專利名稱：一種樺褐孔菌及從樺褐孔菌中提取三萜類物質(zhì)的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地涉及一種樺褐孔菌及從樺褐孔菌中提取三萜類 物質(zhì)的方法。本發(fā)明所稱的樺褐孔菌命名為樺褐孔菌(Inonqqus obliquusLNUF008)，已于 2009年11月24日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCC M 209280。
背景技術：
樺褐孔菌Inonqqus obliquus，國內(nèi)還稱為樺癌褐孔菌、斜生纖孔菌。屬擔子菌亞 門、層菌綱、非褶菌目、刺革菌科。樺褐孔菌的形態(tài)它的子實體呈現(xiàn)腫瘤狀(不育性的塊狀物)，直徑25 40cm，深 色，表面深裂，很硬，時脆。孢子闊橢圓狀至卵狀，光滑，有剛毛。菌絲為二系菌絲系統(tǒng)，具有 生殖菌絲和骨架菌絲。氣生菌絲多為骨架菌絲，黃褐色，具有剛毛狀菌絲和稀少剛毛；基內(nèi) 菌絲多為生殖菌絲，淡黃褐色，有隔，無鎖狀聯(lián)合。樺褐孔菌在俄羅斯、波蘭、芬蘭等地是一種應用很廣泛的藥用真菌，英文名chaga。 1955年，chaga被俄羅斯醫(yī)學研究院用來治療腫瘤，特別是消化系統(tǒng)和肺部腫瘤。16世紀 至今，東歐一些國家的民間就是用這種菌的菌核來防治癌癥。西伯利亞的Khhanty人用這 種真菌來預防和治療心臟病、肝病、胃病和食道疾病等。近期研究表明，樺褐孔菌能抑制艾 滋病等病毒(HIV-I)，抗輻射、并通過抑制蛋白質(zhì)生物合成、抗有絲分裂及消除自由基活性 等作用機制來抑制或延緩腫瘤細胞的生長和防治0-157大腸桿菌中毒。但是，目前樺褐孔菌的使用主要以野生為主。野生的樺褐孔菌主要生長在俄羅斯 的西伯利亞地區(qū)、日本北海道、芬蘭等地。在我國吉林長白上地區(qū)和黑龍江大小興安嶺地區(qū) 有野生樺褐孔菌生長。而采用野生直接使用，其有效成分利用率低。三萜類物質(zhì)在醫(yī)學上 具有很高的應用價值，現(xiàn)有從樺褐孔菌中提取三萜類物質(zhì)，提取率較低。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種樺褐孔菌(Inonqqusobliquus LNUF008)，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCC M209280。以下簡稱樺褐孔菌 LNUF008。采用此菌，三萜類物質(zhì)的提取率高。本發(fā)明的另一目的是提供一種從樺褐孔菌中提取三萜類物質(zhì)的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種樺褐孔菌，其特征在于樺褐 孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，2009年11月24日于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 編號為 CCTCC M 209280。本發(fā)明提供的樺褐孔菌LNUF008的篩選方法為自長白山野生林區(qū)采摘新鮮的樺褐孔菌子實體(直徑22. 5cm)，在無菌間內(nèi)分離 菌絲體。首先，從子實體上剜下直徑5cm的塊，以75%的酒精表面消毒lOmin，用無菌水沖 洗5 6次，0. 1 %的氯化汞表面消毒1 2min，用無菌水沖洗。用無菌刀將子實體塊劈開，用無菌剪從中心菌肉處剜取直徑0. 5cm小塊，移至平皿培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)5天。待長出菌落后，將菌落挑入斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天，至斜面長滿，得菌株LNUF008，將斜面于4 °C冰箱保存。菌株LNUF008的鑒定如下A.菌絲體外部形態(tài)觀察結(jié)果將斜面中菌絲體接種至固體培養(yǎng)基平皿中央，28°C恒溫培養(yǎng)10天，肉眼逐日觀察 菌絲體外觀形態(tài)變化。培養(yǎng)3天后，平皿中央菌塊周圍有白色絨狀菌絲出現(xiàn)；培養(yǎng)5天后， 菌落不斷擴展，菌絲白色但逐漸加粗；培養(yǎng)7天后，菌落擴展到平皿1/2，菌絲體逐漸匍匐 于培養(yǎng)基上，由白色逐漸變黃；培養(yǎng)10天后，菌落繼續(xù)擴展，菌絲體由黃色向棕色轉(zhuǎn)變，并 有模糊的環(huán)紋出現(xiàn)，菌落表面有菌孔，并出現(xiàn)黃褐色液珠，如

圖1。從表面形態(tài)觀察，此菌株 LNUF008與樺褐孔菌極為相似。B.菌絲體顯微結(jié)構觀察利用載玻片培養(yǎng)觀察法對菌株LNUF008菌絲體進行觀察。菌絲為二系菌絲系統(tǒng)， 具有生殖菌絲和骨架菌絲。氣生菌絲多為骨架菌絲，初為白色，寬2. 5 4. 0 μ m，具有剛毛 狀菌絲；基內(nèi)菌絲體多為生殖菌絲，淡黃褐色，寬3.0 5.0 μ m，有隔，無鎖狀聯(lián)合，如圖1。C.菌株LNUF008的測序及進化樹的制作菌絲體的DNA提取取0. Ig菌株LNUF008的菌絲體，在1. 5mL的Eppendorf管中 用研杵充分研磨后加入600 μ L 2XCTAB提取緩沖液(EDTA20mmol/L，Tris-HCl 1 OOmmo 1/ L，pH 8.0,NaCl 0. 7mol/L，CTAB 20g/L)，65°C水浴放置30min。