專利名稱：一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞組織工程領(lǐng)域，具體地說是一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外 定向分化的方法。
背景技術(shù)：
干細胞是來自于胚胎、胎兒或成體內(nèi)，在特定的條件下具有一定的自我更新與增 殖分化能力的一類細胞，該類型細胞不但能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型與自身完全相同的子細 胞，而且能產(chǎn)生組成機體組織、器官的已特化的細胞，同時還能分化為祖細胞，因此干細胞 是修復體內(nèi)受損組織的理想種子細胞，在細胞治療、外科整形及組織工程等方面都具有極 其重要的研究和臨床應用價值。根據(jù)發(fā)生學來源干細胞可分類為胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)和成 體干細胞(adult stem cell, ASC) 0胚胎干細胞(ESC)是指當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時 內(nèi)細胞團的細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一種高度未分 化細胞，具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞[文獻1 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al. Embryonic stem cell lines derived fromhuman blastocysts. Science，1998，282 :1145-1147.]。成體干細胞(ASC)是指存在于一種已分化組織中的未分化細胞，能夠自我更新并 且能特化形成該類型組織的細胞。ASC存在于機體的各種組織器官中，包括骨髓間充質(zhì) 干細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞、肝干細胞、皮膚表皮干細胞、腸上皮干細胞、視網(wǎng)膜干細 胞、胰腺干細胞等[文獻 2:JiangY，Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow. Nature,2002,418 :41-49. 文獻 3 :Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA, et al. Turning brain into blood :a hematopoietic fateadopted by adult neural stem cell in vivo. Science,1999,283 534-537.文獻 4 :Dor Y, Brown J, Martinez 01 et al. Adult pancreatic beta-cells are formed byself-dulplication rather than stem-cell differentiation. Nature，2004，4 :41_46.]。在多數(shù)情況下，成體干細胞可分化為與其組織來源一致 的細胞，但是在某些情況下，ASC則表現(xiàn)出很強的跨系或跨胚層分化的能力，即橫向分 化(trans-differentiation)[文 獻 5 Krause DS, Theise ND, Collector MI, etal. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone-marrow derivedstem cell.Cell,2001,105 :369-377.文獻 6 :Clarke DL, Johansson CB, WilbertzJ, et al. Generalized potential of adult neural stem cells.Science,2000,288 1660-1663.]干細胞的分化主要受到生長微環(huán)境的調(diào)控，體內(nèi)正常組織微環(huán)境可以誘導干細 胞向特定組織細胞類型定向分化并整合為組織。而將干細胞直接植入受損組織時，其修 復的效果不理想，并常伴有并發(fā)癥。這是由于受損組織的微環(huán)境已被破壞，干細胞識別此 微環(huán)境的能力下降，定向分化效率降低。另外，由于干細胞可多向分化，直接將其植入體內(nèi)還可能產(chǎn)生腫瘤。因此，干細胞在植入人體之前，應在體外先進行定向誘導分化，以提 高其在體內(nèi)向受損組織類型分化的效率，并降低臨床應用的風險[文獻7:Li X, Yu X， Lin Q，et al. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiate intofunctional cardiac phenotypes by cardiac microenvironment. Journal ofMolecular and Cellular Cardiology. 2007，42 :295-303.]。目前誘導干細胞體外定向分化的方法主要有(1)條件培養(yǎng)液誘導[文獻8
