專利名稱：大豆銹病菌的檢測引物、試劑盒以及實(shí)時(shí)pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含酶或微生物的測定或檢驗(yàn)方法，特別是涉及一種大豆銹病菌的檢測引物、試劑盒以及實(shí)時(shí)PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
大豆銹病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，又名豆薯多層銹菌，是危害豆科經(jīng)濟(jì)作物的專性寄生的氣傳真菌，屬擔(dān)子菌亞門真菌。寄主范圍目前認(rèn)為僅限于豆科植物，主 要侵染大豆葉片和葉柄，嚴(yán)重時(shí)莖桿和豆莢也能受害，屬于主權(quán)國家禁止入境的植物檢疫 危險(xiǎn)性有害生物。有必要建立大豆銹病菌的快速檢測方法，加強(qiáng)口岸檢疫有效防止大豆銹 病菌進(jìn)境，以保護(hù)本國大豆生產(chǎn)。通常采用的現(xiàn)有聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，縮略為PCR)的分子 診斷方法，可以基本滿足部分植物病原微生物的準(zhǔn)確快速檢疫、檢測和鑒定要求，但是，將 EvaGreen染料用于實(shí)時(shí)PCR和高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting，縮略為HRM) 分析進(jìn)行植物病原真菌的檢測在國內(nèi)外還是處于起步階段。EvaGreen染料是一種DNA結(jié)合 染料，非常穩(wěn)定且無致突變性和細(xì)胞毒性。通過有選擇的結(jié)合雙鏈DNA，EvaGreen在實(shí)驗(yàn)中 可以使用較高的濃度，對(duì)PCR的抑制作用很低，對(duì)低熔點(diǎn)的DNA鏈也可以檢測到。而HRM是 一種遺傳學(xué)分析手段，它通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中DNA染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況的 獨(dú)特的熔解曲線形狀，特別是其中的產(chǎn)物峰，就可以對(duì)不同的核酸片段進(jìn)行區(qū)分，而且具有 很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種大豆銹病 菌的檢測引物。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種大豆銹 病菌的檢測試劑盒。本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種大豆銹 病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法。對(duì)于本發(fā)明所要解決的大豆銹病菌檢測引物，采用以下技術(shù)方案予以解決這種大豆銹病菌的檢測引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。優(yōu)選地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO :1。優(yōu)選地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列
PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。對(duì)于本發(fā)明所要解決的大豆銹病菌的檢測試劑盒，采用以下技術(shù)方案予以解決這種大豆銹病菌的檢測試劑盒包含一對(duì)引物，所述一對(duì)引物是正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3‘。優(yōu)選地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO :1。優(yōu)選地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。對(duì)于本發(fā)明所要解決的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，采用以下技術(shù)方案予以 解決這種大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，依次有以下步驟1)合成引物，2)待測物中加入引物，3)擴(kuò)增反應(yīng)。這種大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法的特點(diǎn)是所述步驟1)合成引物，是一對(duì)由特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R組 成的一對(duì)特異性引物，再按照特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R的序列分別合 成特異性引物備用；所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。對(duì)于本發(fā)明所要解決的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，采用以下進(jìn)一步的技術(shù) 方案予以解決所述步驟2)待測物中加入引物，是對(duì)大豆銹病菌的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。所述擴(kuò)增體系包含濃度為10 IOOng/ μ L的1 μ L大豆銹病菌基因組DNA模板、 1 μ M備用的特異性引物、EvaGreen反應(yīng)混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L，總體積為 25 μ L0所述步驟3)擴(kuò)增反應(yīng)依次有以下子步驟3 · 1)在 95°C下預(yù)變性 15min ；3 · 2)在95°C下反應(yīng)15s、在60°C下反應(yīng)60s，為一個(gè)反應(yīng)區(qū)間，重復(fù)進(jìn)行40次；3 · 3)對(duì)PCR儀自動(dòng)記錄的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行HRM分析，95°C持續(xù)15秒，60°C持續(xù)15 秒，95 °C持續(xù)15秒。所述HRM分析是對(duì)反映大豆銹病菌基因組DNA為模板與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)結(jié)果的 熔解曲線進(jìn)行分析。所述分析的判定標(biāo)準(zhǔn)是如果陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒 有產(chǎn)物峰，而樣品的檢測結(jié)果有產(chǎn)物峰，判定待測物為大豆銹病菌；如果陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有產(chǎn)物峰，而樣品的檢測結(jié)果沒有產(chǎn)物峰，判定待測物為非 大豆銹病菌。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是提出了適用于大豆銹病菌EvaGreen PCR快速檢測的引物和試劑盒。檢測方法具 有檢測簡單、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛用 于對(duì)實(shí)際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的病組織進(jìn)行大豆銹病菌分子生物學(xué)鑒定或檢測， 特別適用于口岸檢疫等時(shí)效性要求特別強(qiáng)的場合使用。


附圖是本發(fā)明具體實(shí)施方式
的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性試驗(yàn)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施方式
并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。一種大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，采用檢測試劑盒中的檢測引物，包括正向 引物Rs-F和反向引物Rs-R，正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO 1；反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。具有如下的核酸序列PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。具體檢測依次有以下步驟1)合成引物先設(shè)計(jì)一對(duì)由特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R組成的 一對(duì)特異性引物，再按照特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R的序列分別合成特 異性引物備用；正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。