加入等體積氯仿、異戊醇混 合液(V V = 24 1)充分搖勻，4°C下10，000r/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液至新的1. 5mL 的離心管中，加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇(V V V = 25 24 1)。本步驟需重復 多次，直至處于中間的蛋白質(zhì)相消失為止。移取上清液至一新的Eppendorf管中，加入10% 體積的3mol/L NaAc溶液(pH 6. 0)以及2. 5倍體積的冰凍乙醇，4°C下10，000r/min離心 5min，沉淀用 70%的酒精洗 2 3 次。晾干，加 TE(含 l(kimol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA PH 8.0)緩沖液，充分溶解后在_20°C下保存?zhèn)溆?。測得的菌株LNUF008的ITS序列如下所示TCGAGGGGCCTGTGCTGGCACGGAAACGTTTGCATGTGCACGGCCTTTCGTGCTCAAATCCAACTCTCA AACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTAATCGAACGGCAAGTCAAGTACGTCGAGTAAT CMGTACGAGGGTTTCGGGCCTTGGAAAGTGTGAAAGATGGAAAGGCAAGCTTCAGAGACAAGGAGACGAAAAGCTT TTGGCTTCATTACAAACACCAATATAATTGTTATGTGAATGAAATGCTCCTTGTGGGCGATAATAAATACAACTTTC AACAACGGATCTCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTAAT CTCAAATCGCTCGTCTATTCTTAATTGAAGTGGCTTTCGATTTGGACTTGGAGGTTTTGCTGGCCCGGGCGACTTTG GTTGCCCTTGGTTTGTCGGCTCCTCTCAAATACATTAGCTGGACTTTGGTTCGCGTTTACGGTGTAATAATGTAATG TTCACCAAGACGCTTGCCTAACAAGTCTGCTTCTAATAGTCCTTAAGTTGGACAAGGATCCCTTCGTTGGGCCTTCT T以上為PCR擴增后產(chǎn)物的測序結(jié)果，其全長為686個bp將測得的菌株LNUF008的ITS序列在GenBank序列庫中做BLAST比對。結(jié)果顯示， 本實驗鑒定菌株 LNUF008 與 Inonotus Obliquus DQ103883 及 Basidiomycete sp FJ190414相似度為100%。在GenBank中搜索具有與之相似的序列的16株菌株如下
權利要求
一種樺褐孔菌，其特征在于樺褐孔菌(Inonqqus obliquusLNUF008)，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCC M 209280。
2.一種從權利要求1所述的樺褐孔菌中提取三萜類物質(zhì)的方法，其特征在于步驟如下1)將權利要求1所述的樺褐孔菌(Inonqqusobliquus LNUF008)活化，制備種子液；2)發(fā)酵液制備種子液以發(fā)酵液體積2%的接種量接到發(fā)酵罐液體綜合培養(yǎng)基中，發(fā) 酵溫度為26 30°C，發(fā)酵時間為70 74小時，pH為6. 8 7. 2，通氣量為0. 5 1. 0立 方米/小時，轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分鐘，罐壓為0. 1 0. 2兆帕；3)提取將發(fā)酵液抽濾，45°C干燥，抽濾出菌絲體，將菌絲體倒入研缽中，研磨成粉末 狀，加入8 12倍體積的有機溶劑，浸泡24小時；于50°C，77KHz下超聲破碎50 70分 鐘；然后將混合液于5000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清液，減壓濃縮， 得目標產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樺褐孔菌及從樺褐孔菌中提取三萜類物質(zhì)的方法。采用的技術方案是樺褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，CCTCC M209280。利用此樺褐孔菌提取三萜類物質(zhì)的方法如下經(jīng)活化，制備種子液；以發(fā)酵液體積2％的接種量接到發(fā)酵罐液體綜合培養(yǎng)基中，發(fā)酵，將發(fā)酵液抽濾，45℃干燥，抽濾出菌絲體，將菌絲體倒入研缽研磨成粉末狀，加入10倍體積的有機溶劑，浸泡24小時；于50℃，77KHz下超聲破碎60分鐘；于5000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清液，減壓濃縮，得目標產(chǎn)物。本發(fā)明提取的三萜類物質(zhì)含量高，回收率高，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了可行性。
文檔編號C12P15/00GK101933460SQ20091024861
公開日2011年1月5日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權日2009年12月22日
發(fā)明者劉宏生, 宋雅娜, 朱俊豐, 朱春玉, 艾海新, 鄭方亮, 郭立雄 申請人:遼寧大學