EJ, Hong SH, Jeong JA, et al. In vitro mesengenic potential of humanumbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.Biochemical andBiophysical Research Communications. 2004,321 :102-108. ] ； (2)誘導細胞和干細胞直接接觸共培養(yǎng)誘導[文獻 9 :0ng SY, Dai H, Leong Kff. Inducinghepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006,27 :4087-4097. ] ； (3)誘導細胞和干 細胞transwell膜分離共培養(yǎng)誘導[文獻7]。但上述方法分別存在如下問題(1)條件培 養(yǎng)液含有的化學試劑具有一定的毒性，可使干細胞發(fā)生變異，增加臨床應用的風險；(2)直 接接觸共培養(yǎng)將誘導細胞和干細胞在同一個培養(yǎng)體系中混合在一起，干細胞不能徹底和誘 導細胞分開，因此存在著干細胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等問題， 不適合臨床應用；C3)盡管Transwell膜分離共培養(yǎng)方式通過半透膜將誘導細胞和干細胞 隔開，兩種細胞不直接接觸，但是Transwell體系基于M孔板或6孔板，規(guī)模很小，且半透 膜的作用面積有限，存在嚴重的物質(zhì)濃度梯度，不適合大規(guī)模誘導干細胞細胞體外定向分 化。因此，需要進一步發(fā)展生物安全性好、適合大規(guī)模干細胞體外定向誘導分化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，其既 能實現(xiàn)干細胞向誘導細胞類型體外定向分化，同時又能將干細胞和誘導細胞進行免疫隔 離，有利于目的細胞的回收和應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，將具有誘導分化功能的誘導 細胞包埋在生物微膠囊中，將該微膠囊再與外部不同生長方式的干細胞進行共培養(yǎng)，通過 微膠囊內(nèi)誘導細胞的定向誘導作用，實現(xiàn)干細胞的定向誘導分化(圖1)。所述生物微膠囊為海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊或海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊。采用 靜電液滴法、氣流噴射法等制備包埋有誘導細胞的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊或海藻酸鈉 /殼聚糖微膠囊等。通過體外高密度三維生長，使得微膠囊內(nèi)誘導細胞保持其功能，持續(xù)分 泌誘導因子，誘導細胞分泌的誘導因子透過微膠囊膜作用于微膠囊外部的干細胞，誘導干 細胞向目的細胞類型或三維組織定向分化；微膠囊對干細胞和誘導細胞進行了免疫隔離， 利于回收目的細胞。與微膠囊共培養(yǎng)的干細胞的培養(yǎng)方式為常規(guī)二維生長方式、或在生物支架材料中 的三維生長方式。所述干細胞為多來源干細胞，包括胚胎干細胞或成體干細胞。所述誘導細胞為多來源體細胞、轉(zhuǎn)基因細胞或細胞株；其中，多來源體細胞是指從 動物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細胞；轉(zhuǎn)基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法 或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標志物的克隆化細胞群。所述誘導細胞和干細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞。所述共培養(yǎng)方式為靜態(tài)共培養(yǎng)或于生物反應器中的動態(tài)共培養(yǎng)。所述干細胞定向誘導分化后可為目的細胞或三維組織，目的細胞是指單細胞，三 維組織是指由細胞、三維支架所形成的三維組織。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.操作簡單，實現(xiàn)干細胞體外定向誘導分化。本發(fā)明利用微囊化誘導細胞分泌的 生長因子促進微膠囊外部的干細胞體外定向分化，干細胞與誘導細胞被免疫隔離，不直接 接觸，有利于目的細胞的分離和應用。2.生物微膠囊所提供的特殊生長環(huán)境，能夠?qū)崿F(xiàn)誘導細胞體外高密度三維生長， 有利于誘導細胞保持其功能，持續(xù)分泌生長因子作用于外部的干細胞。3.生物微膠囊能夠?qū)⒏杉毎驼T導細胞進行免疫隔離，避免了兩者的免疫反應， 可以使用一種或多種異體、異源的誘導細胞(體細胞、轉(zhuǎn)基因細胞以及細胞株)進行誘導， 且共培養(yǎng)結(jié)束后微囊化誘導細胞可以被去除，從而與目的細胞徹底分離，更好地保證了臨 床應用的安全性。4.由于生物微膠囊體積小，密度低，表面積大，容易懸浮，可在生物反應器中實現(xiàn) 三維動態(tài)共培養(yǎng)模式，利于規(guī)模化放大。5.應用范圍廣。由于微膠囊的免疫隔離特性，本發(fā)明方法可使用多來源異體、異種 的誘導細胞(體細胞、轉(zhuǎn)基因細胞以及細胞株)進行誘導；可促進多來源干細胞體外定向分 化，分化的目的細胞類型可包括成骨、心肌、神經(jīng)、軟骨、肝等，進一步加速受損組織的修復 和治療，擴大了其臨床應用前景。總之，本發(fā)明能夠誘導干細胞體外定向分化為特定細胞類型或三維組織，同時能 夠徹底分離開干細胞和誘導細胞。生物微膠囊能夠良好地保持誘導細胞的功能和活性，其 免疫隔離特性使得可使用多來源異體、異種的誘導細胞，其可懸浮的特性也適于在生物反 應器等動態(tài)條件下進行誘導。