亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

那西肽耐藥型核糖體rna甲基轉(zhuǎn)移酶、其制備方法及應(yīng)用的制作方法

文檔序號:576672閱讀:254來源:國知局
專利名稱:那西肽耐藥型核糖體rna甲基轉(zhuǎn)移酶、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種新型抗生素耐藥型甲基轉(zhuǎn)移酶。更具體地,本 發(fā)明涉及那西肽耐藥型核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因克隆,蛋白制備,以及其作為新型抗 生素篩選靶點(diǎn)的應(yīng)用。
背景技術(shù)
抗生素的發(fā)現(xiàn)給人類有效治療各種細(xì)菌感染病帶來福音。但是,抗生素的廣泛使 用乃至于濫用所致的抗生素耐藥性日益巨增,造成大量抗生素失去作用,據(jù)統(tǒng)計(jì)目前每年 全世界死于多種細(xì)菌感染病的人數(shù)比十年前高8倍。因此,發(fā)現(xiàn)新型抗生素十分重要,而其 關(guān)鍵點(diǎn)是找到抗生素新靶點(diǎn)。核糖體是細(xì)菌用來合成蛋白質(zhì)的場所,已知現(xiàn)有的許多抗生素的作用位點(diǎn)是細(xì)菌 核糖體,抗生素與核糖體的結(jié)合使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成無法進(jìn)行,從而達(dá)到殺死細(xì)菌的效果。 近幾年來,利用X-光衍射結(jié)晶的方法,細(xì)菌核糖體的結(jié)構(gòu)已逐漸被解析清楚[見參考文獻(xiàn) 1,2,3,4],使得以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的新抗生素的發(fā)現(xiàn)成為可能,因此當(dāng)前針對細(xì)菌核糖體結(jié)構(gòu) 進(jìn)行抗生素靶點(diǎn)的研究受到了廣泛的關(guān)注[見參考文獻(xiàn)5,6]。細(xì)菌體內(nèi)能夠進(jìn)化出修飾抗生素靶點(diǎn)的系統(tǒng),是其對抗抗生素,并產(chǎn)生耐藥性的 一個重要原因。而其中,對細(xì)菌核糖體RNA上特定位點(diǎn)的甲基化是目前觀察到的一個普遍 現(xiàn)象。例如,某些從臨床上分離的抗紅霉素的的金黃色葡萄球菌,基因組中編碼一類紅霉素 耐藥型RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(Erythromycinresistance RNA methyltransferase C, ERM C) ,ERM 蛋白能夠甲基化23S RNA上2058位的腺嘌呤A,甲基化后的A2058位會影響核糖體RNA局 部的構(gòu)象,使紅霉素?zé)o法再結(jié)合這一區(qū)域,從而造成細(xì)菌的耐藥性[見參考文獻(xiàn)8]。那西肽(Nosih印tide)就是一類作用在細(xì)菌核糖體上的新型含硫多肽類抗生素, 1961年從活躍鏈霉菌(Sti^ptomyces actuosus)被分離出來,對金黃色葡萄球菌、梭狀桿 菌等革蘭氏陽性菌具有明顯的抑菌或殺菌的作用。目前,在結(jié)構(gòu)上屬于含硫多肽類抗生素 的那西肽在國內(nèi)外應(yīng)用愈發(fā)廣泛,但針對其耐藥性產(chǎn)生機(jī)理的研究尚不多見。根據(jù)對另一 種含硫多肽類抗生素硫鏈絲菌肽的研究,細(xì)菌中編碼的硫鏈絲菌肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (Thiostrepton resistance RNA methyIatransferase,簡稱 TSR)的存在是細(xì)菌對該抗生 素產(chǎn)生耐藥性的根本原因[見參考文獻(xiàn)9]。TSR在細(xì)菌體內(nèi)能夠?qū)R恍缘募谆颂求w 23S rRNA上1067位的腺嘌呤(簡稱A)。被甲基化后的23S rRNA無法再被抗生素硫鏈絲 菌肽結(jié)合,因此抗生素失效,細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。參考文獻(xiàn)列表如下1. Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature. (2000) ffimberly, B., Brodersen,D. ,Clemons,W.J. , Morgan-Warren, R. , Carter, A. , Vonrhein, C. ,Hartsch, T. & Ramakrishnan, V.,2000. 407(6802) :327-39.2. Crystal structure of the ribosome at 5. 5 A resolution. Science. Yusupov, Μ. ,Yusupova, G. ,Baucom,A. ,Lieberman, K. , Earnest, Τ. ,Cate, J.& Noller,H.,2001. 292(5518) :ρ· 883-96.3. A detailed view of a ribosomal active site :the structure ofthe Lll-RNA complex, ffimberly, B. Τ. , Guymon, R. , McCutcheon, J. P. , White, S. W. , and Ramakrishnan, V.,Cell.,1999. 97(4) :ρ· 491—502.4. Structure of the S15,S6,S18_rRNA complex :assembly of the30S ribosome central domain. Agalarov, S. C. , Sridhar Prasad, G. , Funke, P.M. , Stout, C. D. , and Williamson, J. R.,Science, 2000. 288(5463) :p. 107—13.5.The structural basis for the action of the antibioticstetracycline, pactamycin, and hygromycin B on the 30S ribosomalsubunit.Brodersen, D. Ε., Clemons, W. M. J. , Carter,A. P. , Morgan-Warren,R. J. ,ffimberly,B. Τ. , and Ramakrishnan, V.,Cell, 2000. 