2)待測物中加入引物，對(duì)大豆銹病菌的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增體系 包含濃度為10 lOOng/μ L的IyL大豆銹病菌基因組DNA模板、1μ M備用的特異性引 物、EvaGreen反應(yīng)混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L(超世生物公司出品，型號(hào)為 H30102)，總體積為 25 μ L03)擴(kuò)增反應(yīng)依次有以下子步驟3 · 1)在 95°C下預(yù)變性 15min ；3 · 2)在95°C下反應(yīng)15s、在60°C下反應(yīng)60s為一個(gè)反應(yīng)區(qū)間，重復(fù)進(jìn)行40次；3 · 3)對(duì)PCR儀自動(dòng)記錄的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行HRM分析，95°C持續(xù)15秒，60°C持續(xù)15秒，95 °C持續(xù)15秒。對(duì)反映DNA染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)結(jié)果的熔解曲線進(jìn)行分析的判定標(biāo)準(zhǔn)是如果以大豆銹病菌基因組DNA為模板的陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有 產(chǎn)物峰，而樣品的檢測結(jié)果有產(chǎn)物峰，則判定所檢測的真菌為大豆銹病菌；如果以大豆銹病 菌基因組DNA為模板的陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有產(chǎn)物峰，而樣 品的檢測結(jié)果沒有產(chǎn)物峰，則判定所檢測的真菌為非大豆銹病菌。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng) 視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。0910206ST-大豆銹病菌的檢測引物、試劑盒以及實(shí)時(shí)PCR檢測方法-序列表.SEQ序列表<110>深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>大豆銹病菌的檢測引物、試劑盒以及實(shí)時(shí)PCR檢測方法<130)0910206 ST<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgcacttta ttgtggctca aaact25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2atgattaata ggtgggttgc age2權(quán)利要求
一種大豆銹病菌的檢測引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，其特征在于所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO1PPSG2FP-F5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO2PPSG2RP-R5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
2.如權(quán)利要求1所述的大豆銹病菌的檢測引物，其特征在于 所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F 5' -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ SEQ ID NO :1。
3.如權(quán)利要求2所述的大豆銹病菌的檢測引物，其特征在于 所述反向引物Rs-R引物具有如下的核酸序列 PPSG2RP-R 5' -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’ SEQ ID NO :2。
4.一種大豆銹病菌的檢測試劑盒，包含一對(duì)引物，所述一對(duì)引物是正向引物Rs-F和反 向引物Rs-R，其特征在于所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP-F :5’ -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ ； 所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP-R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。
5.一種大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，依次有以下步驟1)合成引物，2)待測物中 加入引物，3)擴(kuò)增反應(yīng)，其特征在于所述步驟1)合成引物，是先設(shè)計(jì)一對(duì)由特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R 組成的一對(duì)特異性引物，再按照特異性正向引物Rsf-F、特異性反向引物Rsf-R的序列分別 合成特異性引物備用；所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP-F :5’ -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ ； 所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP-R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。
6.如權(quán)利要求5所述的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，其特征在于所述步驟2)待測物中加入引物，是對(duì)大豆銹病菌的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求4所述的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，其特征在于所述擴(kuò)增體系包含濃度為10 IOOng/ μ L的1 μ L大豆銹病菌基因組DNA模板、1 μ M 備用的特異性引物、EvaGreen反應(yīng)混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L，總體積為25 μ L。
8.如權(quán)利要求7所述的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，其特征在于 所述步驟3)擴(kuò)增反應(yīng)依次有以下子步驟3 · 1)在95°C下預(yù)變性15min ；3 · 2)在95°C下反應(yīng)15s、在60°C下反應(yīng)60s，為一個(gè)反應(yīng)區(qū)間，重復(fù)進(jìn)行40次； 3 · 3)對(duì)PCR儀自動(dòng)記錄的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行HRM分析，95°C持續(xù)15秒，60°C持續(xù)15秒， 95°C持續(xù)15秒。
9.如權(quán)利要求8所述的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，其特征在于所述HRM分析是對(duì)反映大豆銹病菌基因組DNA為模板與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)結(jié)果的熔解曲線進(jìn)行分析判定。
10.如權(quán)利要求9所述的大豆銹病菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法，其特征在于 所述分析判定的標(biāo)準(zhǔn)是如果陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有產(chǎn) 物峰，而樣品的檢測結(jié)果有產(chǎn)物峰，判定待測物為大豆銹病菌；如果陽性對(duì)照有明顯的產(chǎn)物 峰，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有產(chǎn)物峰，而樣品的檢測結(jié)果沒有產(chǎn)物峰，判定待測物為非大豆 銹病菌。
全文摘要
一種大豆銹病菌的檢測引物、試劑盒以及實(shí)時(shí)PCR檢測方法，引物包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，正向引物的序列是5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；反向引物的序列是5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。檢測方法依次有合成引物、待測物中加入引物、擴(kuò)增反應(yīng)包括預(yù)變性、重復(fù)進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)區(qū)間、對(duì)PCR儀自動(dòng)記錄的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行HRM分析。具有檢測簡單、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于對(duì)實(shí)際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的病組織進(jìn)行大豆銹病菌分子生物學(xué)鑒定或檢測，特別適用于口岸檢疫等時(shí)效性要求特別強(qiáng)的場合使用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101798593SQ20091024640
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者仲建忠, 康林, 李芳榮, 王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心