(dòng)有助于均勻培 養(yǎng)液，比現(xiàn)有的固定床培養(yǎng)方式優(yōu)越。本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度可達(dá)107ml以 上；本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器還可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)流培養(yǎng)，所述連續(xù)培養(yǎng)就是連續(xù) 往培養(yǎng)罐里供給養(yǎng)分如新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)輸出上清液，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。利用本發(fā)明所述 流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，由于固定板和多孔圓管之間的阻隔，將載體限制 其間，使得上清液的提取更為方便。本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器以固定床培養(yǎng)方式為主，間歇而短暫地改變攪拌速 度，使載體處于懸浮狀態(tài)，形成類似于流化床培養(yǎng)方式，使罐體內(nèi)細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn) 物均質(zhì)化。其培養(yǎng)程序可設(shè)定為固定床培養(yǎng)方式培養(yǎng)1-3小時(shí)，流化床培養(yǎng)方式培養(yǎng)1-3 分鐘，停止攪拌0. 5-1分鐘，再循環(huán)利用固定床培養(yǎng)方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。與現(xiàn)有的流化床生物反應(yīng)器相比，本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器將載體限制于固 定板下，方便了上清液的提取和處理，而且更有效的利用了罐體體積。利用本發(fā)明所述流化 床生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度可以達(dá)到達(dá)107ml以上，而且可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)，可 以直接通入氣體，放大潛能好。


圖1是現(xiàn)有流化床生物反應(yīng)器罐體的剖面圖；圖2是本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器工作狀態(tài)1罐體剖面圖(流化態(tài))；圖3是本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器工作狀態(tài)2罐體剖面圖(固定態(tài))。附圖標(biāo)記1-罐體2-導(dǎo)流管3-固定板4-攪拌裝置41-攪拌槳葉42-攪拌軸5-多孔圓管6-載體7-上清液。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例1 利用本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)在流化床生物反應(yīng)器(上海日泰IOL型)加入片狀聚酯載體，同時(shí)加入磷酸緩沖 液(pH7.2)，123°C高壓消毒60分鐘，自然冷卻過夜。第2天排空罐內(nèi)磷酸緩沖液，加入含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種Vero細(xì)胞，接種后罐內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)5xl05/ml，開始細(xì)胞培養(yǎng)。設(shè)定反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)條件為溫度37°C，pH 7. 2,DO 50%進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。啟動(dòng)攪拌 裝置，設(shè)定轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分，在該轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)液速度低于沖出點(diǎn)，載體沉降下來，形成類似 固定床培養(yǎng)的培養(yǎng)方式，其工作狀態(tài)圖見圖3，載體與載體之間較為疏松，并且可觀察到載 體微小的晃動(dòng)，在此狀態(tài)培養(yǎng)1小時(shí)。改變攪拌裝置的攪拌速度為250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)液經(jīng)導(dǎo)流管形成旋流向下流動(dòng)，再由 底部的通孔沖出，形成旋流，向上流動(dòng)，載體處于懸浮狀態(tài)，且上下翻動(dòng)，形成流化床培養(yǎng)。 如圖2所示，在此狀態(tài)培養(yǎng)2分鐘。將攪拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至0轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)0. 5分鐘；再在攪 拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)1小時(shí)，周而復(fù)始。以上循環(huán)程序可通過計(jì)算機(jī)設(shè)置。每 天進(jìn)行細(xì)胞采樣，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞密度。接種后第2天開始連續(xù)灌流，每日灌注新鮮培養(yǎng)基7-21L，以達(dá)到充分補(bǔ)充營養(yǎng)物 質(zhì)的目的。所謂的連續(xù)灌流就是可以連續(xù)往培養(yǎng)罐里供給養(yǎng)分如營養(yǎng)液，同時(shí)輸出上清液， 即固定板上方的液體，由于固定板的阻隔，片狀纖維載體限制在固定板之下，使得上清液的 提取很方便，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)密度計(jì)算結(jié)果如下第1天1.虹106/1111，第2天3.虹1071111，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。實(shí)施例2 利用本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)