103(7) :p. 1143-54.6.The structural basis of ribosome activity in peptide bondsynthesis. Nissen, P. , Hansen, J. B. , N. , Moore, P. , and Steitz, T. , Science, 2000. 289(5481) p. 920-30.7.The bacterial ribosome, a promising focus forstructure-based drug design. Knowles D, Foloppe N, Matassova N, Murchie A I H. Current Opinion in Pharmacology, 2002. 2(5) :p. 501-6.8. Crystal Structure of Erm C, an rRNA Methyltransferase WhichMediates Antibiotic Resistance in Bacteria. Dirksen E. Steven W. Muchmore, Christopher G. Gerd S. Vicki L. Rohinton P.Karl A. UriS. Thomas F. and Cele A Biochemistry, 1998.37 p.7103-129.Structure of the thiostrepton-resistance-methyItransferase-Sadeno syl-L-methionine complex and its interaction with ribosomal RNA. Mark S.Pei C. Hang, Natalia V, John F. and Graeme L. The Journal ofBiological Chemistry, 2009 284 pl7013-20

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服那西肽抗藥性的新型核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 基因及其編碼的蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供所屬基因及其編碼蛋白的用途。本發(fā)明提供了一種細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,它包括序列表SEQ IDNO 2中所示 的1-274位氨基酸序列。上述細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其核苷酸編碼序列包括SEQ ID N0:1所示的 1-822位核苷酸序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中,細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。 本發(fā)明的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,來源于活躍鏈霉菌(Sti^ptomyces actuosus),是與硫鏈絲菌肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源的那西肽耐藥型RNA甲基 轉(zhuǎn)移酶。編碼該新蛋白的活躍鏈霉菌基因被命名為Nosih印tide Resistance RNAMethyltranferase(NHR)。研究顯示,這種蛋白具有比硫鏈絲菌肽RNA甲基轉(zhuǎn)移酶更強(qiáng)的甲 基化修飾核糖體RNA的活性。本發(fā)明的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,不僅包含氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示的 多肽,還包含SEQ ID NO :2所示的多肽通過相近似氨基酸替代或者經(jīng)過常規(guī)修飾獲得的、具 有核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能的蛋白或者多肽。本發(fā)明的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸編碼序列,不僅包括SEQ ID NO=I 所示的1-822位核苷酸序列,還包括由密碼子簡并性產(chǎn)生的相近似的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種載體,它含有編碼本發(fā)明的那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多 核苷酸。意即,該載體含有包括SEQ ID NO :1所示的1-822位核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞,它選自下組的宿主細(xì)胞(a)用本發(fā)明上述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。(b)用本發(fā)明上述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種含有上述含有編碼本發(fā)明的那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的 多核苷酸的載體的細(xì)胞。另一方面,本發(fā)明提供了那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的制備方法,該方法包含(a)在表達(dá)條件下,培養(yǎng)本發(fā)明上述的遺傳工程化的宿主細(xì)胞。(b)從培養(yǎng)物中分離出那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明提供了上述細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的制備方法,該制備方法包括 下列步驟;(1)從活躍鏈霉菌中克隆該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其多核苷酸序列選自序 列表SEQ ID NO :1中的1-822位;(2)將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因裝入適于表達(dá)的載體中;(3)用該重組載體轉(zhuǎn)化適于表達(dá)的宿主細(xì)胞;(4)在適于表達(dá)該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞,并從中回收和純化所述的細(xì) 菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白。