專利名稱：：Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬生物
技術領域：
，具體是一種Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)樣品mRNA得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術，精確定量檢測標本中人Ki67mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
：惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是臨床治療的一大難題，也是惡性腫瘤致死的一個重要原因。能否及早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移并作出診斷，對腫瘤患者的預后判斷、治療方案制定、生存率提高，以及醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展均有重要的意義。目前，腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠影像學(如X光片、CT、磁共振、PET等)和病理學檢查。但影像學檢査發(fā)現(xiàn)的病灶，通常要達到一定大小才能夠被儀器分辨，且無法定性。而通過病理形態(tài)判斷細胞惡變與否，則一定要取到合適的檢測標本，且要具有相當數(shù)量的可觀察到的腫瘤細胞存在。因此，影像學和病理學檢査均難以在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期實現(xiàn)準確診斷。研究表明，血行轉(zhuǎn)移是腫瘤擴散的主要途徑之一，因此在患者外周血中進行腫瘤細胞的基因表達檢測是了解腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法。但是腫瘤轉(zhuǎn)移早期，血液中的腫瘤細胞數(shù)量極少，因此外周血中微量腫瘤細胞檢測，必須滿足高靈敏度的檢測方法和特異性的腫瘤生物學標記2個條件，才能從血液大量的細胞中檢測到極其微量的腫瘤細胞，從而達到早期診斷目的。'1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(PCR)。由于該項技術具有簡便快速、特異性和靈敏度高、重復性好等突出優(yōu)點，因此被廣泛應用于基礎研究和臨床診斷。1991年Smith等首次應用PCR技術檢測到血循環(huán)中存在轉(zhuǎn)移的癌細胞，其后PCR技術被廣泛用于微轉(zhuǎn)移研究。近年來，RT-PCR法已被用于淋巴結(jié)、.血液中微量癌細胞特殊mRNA檢測，并顯示出較高的靈敏性，是目前微轉(zhuǎn)移檢測有效的方法之一。使用較多的還有巢式PCR(nest-PCR)，它是使用兩套以上的引物進行擴增，目的在于增高DNA的特異性。應用巢式PCR檢測技術已能夠在外周血、淋巴結(jié)或骨髓中早期測定出數(shù)量很少的循環(huán)癌細胞。但是這些傳統(tǒng)PCR技術在應用中存在著不能對腫瘤細胞特殊mRNA進行準確定量，以及操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，因此不能夠滿足實際工作需要，使其應用受到限制。隨著Taqman實時熒光定量PCR技術的出現(xiàn)，人們可以真正做到對PCR樣本中微量mRNA的精確定量，而且由于特異性熒光探針雜交技術的應用，使得被檢測基因的特異性大大提高。Taqman實時熒光定量RT-PCR技術是1996年美國PE公司發(fā)明的一種高靈敏度PCR試驗方法。其技術原理是在PCR的反應體系中加入一條帶有雙熒光標記的探針，該探針能與模板核酸發(fā)生特異性雜交。探針的5'端標記熒光報告基團FAM(6-羧基熒光素，熒光發(fā)射值在518nm處)，3'端標記熒^;淬滅基團TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明，熒光發(fā)射值在582nm處)。探針結(jié)構(gòu)完整時，.5'端FAM所發(fā)出的熒光被3'端TAMRA所吸收，不出現(xiàn)熒光信號的變化。隨著PCR反應的進行，當合成的新鏈移動到探針結(jié)合的位置時，Taq聚合酶將探針切斷，探針的完整性遭到破壞，3'端的淬滅作用被解除，5'端的FAM熒光信號被釋放出來。PCR每復制一個核苷酸片段，就有一個探針被切斷，同時一個熒光信號被釋放出來，產(chǎn)物與熒光信號產(chǎn)生一對一的對應關系。隨著產(chǎn)物的增加，熒光信號亦隨之增強，當信號增強到某一閾值時(根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均標準差，計算出99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值)，此時的循環(huán)次數(shù)即循環(huán)閾值Ct(cyclethreshold,Ct)被記錄下來。該循環(huán)參數(shù)Ct和PCR體系中起始模板數(shù)的對數(shù)之間有嚴格的線性關系。