由于具備以上優(yōu)點，使得該實驗方法在受損組織的臨床治療 研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1為非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化示意圖，包括干細胞二維生長方式 (A)和在支架材料中的三維生長方式(B)；圖2為微囊化BMP-2基因轉(zhuǎn)染的CHO細胞和SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)第 14天時，共培養(yǎng)組(A)和對照組(B)堿性磷酸酶ALP染色結(jié)果，共培養(yǎng)組ALP呈強陽性，對 照組則為弱陽性；圖3為微囊化BMP-2轉(zhuǎn)基因細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)的第0、7、10、15天 時，相同數(shù)量的共培養(yǎng)組的被誘導細胞、對照組的骨髓間充質(zhì)干細胞及第3代成骨細胞胞 漿內(nèi)ALP酶活性定量檢測結(jié)果，共培養(yǎng)過程中共培養(yǎng)組ALP酶活性逐漸接近于成骨細胞，并 明顯高于對照組；圖4為微囊化BMP-2轉(zhuǎn)基因細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)第沈天時，共培養(yǎng)組(A)和對照組(B)鈣化結(jié)節(jié)(Von Kossa)染色結(jié)果，共培養(yǎng)組出現(xiàn)了鈣沉積，對照組則不明 顯；圖2、3、4的實驗結(jié)果說明微囊化BMP-2轉(zhuǎn)基因細胞能夠誘導骨髓間充質(zhì)干細胞體 外定向分化為成骨細胞。圖5為微囊化人心肌細胞株HCM和小鼠胚胎干細胞共培養(yǎng)15天時，心肌蛋白 Troponin T(A)和desmin )的免疫組化結(jié)果，心肌蛋白表達為陽性，說明在微囊化HCM細 胞的誘導下胚胎干細胞已經(jīng)體外定向分化為心肌細胞。圖6為在旋轉(zhuǎn)反應器中動態(tài)共培養(yǎng)20天時，支架材料中細胞的βΙΙΙ-tubulin和 Hoechst33342免疫熒光染色結(jié)果，β ΙΙΙ-tubulin染色為陽性，說明在微囊化SD大鼠嗅鞘 細胞的誘導下SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)體外定向分化為嗅鞘細胞，并具有良好的三 維組織結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式實施例1 非接觸共培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向分化為成骨細胞用靜電液滴法制備包埋有BMP-2基因轉(zhuǎn)染的CHO細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸微 膠囊。將制備好的微膠囊加入到細胞培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(見文獻Optimization of the Seeding Density in MicroencapsulatedRecombinant CHO Cell Culture. Ying Zhang, Jing Zhou, Xulang Zhang, Weiting Yu, Xin Guo, Wei Wang, Xiaojun Ma. Chemical and BiochemicalEngineering Quarterly, 2008, 22 (1) :105-111)，每3 天定期更換培養(yǎng)液。將微囊化BMP-2轉(zhuǎn)基因細胞與1 X 104cells/cm2的密度接種的二維貼壁培養(yǎng)的骨 髓間充質(zhì)干細胞按上述培養(yǎng)條件共培養(yǎng)，將單獨培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞作為對照組，除 培養(yǎng)體系無微囊化BMP-2轉(zhuǎn)基因細胞外其它條件與共培養(yǎng)組相同。在共培養(yǎng)的第0、7、10、 15天，將共培養(yǎng)組的被誘導細胞、對照組干細胞以及成骨細胞分別進行ALP酶活性的定量 檢測；在共培養(yǎng)的第14天，將共培養(yǎng)組和對照組的貼壁細胞進行堿性磷酸酶ALP定性染色； 在共培養(yǎng)的第26天將共培養(yǎng)組和對照組的貼壁細胞進行鈣化結(jié)節(jié)(VonKossa)染色。實驗 結(jié)果見圖2-4。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中的骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)向成骨細胞分化，與對照組 有顯著性差異。實施例2 非接觸共培養(yǎng)誘導胚胎干細胞體外定向分化為心肌細胞用氣流噴射法制備包埋有人心肌細胞株HCM的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。將制備 好的微膠囊加入到細胞培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天定期更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件同實 施例1。將微囊化HCM細胞與lX104CellS/Cm2的密度接種的二維貼壁培養(yǎng)的小鼠胚胎干 細胞共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的第15天將共培養(yǎng)體系中的貼壁細胞進行心肌蛋白Troponin T和 desmin的免疫組化染色。實驗結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中的小鼠胚胎干細胞已經(jīng) 向心肌細胞分化，與對照組有顯著性差異。