所使用的載體可以為原核表達(dá)載體。所使用的載體可以為pET28A。所使用的宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌BL21。培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法可以為搖瓶培養(yǎng),具體條件為30°C中振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 5,加入終濃度Immol的IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)4小時收集菌體。所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白可以是通過工程菌搖瓶培養(yǎng)后超聲破碎 菌體,過濾菌體碎片,Ni離子親和層析法純化而獲得。NHR蛋白催化核糖體RNA甲基化,抑制NHR蛋白的表達(dá)量或者蛋白活性,就能夠降 低由于核糖體RNA甲基化導(dǎo)致的抗藥性。換言之,NHR蛋白的抑制劑能夠降低由于核糖體 RNA甲基化導(dǎo)致的抗藥性。因此,本發(fā)明的NHR蛋白能夠作為篩選減低由于核糖體RNA甲基 化導(dǎo)致的抗藥性的藥物的藥靶,尤其是降低那西肽抗藥性的藥物的藥靶。本發(fā)明提供了兩種分離的多核苷酸,此核糖核苷酸序列編碼本發(fā)明的那西肽耐藥 型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物。其中,所述的多核苷酸序列分別選自序列表SEQ ID NO :3中的 1051-1108 位和 1055-1083 位。
本發(fā)明還提供了上述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的應(yīng)用,即利用NHR蛋白 甲基化細(xì)菌體內(nèi)靶點(diǎn)RNA的特性,將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白作為篩選新型抗生 素的藥靶。也可以將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白作為篩選降低那西肽抗藥性的藥物 的藥靶。所述藥靶的靶點(diǎn)RNA可以是核糖體RNA或其亞結(jié)構(gòu)區(qū)域。所述藥靶的靶點(diǎn)可以是核糖體RNA??梢酝ㄟ^檢測靶點(diǎn)RNA的甲基化確定確定候選化合物是否為待選藥物。檢驗(yàn)靶 點(diǎn)RNA的甲基化的方法為測定同位素標(biāo)記的S-腺苷甲硫氨酸中提供的甲基摻入所述靶點(diǎn) RNA的數(shù)量和程度。本發(fā)明獲得的那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可以與那西肽聯(lián)合使用,降 低細(xì)菌的耐藥性。研究表明,在活躍鏈霉菌中編碼一個與TSR氨基酸一致性達(dá)74%的蛋白,本發(fā)明 克隆、表達(dá)純化出這個蛋白,并驗(yàn)證了其甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。并據(jù)此,提出了其在新型抗生 素篩選過程中的應(yīng)用。NHR蛋白催化核糖體RNA甲基化,抑制NHR蛋白的表達(dá)量或者蛋白活 性,就能夠降低由于核糖體RNA甲基化導(dǎo)致的抗藥性,尤其是降低那西肽抗藥性。因此,本 發(fā)明的NHR蛋白能夠作為降低那西肽抗藥性的藥物的藥靶。以核糖體功能區(qū)作為抗生素藥物新靶點(diǎn)的研究方興未艾,以耐藥性甲基轉(zhuǎn)移酶為 手段進(jìn)行抗生素新靶點(diǎn)的篩選,目前尚未見報道,因此,此方法對抗生素新靶點(diǎn)的研究提供 了新的思路。


圖1 NHR蛋白與TSR蛋白氨基酸序列比對。圖2 pET28A-NHR蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建策略。圖3 NHR蛋白表達(dá)電泳圖。圖4 NHR蛋白在E. coll 23S RNA上的靶點(diǎn)。圖5 NHR蛋白與58bp RNA底物結(jié)合熒光偏振曲線。圖6 NHR蛋白與^bp RNA底物結(jié)合熒光偏振曲線。圖7 NHR蛋白對野生型58bp RNA底物及A1067位突變RNA底物甲基化能力的區(qū)別。圖8 NHR蛋白對于58bp和^bp RNA底物甲基化能力。圖9多種致病菌中均包含有類似E. coli 58bp RNA的23S rRNA片段。圖10篩選NHR蛋白抑制劑,并與那西肽聯(lián)合使用,能夠降低細(xì)菌耐藥性。圖11以NHR甲基化核糖體RNA過程為靶標(biāo),篩選新型抗生素。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明經(jīng)過深入而廣泛的研究,在活躍鏈霉菌(Sti^ptomyces actuosus)中獲得 了與硫鏈絲菌肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源的那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。編碼該新蛋 白的活躍鏈霉菌基因被命名為Nosih印tide ResistanceRNA Methyltranferase (Mffi)。在成功克隆、表達(dá)出此蛋白后,本發(fā)明的研究顯示,這種蛋白具有比硫鏈絲菌肽RNA甲基轉(zhuǎn)移 酶更強(qiáng)的甲基化修飾核糖體RNA的活性。實(shí)施例1 那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)根據(jù)同源蛋白硫鏈絲菌肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列,在歐洲生物學(xué)中 心網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對,結(jié)果顯示,在活躍鏈霉菌(Sti^ptomycesactuosus)存在一個高 度保守的同源蛋白,編號AAB17875。已有的研究表明,此包含此蛋白的片段能夠賦予細(xì)菌 Streptomyces lividans 13 對那西肽抗生素的耐藥性。本發(fā)明將其命名為那西肽耐藥 型 RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 Nosih印tide Resistance RNA Methyltranferase (NHR),全長 NHR 是包 含274個氨基酸的蛋白質(zhì),分子量約為^Kd,分為N端和C端兩個結(jié)構(gòu)域。