的大量培養(yǎng)在IOL流化床生物反應(yīng)器中加入300克國產(chǎn)片狀聚酯載體，同時(shí)加入8L磷酸緩沖 液(pH7.2)，123°C高壓消毒60分鐘，自然冷卻過夜。第2天排空罐內(nèi)磷酸緩沖液，加入含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種CHO細(xì)胞，接種后罐內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)5xl05/ml，開始細(xì)胞培養(yǎng)。設(shè)定反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)條件為溫度37°C，pH 7. 2,DO 50%進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。啟動(dòng)攪拌 裝置，設(shè)定轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分，在該轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)液速度低于沖出點(diǎn)，形成類似固定床的培養(yǎng) 方式，但是可觀察到載體微小的晃動(dòng)，這種晃動(dòng)有助于均勻培養(yǎng)液，在此狀態(tài)培養(yǎng)1小時(shí)。改變攪拌裝置的攪拌速度為260轉(zhuǎn)/分，流體向上運(yùn)動(dòng)速度改變，載體處于懸浮狀 態(tài)，形成流化床培養(yǎng)，在此狀態(tài)培養(yǎng)2分鐘。再將攪拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至0轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)0. 5分 鐘。再將攪拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)1小時(shí)，周而復(fù)始。以上循環(huán)程序可通過計(jì)算 機(jī)設(shè)置。每天進(jìn)行細(xì)胞采樣，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞密度。接種后第2天開始連續(xù)灌流，每日灌注新鮮培養(yǎng)基7-21L，以達(dá)到充分補(bǔ)充營養(yǎng)物 質(zhì)的目的。所謂的連續(xù)灌流就是可以連續(xù)往培養(yǎng)罐里供給養(yǎng)分如營養(yǎng)液，同時(shí)輸出上清液， 即固定板上方的液體。由于固定板的阻隔，片狀纖維載體限制在固定板之下，使得上清液的 提取很方便，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)密度計(jì)算結(jié)果如下第1天1.虹106/1111，第2天3.虹1071111，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。
實(shí)施例3 利用本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行293細(xì)胞的大量培養(yǎng)在IOL流化床生物反應(yīng)器中加入300克國產(chǎn)片狀聚酯載體，同時(shí)加入8L磷酸緩沖 液(pH7. 2)，123°C高壓消毒60分鐘，自然冷卻過夜。第2天排空罐內(nèi)磷酸緩沖液，加入高糖 的DMEM培養(yǎng)基，接種293細(xì)胞，接種后罐內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)5xl05/ml，開始細(xì)胞培養(yǎng)。設(shè)定反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)條件為溫度37°C，pH 7. 2，DO 50%進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，啟動(dòng)攪拌 裝置，設(shè)定轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分，在該轉(zhuǎn)速下，流體速度低于沖出點(diǎn)，形成類似固定床的培養(yǎng)方 式，但是可觀察到載體微小的晃動(dòng)，這種晃動(dòng)有助于均勻培養(yǎng)液，在此狀態(tài)培養(yǎng)1小時(shí)。改變攪拌裝置的攪拌速度為260轉(zhuǎn)/分，流體向上運(yùn)動(dòng)速度改變，載體處于懸浮狀 態(tài)，形成流化床培養(yǎng)，在此狀態(tài)培養(yǎng)2分鐘。再將攪拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至0轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)0. 5分 鐘。再在攪拌裝置轉(zhuǎn)速調(diào)至80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)1小時(shí)，周而復(fù)始。以上循環(huán)程序可通過計(jì)算 機(jī)設(shè)置。每天進(jìn)行細(xì)胞采樣，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞密度。接種后第2天開始連續(xù)灌流，每日灌注新鮮培養(yǎng)基7-21L，以達(dá)到充分補(bǔ)充營養(yǎng)物 質(zhì)的目的。所謂的連續(xù)灌流就是可以連續(xù)往培養(yǎng)罐里供給養(yǎng)分如營養(yǎng)液，同時(shí)輸出上清液， 即固定板上方的液體，由于固定板的阻隔，片狀纖維載體限制在固定板之下，使得上清液的 提取很方便，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)密度計(jì)算結(jié)果如下第1天1.虹106/1111，第2天3.虹1071111，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種流化床生物反應(yīng)器，包括罐體(1)、導(dǎo)流管(2)、固定板(3)和設(shè)置于罐體(1)內(nèi) 的攪拌裝置(4)，其特征在于，在攪拌裝置(4)外設(shè)置與導(dǎo)流管(2)相接的多孔圓管(5)，所 述多孔圓管(5)上設(shè)置多個(gè)通孔，與罐體(1)的底部連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述導(dǎo)流管(2)下端口徑擴(kuò)大。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述多孔圓管(5)的通孔孔 徑小于所用載體的直徑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述攪拌裝置(4)的攪拌槳 葉(41)為平葉或螺旋槳形。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述固定板(3)設(shè)置于罐體 上部。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述固定板(3)為多孔材料 制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述固定板(3)由多孔不銹 鋼或多孔塑料制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流化床生物反應(yīng)器，其特征在于，所述多孔材料為ETFE、聚乙 烯或聚丙烯。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，公開了一種流化床生物反應(yīng)器，包括罐體(1)、導(dǎo)流管(2)、固定板(3)和設(shè)置于罐體(1)內(nèi)的攪拌裝置(4)，在攪拌裝置(4)外設(shè)置與導(dǎo)流管(2)相接的多孔圓管(5)，所述多孔圓管(5)上設(shè)置多個(gè)通孔，與罐體(1)的底部連接。本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器將載體限制于固定板下，方便了上清液的提取和處理，而且更有效的利用了罐體體積；本發(fā)明所述流化床生物反應(yīng)器結(jié)合流化床培養(yǎng)方式和固定床培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)灌流培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均質(zhì)，細(xì)胞密度達(dá)107/ml以上，放大潛能好，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12M1/38GK102108333SQ20091024742
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者鄭振彬, 陳光南 申請(qǐng)人:上海日泰醫(yī)藥設(shè)備工程有限公司