實施例3 生物反應器中非接觸共培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向分化為三 維神經(jīng)組織用靜電液滴法制備包埋有SD大鼠嗅鞘細胞的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。將制備 好的微膠囊加入到嗅鞘細胞培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天定期更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件同實施例1。將微囊化嗅鞘細胞與2X 106CellS/Cm3的密度接種的生長在三維殼聚糖支架中的 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共同接種到旋轉(zhuǎn)式生物反應器中進行動態(tài)共培養(yǎng)，在動態(tài)共培養(yǎng) 的第20天，對支架材料中的細胞進行i3III-tubulin/H0echSt33342免疫熒光檢測。實驗 結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中的骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)向嗅鞘細胞分化，與對照組有 顯著性差異。本發(fā)明操作簡單，允許使用一種或多種異體、異種的誘導細胞促進干細胞體外定 向分化，即微膠囊膜可以使誘導細胞分泌的誘導因子透過微膠囊作用于外部的干細胞，同 時又能將誘導細胞和干細胞進行免疫隔離，不直接接觸，有利于不同細胞的分離和收獲。本 發(fā)明不但在常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)下能實現(xiàn)干細胞體外的定向誘導分化，還可以為生物反應器中動 態(tài)誘導干細胞定向分化為三維組織提供有效的誘導方法，在受損組織的臨床治療研究中將 發(fā)揮重要作用。
權(quán)利要求
1.一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，其特征在于將具有誘導分化 功能的誘導細胞包埋在生物微膠囊中，將該微膠囊再與干細胞進行共培養(yǎng)，通過微膠囊內(nèi) 誘導細胞的定向誘導作用，實現(xiàn)干細胞的定向誘導分化(圖1)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于與微膠囊共培養(yǎng)的干細胞的培養(yǎng)方式為 常規(guī)二維生長方式、或在生物支架材料中的三維生長方式。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述干細胞為多來源干細胞，包括胚胎干 細胞或成體干細胞。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述誘導細胞為多來源體細胞、轉(zhuǎn)基因細 胞或細胞株；其中，多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成 熟的細胞；轉(zhuǎn)基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特 定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質(zhì)或標志物的克隆化細胞群。
5.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述誘導細胞和干細胞可以是同源 同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)方式為靜態(tài)共培養(yǎng)或于生物 反應器中的動態(tài)共培養(yǎng)。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述干細胞定向誘導分化后可為目的細 胞或三維組織，目的細胞是指單細胞，三維組織是指由細胞、三維支架所形成的三維組織。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物微膠囊為海藻酸鈉/聚賴氨酸 微膠囊或海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細胞組織工程領(lǐng)域，是一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，將具有誘導分化功能的誘導細胞包埋在生物微膠囊中，該微膠囊再與干細胞進行共培養(yǎng)，通過微膠囊內(nèi)誘導細胞的定向誘導作用，實現(xiàn)干細胞定向誘導分化。本發(fā)明操作簡單，允許使用一種或多種異體、異種的誘導細胞促進干細胞體外定向分化，即微膠囊膜可以使誘導細胞分泌的誘導因子透過微膠囊作用于外部的干細胞，同時又能將誘導細胞和干細胞進行免疫隔離，不直接接觸，有利于不同細胞的分離和收獲。本發(fā)明不但在常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)下能實現(xiàn)干細胞體外的定向誘導分化，還可以為生物反應器中動態(tài)誘導干細胞定向分化為三維組織提供有效的誘導方法，在受損組織的臨床治療研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N5/077GK102102090SQ20091024845
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者于煒婷, 劉洋, 王為, 馬小軍 申請人:中國科學院大連化學物理研究所