其中,N端包含 4個α螺旋和4個β折疊,并形成三明治結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)識別,結(jié)合底物RNA。C端包含7個α 螺旋和5個β折疊,主要負(fù)責(zé)結(jié)合甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)并負(fù)責(zé)完成底物的催 化過程。圖1顯示了 NHR蛋白與同源的TSR蛋白之間氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)之間的比對。實(shí)施例2 那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和原核表達(dá)質(zhì)粒pET28A-NHR 的構(gòu)建按照那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列,設(shè)計(jì)引物,使用PfuDNA聚合 酶,PCR擴(kuò)增出那西肽耐藥型RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因片段,限制性酶切后連接入ΡΕΤ28Α質(zhì)粒, 形成pET28A-NHR重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,酶解篩選陽性克隆,核苷酸序列分析證 實(shí)基因序列與設(shè)計(jì)相同。證實(shí)獲得陽性克隆。圖2顯示了 pET28A-NHR載體的構(gòu)建流程。限制性內(nèi)切酶購自Takara公司,大腸桿菌BL21,質(zhì)粒ρΕΤ28Α為本室保存。實(shí)施例3 =NHR基因的原核表達(dá)挑取數(shù)個陽性克隆菌落,在LB培養(yǎng)基中30°C中振蕩培養(yǎng)過夜,然后,以新的LB培 養(yǎng)基1 50稀釋,30°C中振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 5,加入終濃度Immol的IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)4 小時。誘導(dǎo)結(jié)束后,離心收集細(xì)菌,用PBS (pH= 7.4)洗滌2次,用SDS-PAGE方法分析表達(dá) 產(chǎn)物,考馬斯亮藍(lán)R-250染色后,可見誘導(dǎo)后上清液在分子量30Kd (考慮到蛋白末端6個組 氨酸標(biāo)簽,所以表達(dá)出的產(chǎn)物分子量稍高)。 實(shí)施例4 =NHR蛋白的純化將IL誘導(dǎo)好的BL21培養(yǎng)液離心收集菌體,用PBS (pH = 7. 4)洗滌2次后,使用 50mL結(jié)合緩沖液QOmmol磷酸緩沖液,500mmol NaCl,20mmol咪唑pH = 7. 4)重懸細(xì)胞。使 用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體(間隔5秒,超聲5秒,共20次,功率400w)后,12000rpm/min 4°C離心IOmin收集上清液。使用0. 22 μ M的濾頭過濾此上清液后,在冷庫中將上清液加載 到平衡好的M親和層析柱中。上樣結(jié)束后,加入10-20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液,洗去非 親和的雜蛋白。然后加入5倍柱床體積的洗脫緩沖液OOmmol磷酸緩沖液,500mmol NaCl, 300mmol咪唑pH = 7. 4),分管收集洗脫下的組分,-80°C保存。實(shí)施例5 :NHR蛋白純度鑒定及分子量測定樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,如圖3所示,考馬斯亮藍(lán)R-250染色后,所得產(chǎn)品純 度在95%以上,分子量約30Kd。實(shí)施例6 :NHR蛋白核糖體RNA底物的預(yù)測根據(jù)已經(jīng)被結(jié)晶出的細(xì)菌核糖體結(jié)構(gòu),以及同源蛋白硫鏈絲菌肽耐藥型RNA甲基 轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌中的甲基化靶點(diǎn),如圖3所示,預(yù)測出位于細(xì)菌核糖體大亞基23S rRNA上的A1067位是本發(fā)明的NHR蛋白在體內(nèi)作用的靶點(diǎn)。實(shí)施例7 :NHR蛋白底物的體外合成因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)自身的核糖體RNA可能已經(jīng)被甲基化,因此,本發(fā)明利用T7體外轉(zhuǎn) 錄系統(tǒng),將預(yù)測出的包含A1067位點(diǎn)的NHR底物RNA片段人工轉(zhuǎn)錄出來,并利用toea-PAGE 膠將底物 RNA 純化,在甲基化緩沖液中(25mmolHEPES,25mmol NH4Cl, 5mmol MgCl2, 5mmol DTT,pH = 7. 5)中溶解底物RNA,在90°C加熱5分鐘后,逐漸冷卻到室溫,使底物RNA復(fù)性。相應(yīng)的58bp和^bp RNA底物的二級結(jié)構(gòu)如圖3所示,預(yù)測的NHR底物RNA片段 序列見 SEQ ID NO. 3。實(shí)施例8 :NHR蛋白與底物的親和力測定將轉(zhuǎn)錄純化后的58bp和^bp長的RNA片段末端標(biāo)記上FTSC熒光基團(tuán),在Perkin Elmer LS55熒光光譜儀上測定FTSC標(biāo)記的RNA與NHR蛋白的分子間相互作用強(qiáng)度。具體 的,將Iul 58bp或 bp的FTSR標(biāo)記的RNA稀釋到400ul甲基化緩沖液中(25讓ol HEPES, 25mmol NH4Cl, 5mmol MgCl2, 5mmol DTT, pH = 7. 5),在 492nm 激發(fā)波長,516nm 發(fā)射波長的 條件下,在測量熒光偏振量(Anisotropy)的模式下,逐漸滴定NHR蛋白,記錄體系中熒光偏 振量的變化,將結(jié)果輸入Origin 7. 5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件中,利用Onebindingsite模型進(jìn)行數(shù)據(jù) 擬合。計(jì)算NHR與不同底物之間的親和常數(shù)Kd。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NHR與58bp RNA底物之間 的Kd = 1. 21 μ Μ,NHR與^bpRNA底物之間的Kd = 1.08 μ Μ.詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5和圖6.