利用不同梯度的陽性定量標準模板擴增的Ct值和該陽性定量標準的模板數(shù)經(jīng)過對數(shù)擬合制成標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就可以準確的確定起始模板的數(shù)量，因此根據(jù)PCR產(chǎn)物的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。實時熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高、定量準確、操作安全等優(yōu)點，使用該方法擴增腫瘤組織特異性mRNA來檢測微轉(zhuǎn)移，是一種高靈敏度、高特異性、操作簡便的方法，現(xiàn)已在檢測外周血微量腫瘤紳胞中嘗試。Ki67基因是一細胞增殖基因，編碼細胞增殖必需的DNA結(jié)合蛋白，Ki67蛋白是目前臨床病理使用最廣泛的腫瘤增殖病理標志。Ki67蛋白在幾乎所有的腫瘤中高表達，而在肝、腎、腦、心肌、胃腸、外周血單核細胞及淋巴細胞等正常細胞中不表達。因此檢測腫瘤患者外周血、淋巴結(jié)、骨髓標本中有無Ki67mRNA表達，可以診斷腫瘤有無轉(zhuǎn)移。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，用于腫瘤增殖相關基因Ki67mRNA的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應RT-PCR檢測。本發(fā)明是以如下技術方案實現(xiàn)的試劑盒含有逆轉(zhuǎn)錄RT反應液、莫洛尼氏鼠白血病病毒M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑Rnasin、聚合酶鏈PCR反應液、耐熱DNA聚合酶Taq、標準品、陰性對照和陽性對照。其中RT反應液中含有寡聚(dT)15.18、dNTPs、DEPC-H20。其中PCR反應液中含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、擴增用上游引物、擴增用下游引物、檢測用熒光探針。擴增用上游引物序列為5，-GGGAAAGTAGGTGTOAAAGAAGAG-3，。擴增用下游引物序列為5'-ATCTGCTTTGGAGACTCCTTAAAC-3，。檢測用熒光探針序列為5'-FAM-CCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGG-TAMRA-3，。標準品序列為GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAGCTCCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGGACGTCAGGGGAGACCACGCACACGCACAG.AGAGCCAGCAGGAGATGGCAAGAGCATCAGAACGTTTAAGGAGTCTCCAAAGCAGAT對照品分陰性對照和陽性對照，其中陰性對照為無Ki67mRNA的RNA樣品，陽性對照為含有Ki67mRNA的RNA樣品。本試齊l」盒應保存于-20。C，盡量減少反復凍融。本發(fā)明的有益效果是建立了利用Taqman技術檢測Ki67mRNA的方法。由于本方法采用了PCR擴增技術，使得檢測Ki67mRNA的敏感性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息。由于熒光探針的應用，使得檢測的特異性大大提高，能有效降低常規(guī)PCR擴增的假陽性率。本方法所設計的引物、探針以及檢査結(jié)果，可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。圖1為RNA總提取結(jié)果圖2為Ki67的PCR擴增結(jié)果圖3為Ki67重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果圖4為Ki67測序結(jié)果'圖5為實時熒光定量RT-PCR擴增動力曲線圖6為實時熒光定量RT-PCR標準曲線具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。但應明確，本文上述說明以及下述實施例僅是用作舉例說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實施例1Ki67mRNA熒光定量PCR檢測標準品的制備1引物與探針的設計和合成擬擴增的Ki67基因標準品序列為Ki67基因第13外顯子區(qū)3470-3606堿基。以Ki67全長cDNA序列(GenBank登錄號NM002417)為模板設計引物和探針。標準品PCR上游引物序列為5'-GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAG-3',下游引物序列為5'-ATCTGCTTTGGAGACTCCTTAAAC-3，，均由上海Invi加gen公司合成。探針序列為5，-FAM-CCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGG-TAMRA-3，，探針5，端標記熒光報告基團FAM(6-carboxy-fluorescein，美國ABI公司)，3，端標記熒光淬滅基團TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine，美國ABI公司)。2細胞與細胞培養(yǎng)膀胱癌細胞(Biu-87)、腎癌細胞(Ketr-3)，購自中國科學院上海細胞庫。