實(shí)施例9 =NHR蛋白催化核糖體RNA甲基化的活性測定酶活的甲基化反應(yīng)在40 μ 1體系里進(jìn)行,每個反應(yīng)體系中包括0. 025uCi 14C 標(biāo)記的S-腺苷甲硫氨酸(SAM, GE公司,編號CFA360),1 μ gNHR或TSR蛋白,0-0. 7nmol 的RNA底物,反應(yīng)的緩沖體系為甲基化緩沖液25mmol HEPES,25mmol NH4Cl, 5mmol MgCl2, 5mmol DTT, pH = 7. 5)。每個反應(yīng)在25°C下進(jìn)行30min,然后整個反應(yīng)后的混合物被轉(zhuǎn)入 孔徑0.66mm的96孔玻璃纖維材質(zhì)的藥物篩選平板(CORNING 3511)。每個反應(yīng)體系中被 加入IOOyl 2% TFA溶液以沉淀體系中的RNA,靜置5min后,使用真空泵抽濾,使體系中 RNA被沉淀在玻璃纖維膜上。每個樣品孔使用300ul 2% TFA洗滌以除去多余的SAM,然 后,平板被放置在55°C Ihr烘干。 最終,在液體閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer 1450 LSC Luminoscence Counter).上讀板測定每個反應(yīng)體系中底物被甲基化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示,如圖7所示,當(dāng)58bpRNA上1067位腺嘌呤A突變?yōu)槟蜞奏,NHR對突變體RNA片段基 本喪失甲基化能力,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,A1067位是NHR蛋白在23S RNA上的進(jìn)行甲基化的靶 點(diǎn)。對底物RNA的進(jìn)一步滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,如圖8所示,NHR無論對58bp RNA底物還是 29bp RNA底物,都表現(xiàn)出濃度依賴性的甲基化能力。而在相同條件下,NHR蛋白對58bp RNA 底物的甲基化能力要強(qiáng)于^bpRNA底物。實(shí)施例10 多種致病菌中均包含有類似E. coli 58bp RNA的23S rRNA片段原核生物的23S rRNA在序列上保守很高,搜索NCBI和EBI基因組數(shù)據(jù)庫表明,多 種與人類和動物健康密切相關(guān)的致病細(xì)菌中均包含有類似E. coli58bp RNA的23S rRNA片 段,例如引發(fā)流感的流感嗜血桿菌,引發(fā)麻風(fēng)病的麻風(fēng)分支桿菌,引發(fā)萊姆關(guān)節(jié)炎的博式疏 螺旋體,引發(fā)胃炎和胃癌的幽門螺旋桿菌,引發(fā)生殖器疾病的支原體等,參見圖9。令人吃 驚的是,雖然這些在進(jìn)化樹上分屬不同位置的細(xì)菌相應(yīng)的RNA序列上略有區(qū)別,但是包含 A1067的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)和序列是非常保守的。因此這些致病菌的23S RNA都可能是NHR蛋白的甲基化的靶點(diǎn),與大腸桿菌A1067位同源的多種致病菌中相同位置腺苷A的甲基化,是 這些細(xì)菌已具有的或潛在具有的對含硫多肽類抗生素如那西肽耐藥性的分子機(jī)制。實(shí)施例11 利用NHR蛋白抑制劑降低細(xì)菌對那西肽的耐藥性如圖IOA所示,自然進(jìn)化或人工構(gòu)建的包含NHR蛋白的細(xì)菌,能夠甲基化自身23S rRNA上1067位的腺苷A(包括其它細(xì)菌中與大腸桿菌A1067結(jié)構(gòu)上同源的位點(diǎn)),此位點(diǎn) 被甲基化后,局部構(gòu)象發(fā)生變化,無法再被那西肽抗生素所結(jié)合,所以細(xì)菌進(jìn)化出對那西肽 的耐藥性。在了解此過程的生物化學(xué)機(jī)制的前提下,能夠利用這一過程篩選NHR蛋白的抑 制劑,降低細(xì)菌的耐藥性。具體過程如圖IOB所示,高通量篩選人工合成或來自天然產(chǎn)物的 化合物文庫,從中找到能夠影響酶構(gòu)象及活力的先導(dǎo)化合物(具體的篩選手段包括但不局 限于熒光極化技術(shù),熒光偏振技術(shù),等離子共振技術(shù),凝膠阻滯技術(shù),以及計(jì)算機(jī)虛擬篩選 等技術(shù)),如上所述,此先導(dǎo)化合物在細(xì)菌體內(nèi)能夠使NHR失活,從而破壞細(xì)菌自身核糖體 RNA的甲基化,使細(xì)菌失去對那西肽的耐藥性。因此,利用此方法篩選出的NHR蛋白的抑制 劑,在與那西肽聯(lián)合使用的情況下,能夠顯著降低細(xì)菌對那西肽產(chǎn)生的耐藥性,有效降低那 西肽的殺菌濃度。實(shí)施例12 利用NHR蛋白甲基化細(xì)菌23 rRNA的特性建立新型抗生素的篩選靶點(diǎn)在了解NHR蛋白在體內(nèi)作用機(jī)制的基礎(chǔ)上,能夠利用這一過程篩選作用于核糖體 上的新型抗生素。具體過程如圖9所示,高通量篩選人工合成或來自天然產(chǎn)物的化合物文 庫,利用體外建立的重組NHR蛋白甲基化核糖體RNA的體系,從化合物庫中找到能夠影響核 糖體RNA構(gòu)象的先導(dǎo)化合物(具體的篩選手段包括但不局限于熒光極化技術(shù),熒光偏振技 術(shù),等離子共振技術(shù),凝膠阻滯技術(shù),以及計(jì)算機(jī)虛擬篩選等技術(shù))。如上所述,此先導(dǎo)化合 物能夠結(jié)合細(xì)菌核糖體23S rRNA片段,改變A1067位附近的核酸分子構(gòu)象,最終影響細(xì)菌 核糖體的構(gòu)象和正常功能,從而最終殺死細(xì)菌或抑制細(xì)菌生長。無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述,相信采用前面所公開的內(nèi)容,本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度 地應(yīng)用本發(fā)明。因此,前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明,而非以任何方式 限制本發(fā)明的范圍。從以上描述,本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征,而且在不偏離其 主旨和范圍的情況下,可對本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。序列表<210>1<211>825<212>DNA<213>活躍鏈霉菌<220><221>CDS<222>(1). . (825)<223><400>1atg act gag ccc gcc ate ate acg aat gcc tct gac ccc gcg gtg cag 48Met Thr Glu Pro Ala lie lie Thr Asn Ala Ser Asp Pro Ala Val Gln
151015
agaateategacgtcacgaagcattcgegggccageateaagacgacg96
ArglielieAspValThrLysHisSerArgAlaSerlieLysThrThr
202530
CtgategaggacaccgagecgCtgatggagtgcateagggccggtgtg144
LeulieGluAspThrGluProLeuMetGluCyslieArgAlaGlyVal
354045
cagttcategaggtgtacggctccageggcacgCCgctcgacCCCgcc192
GlnPhelieGluValTyrGlySerSerGlyThrProLeuAspProAla
505560
CtgctcgacCtgtgceggcagegggagateCCggtceggCtgategac240
LeuLeuAspLeuCysArgGlnArgGlulieProValArgLeulieAsp
65707580
gtgtcgategtgaaccagCtgttcaaggccgagCgCaaggcgaaggtc288
ValSerlieValAsnGlnLeuPheLysAlaGluArgLysAlaLysVal
859095
ttcggcategcgCgCgtgCCgeggCCggcceggCtggcggacategcc336
PheGlylieAlaArgValProArgProAlaArgLeuAlaAsplieAla
100105110
gagCgCggcggtgacgtcgtcgtcctcgacggtgtgaagategtcggc384
GluArgGlyGlyAspValValValLeuAspGlyValLyslieValGly
115120125
aacateggcgccategtgeggacctcgCtggcgctcggcgccgcgggc432
AsnlieGlyAlalieValArgThrSerLeuAlaLeuGlyAlaAlaGly
130135140
ategtcCtggtcgacagegacctcgccaccategccgaceggeggCtg480
lieValLeuValAspSerAspLeuAlaThrlieAlaAspArgArgLeu
145150155160
CtgegggcgageCgCggctacgtcttctccCtgCCCgtcgtcctcgcc528
LeuArgAlaSerArgGlyTyrValPheSerLeuProValValLeuAla
165170175
gacCgCgaggaggccgtctccttcCtgegggacaacgacategcgCtg576
AspArgGluGluAlaValSerPheLeuArgAspAsnAsplieAlaLeu
180185190
atggtgCtggacaccgacggcgacctcggggtgaaggacctcggggac624
MetValLeuAspThrAspGlyAspLeuGlyValLysAspLeuGlyAsp
195200205
CgCgccgacCgCatggcgCtggtcttcggcagegagaagggcggcCCg672
ArgAlaAspArgMetAlaLeuValPheGlySerGluLysGlyGlyPro
210215220
tcgggcCtgttccaggaggcgtcggcgggcacggtgtccateccg atg
SerGlyLeuPheGlnGluAlaSerAlaGly Thr ValSerlieProMet
225230235240
ctcagetccacggagtccCtgaacgtgtcggtgtccgtcggcategcc
LeuSerSerThrGluSerLeuAsnValSerValSerValGlylieAla
245250255
CtgcacgagCgCtcggccCgCaacttcgccgtceggCgCgccgccgca
LeuHisGluArgSerAlaArgAsnPheAlaValArgArgAlaAlaAla
260265270
caggcctga825
Gln Ala
<210>2
<211>274
<212>PRT
<213>活躍鏈霉菌
<400>2
MetThrGluProAlalielieThrAsnAlaSerAspProAlaValGln
151015
ArglielieAspValThrLysHisSerArgAlaSerlieLysThrThr
202530
LeulieGluAspThrGluProLeuMetGluCyslieArgAlaGlyVal
354045
GlnPhelieGluValTyrGlySerSerGlyThrProLeuAspProAla
505560
LeuLeuAspLeuCysArgGlnArgGlulieProValArgLeulieAsp
65707580
ValSerlieValAsnGlnLeuPheLysAlaGluArgLysAlaLysVal
859095
PheGlylieAlaArgValProArgProAlaArgLeuAlaAsplieAla
100105110
GluArgGlyGlyAspValValValLeuAspGlyValLyslieValGly
115120125
AsnlieGlyAlalieValArgThrSerLeuAlaLeuGlyAlaAlaGly
130135140
IleValLeuValAspSerAspLeuAlaThrlieAlaAspArgArgLeu
145150155160
LeuArgAlaSerArgGlyTyrValPheSerLeuProValValLeuAla
1651701750182
0183
0184
0185
0186
0187
0188
0189
0190
0191
0192
0193
0194
0195
0196
0197
0198 coli
Asp
Met
Arg
Ser 225 Leu
Arg
Val
Ala 210 Gly
Glu Glu 180 Asp
Ser Leu His
Leu 195 Asp
Leu
Ser
Glu
Arg
Phe
Thr
Arg 260
Ala Thr Met Gln
Val
Asp
Ala
Glu 230
Ser
Ser Phe Gly
Glu 245
Ser Ala
Leu 215 Ala
Leu
Arg
Asp 200 Val
Ser
Asn
Asn
Leu 185 Leu
Phe
Ala
Val
Phe 265
Arg
Gly
Gly
Gly
Ser 250 Ala
Asp
Val
Ser
Thr 235 Val
Asn Asp Lys
Glu 220 Val
Ser Val Arg
Asp 205 Lys
Ser
Val
Arg
lie 190 Leu
Gly
lie
Gly
Ala 270