Biu-87細胞、Ketr-3細胞均在5%0)2和37'C的條件下，在含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基中貼壁生長。細胞融合度達90%左右時用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的胰酶消化液消化后傳代。3RT-PCR收集細胞提取總RNA(見圖1)，取1.5ulRNA，用RT-PCR試劑盒(AccessRT-PCRSystem,美國Promega公司)，以25ul總反應體積進行逆轉(zhuǎn)錄。反應條件48°C45分鐘逆轉(zhuǎn)錄，94'C5分鐘變性，94°C30秒、55'C30秒、72°C1分鐘進行28個循環(huán)擴增，最后于72'C延伸7分鐘后置4'C。PCR反應結(jié)束后，取PCR反應產(chǎn)物10jil，加入上樣緩沖液2nl，充分混勻后在2.0%瓊脂糖凝膠電泳槽齒孔中，50v恒壓電泳40min，在紫外線下觀察，可看到與目的片段大小一致的約137bp的電泳條帶(見圖2)。4純化目的片段并插入T載體PCR產(chǎn)物的純化使用美國Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(WizardSVGelandPCRClean-UpSystem),操作步驟按說明書進行。將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-TEasyVector在T4DNALigase作用下4'C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，涂LB平板(含氨芐青霉素)，37C倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板中單克隆菌落放入5mlLB培養(yǎng)基中，搖菌10小時；使用美國Promega公司小量質(zhì)粒提取試劑盒(WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem)進行質(zhì)粒小量提取，操作步驟按說明書進行，獲得重組質(zhì)粒DNA，一20'C保存。5鑒定并測序取2^d質(zhì)粒作為模板行PCR，其反應條件同前；PCR產(chǎn)物行2n/。的瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶，可見與目的片段大小一致的約137bp的電泳條帶，見圖3;正確的送上海英駿(Invitrogen)公司測序，見圖4。測序結(jié)果證明與Genbank中查找的基因序列完全一致，同源性為100%，證明序列克隆正確。說明目的基因己被克隆入T載體中，該重組質(zhì)?？捎米鳠晒舛縋CR的陽性定量標準模板。6質(zhì)粒OD值測定吸取提取的質(zhì)粒原液2^U，加入58pl雙蒸水做30倍稀釋，放入紫外分光光度計中檢測。將檢測的質(zhì)粒濃度(^g/jil)根據(jù)下面的公式換算成copies爾l。用無核酶水將質(zhì)粒分別稀釋成107copies4d、106copies/nl、105copies4U、104copies/pl、103copies/nl、102copies4il、lOkopies/W不同濃度，放入紫外分光光度計中檢測，檢測結(jié)果見表1。表1中的OD260/OD280比值均在1.7-2.0之間，說明所得的質(zhì)粒DNA純度較好，可以下一步使用。質(zhì)粒濃度計算公式拷貝數(shù)(copies/pl)=(6.023X1023[copies/mol]x濃度[g/pl])/MW[g/mol]MW(分子量)-堿基數(shù)目[bp]x660dalton/bp(雙鏈DNA)_表l質(zhì)粒濃度測定結(jié)果_pGEM-T-Ki67質(zhì)粒測定次數(shù)-_濃度(嗎/nl)_OD26q/OD28q比值第一次0.00521.93第二次0.00521.95第三次0.00521.96實施例2Ki67mRNA熒光定量PCR檢測標準曲線的建立為了得到Ki67mRNA絕對定量值，本發(fā)明中實時熒光定量PCR檢測采用外標準曲線定量的方法，將克隆的陽性標準模板按107、106、105、104、103、102、1(^copies/ul梯度稀釋，加于不同的反應管中。反應體系如下PCRMasterMix10plAssayMix(含引物和探針)cDNAdilutedinRNase-freewater9^1總體積20nl反應條件如下95°ClOmin1cycle9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>反應結(jié)束后在計算機上得到定量PCR擴增動力曲線(見圖5)及定量標準曲線(見圖6)，可見各梯度之間間隔的Ct值相等，并在一條直線上，標準曲線的斜率為-3.2233(Ki67)，與理想斜率-3.322(-l/lg2)非常接近，相關系數(shù)為0.9979，提示誤差較小，可信度較高。實施例3Ki67mRNA熒光定量PCR檢測的方法學評價為了檢測Ki67mRNA熒光定量PCR方法的可重復性和靈敏度，本發(fā)明采用重復性實驗和靈敏度實驗進行評價。1重復性試驗1.1批間重復試驗分別用106、104、102copies^l的質(zhì)粒標準品在不同批次PCR反應中進行擴增，觀察其Ct值變化程度，用變異系數(shù)(CV)來表示，是反映PCR重復性指標之一(將同一濃度的質(zhì)粒樣本在不同時間重復測定5次)，結(jié)果見表2.