Ala Gly Gly Pro
Leu
Asp
Pro
Met 240 Ala
lie 255
Ala Ala
Gln Ala <210>3 <211>2905 <212>RNA
<213>RRLA-RRNA 23S ribosomal RNA(rrlA)4035542. . 4038446 Escherichia
K-12
0199]substr. MG16550200]<400>30201]gguuaagcgacuaagcguacacgguggaugcccuggcagucagaggcgaugaaggacgug600202]cuaaucugcgauaagcgucgguaaggugauaugaaccguuauaaccggcgauuuccgaau1200203]ggggaaacccaguguguuucgacacacuaucauuaacugaauccauagguuaaugaggcg1800204]aaccgggggaacugaaacaucuaaguaccccgaggaaaagaaaucaaccgagauuccccc2400205]aguagcggcgagcgaacggggagcagcccagagccugaaucaguguguguguuaguggaa3000206]gcgucuggaaaggcgugcgauacagggugacagccccguacacaaaaaugcacaugcugu3600207]gagcucgaugaguagggcgggacacgugguauccugucugaauauggggggaccauccuc4200208]caaggcuaaauacuccugacugaccgauagugaaccaguaccgugagggaaaggcgaaaa4800209]gaaccccggcgaggggagugaaaaagaaccugaaaccguguacguacaagcagugggagc5400210]acgcuuaggcgugugacugcguaccuuuuguauaaugggucagcgacuuauauucuguag6000211]caagguuaaccgaauaggggagccgaagggaaaccgagucuuaacugggcguuaaguugc6600212]aggguauagacccgaaacccggugaucuagccaugggcagguugaagguuggguaacacu7200213]aacuggaggaccgaaccgacuaauguugaaaaauuagcggaugacuuguggcugggggug7800214]aaaggccaaucaaaccgggagauagcugguucuccccgaaagcuauuuagguagcgccuc8400215]gugaauucauCUCCgggggUagagcacuguuucggcaagggggucaucccgacuuaccaa9000216]cccgaugcaaacugcgaauaccggagaauguuaucacgggagacacacggcgggugcuaa9600217]CgUCCgUCgUgaagagggaaacaacccagaccgccagcuaaggucccaaagucaugguua10200218]agugggaaacgaugugggaaggcccagacagccaggauguuggcuuagaagcagccauca10800219]uuuaaagaaagcguaauagcucacuggucgagucggccugcgcggaagauguaacggggc1140
uaaaccaugcaccgaagcugcggcagcgacacuauguguuguuggguaggggagcguucu1200
guaagccugugaaggugugcugugaggcaugcuggagguaucagaagugcgaaugcugac1260
auaaguaacgauaaagcgggugaaaagcccgcucgccggaagaccaaggguuccugucca1320
acguuaaucggggcagggugagucgaccccuaaggcgaggccgaaaggcguagucgaugg1380
gaaacagguuaauauuccuguacuugguguuacugcgaaggggggacggagaaggcuaug1440
UUggCCgggCgacgguugucccgguuuaagcguguaggcugguuuuccaggcaaauccgg1500
aaaaucaaggcugaggcgugaugacgaggcacuacggugcugaagcaacaaaugcccugc1560
uuccaggaaaagccucuaagcaucagguaacaucaaaucguaccccaaaccgacacaggu1620
ggucagguagagaauaccaaggcgcuugagagaacucgggugaaggaacuaggcaaaaug1680
gugccguaacuucgggagaaggcacgcugauauguaggugaagcgacuugcucguggagc1740
ugaaaucagucgaagauaccagcuggcugcaacuguuuauuaaaaacacagcacugugca1800
aacacgaaaguggacguauacggugugacgCCUgCCCggUgccggaagguuaauugaugg1860
gguuagccgcaaggcgaagcucuugaucgaagccccgguaaacggcggccguaacuauaa1920
cgguccuaagguagcgaaauuccuugucgg guaaguuccgaccugcacgaauggcguaau1980
gauggccaggcugucuccacccgagacucagugaaauugaacucgcugugaagaugcagu2040
guacccgcggcaagacggaaagaccccgugaaccuuuacuauagcuugacacugaacauu2100
gagccuugauguguaggauaggugggaggcuuugaaguguggacgccagucugcauggag2160
ccgaccuugaaauaccacccuuuaauguuu gauguucuaa cguugacccg uaauccgggu2220
ugcggacagugucugguggguaguuugacuggggcggucuccuccuaaagaguaacggag2280
gagcacgaagguuggcuaauccuggucggacaucaggagguuagugcaauggcauaagcc2340
agcuugacugcgagcgugacggcgcgagcaggugcgaaagcaggucauagugauccggug2400
guucugaauggaagggccaucgcucaacggauaaaagguacuccggggauaacaggcuga2460
uaccgcccaagaguucauaucgacggcgguguuuggcaccucgaugucggcucaucacau2520
CCUggggCUgaaguaggucccaaggguauggcuguucgccauuuaaagugguacgcgagc2580
uggguuuagaacgucgugagacaguucggucccuaucugcCgUgggCgCUggagaacuga2640
ggggggcugcuccuaguacgagaggaccggaguggacgcaucacugguguUCgggUUgUC2700
augccaauggcacugcccgguagcuaaaugcggaagagauaagugcugaaagcaucuaag2760
cacgaaacuugccccgagaugaguucucccugacuccuugagaguccugaaggaacguug2820
aagacgacgacguugauaggCCgggUgUgUaagcgcagcgaugcguugagcuaaccggua2880
cuaaugaaccgugaggcuuaaccuu290權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其特征在于,它包括序列表SEQ ID NO :2中所示 的1-274位氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其特征在于,它的核苷酸編碼序 列包括SEQ ID NO 1所示的1-822位核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其特征在于,它的氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。
4.一種載體,其特征在于,該載體含有包括SEQ ID NO :1所示的1-822位核苷酸序列。
5.一種細(xì)胞,其特征在于,該細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體。
6.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的制備方法,其特征在于,該制備 方法包括下列步驟(1)從活躍鏈霉菌中克隆該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其多核苷酸序列選自序列表 SEQ IDNO :1 中的 1-822 位;(2)將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因裝入適于表達(dá)的載體中;(3)用該重組載體轉(zhuǎn)化適于表達(dá)的宿主細(xì)胞;(4)在適于表達(dá)該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞,并從中回收和純化所述的細(xì)菌核 糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利6所述的方法,其特征在于,所使用的載體為原核表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于,所使用的載體為PET28A。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所使用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法為搖瓶培養(yǎng),具體 條件為30°C中振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 5,加入終濃度Immol的IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)4小時收集 菌體。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白 是通過工程菌搖瓶培養(yǎng)后超聲破碎菌體,過濾菌體碎片,Ni離子親和層析法純化而獲得。
12.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的應(yīng)用,其特征在于,利用NHR 蛋白甲基化細(xì)菌體內(nèi)靶點(diǎn)RNA的特性,將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白作為篩選新型 抗生素的藥靶。
13.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的應(yīng)用,其特征在于,將該細(xì)菌 核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白作為篩選降低那西肽抗藥性的藥物的藥靶。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或者13所述的應(yīng)用,其特征在于,所述藥靶的靶點(diǎn)RNA是核糖體 RNA或其亞結(jié)構(gòu)區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或者13所述的應(yīng)用,其特征在于,所述藥靶的靶點(diǎn)是核糖體RNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或者13所述的應(yīng)用,其特征在于,通過檢測靶點(diǎn)RNA的甲基化確 定確定候選化合物是否為待選藥物,檢驗(yàn)靶點(diǎn)RNA的甲基化的方法為測定同位素標(biāo)記的 S-腺苷甲硫氨酸中提供的甲基摻入所述靶點(diǎn)RNA的數(shù)量和程度。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種新型抗生素耐藥型甲基轉(zhuǎn)移酶。更具體地,本發(fā)明涉及那西肽耐藥型核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因克隆,蛋白制備,以及其作為新型抗生素篩選靶點(diǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,它包括序列表SEQ ID NO2中所示的1-274位氨基酸序列,其核苷酸編碼序列包括SEQ ID NO1所示的1-822位核苷酸序列。利用NHR蛋白甲基化細(xì)菌體內(nèi)靶點(diǎn)RNA的特性,將該細(xì)菌核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白作為篩選新型抗生素或者降低那西肽抗藥性的藥物的藥靶。本發(fā)明降低那西肽抗藥性的研究提供了新的思路。
文檔編號C12N15/54GK102108344SQ200910247318
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者沈妍, 王哲, 阿拉斯太爾·馬歇爾, 陳東戎 申請人:復(fù)旦大學(xué)
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
1