表2批間重復試驗結(jié)果pGEM-T-Ki67質(zhì)粒濃度(copies/nl)3f±sCV10621.78±1.135.19%10427.80±1.665.970/010232.61±1.845.64o/o1.2批內(nèi)重復試驗分別用106、104、102copies/ul的質(zhì)粒標準品在同一次PCR反應中進行擴增，觀察其Ct值變化程度，用變異系數(shù)(CV)來表示，是反映PCR重復性指標之一(將同一份質(zhì)粒樣本平行測定5次)，結(jié)果見表3._表3批內(nèi)重復試驗結(jié)果_.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>10。21.53±0.793.670/o10427.42±0.792.88%10232.93±1.033.950/o表2和表3的結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間CV值均在10%以下，提示該方法的重復性好。''2靈敏度試驗2.1將質(zhì)粒稀釋成104、103、102、IO1、5、10Gcopies/ul濃度進行熒光定量PCR檢測，根據(jù)不同濃度的標本檢出率得出其靈敏度，檢測結(jié)果見表4。表4.不同濃度質(zhì)粒的檢測值質(zhì)粒濃度pGEM-T-Ki67(個/ml)質(zhì)粒起始拷貝數(shù)(copies).1041.52X1041031.39X1031021.26X1021010.95X1015個6.97X10Q10°未檢出2.2將含有104、103、102、101、5個/ml腎癌Ketr3細胞株的混合細胞懸液以及健康人單個核細胞懸液進行熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果如表5表5.'含不同濃度的Ketr3細胞株的混合細胞懸液Ki67mRNA表達細胞濃度Ki67mRNA(個/ml)起始拷貝數(shù)(copies)1041.7X1051032.1X1041021.1X1031012.8X1025個2.4X10正常健康人單個核細胞未檢出表4和表5的結(jié)果顯示，檢測靈敏度為5copies/ul，檢測下限為5個細胞/ml，提示該方法靈敏度高。Ki67序列表.txt人Ki67基因啟動子序列表SEQUENCELISTING<110〉鄭駿年顧峰裴冬生馬萍陳菲菲底潔卉張寶福徐為李望<120>Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒<130〉<160>4<210〉1<211>137<212>腿<213>人(human)<400>GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAGCTCCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACG60GACGTCAGGGGAGACCACGCACACGCACAGAGAGCCAGCAGGAGATGGCA120AGAGCATCAGAACGTTTAAGGAGTCTCCAAAGCAGAT137<210>2<211>25<212〉DNA<213>熒光探針<400>CCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGG25<210>3<211>24<212>腿<2I3〉引物<柳>GGGAAAGTAGGTGTG織GAAGAG24<210>4<211>24<212>DNA<213〉引物.〈400〉ATCTGCTTTGGAGACTCCTTAAAC241權利要求1.一種Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是含有逆轉(zhuǎn)錄RT反應液、莫洛尼氏鼠白血病病毒M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑Rnasin、聚合酶鏈PCR反應液、耐熱DNA聚合酶Taq、標準品、陰性對照和陽性對照。2.如權利要求1所述的.Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是逆轉(zhuǎn)錄反應液中含有寡聚dT&^、dNTPs、DEPC-H20。3.如權利要求1所述的Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是聚合酶鏈反應液中含有聚合酶鏈反應緩沖液、MgCl2、dNTPs、.擴增Ki67cDNA所用上游引物、下游引物、熒光探針。4.如權利要求3所述的Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是擴增用上游弓I物序列為5'-GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAG-3,;擴增用下游引物序列為5'-ATCTGCTTTGGAGACTCCTTAAAC-3'。5.如權利要求3所述的Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是所擴增的Ki67基因序列位于Ki67基因的保守區(qū)域2799-12684堿基的第3470-3606堿基，該序列位于Ki67基因第13外顯子區(qū)。6.如權利要求3所述的實時熒光定量RT-PCR檢測Ki67mRNA試劑盒，其特征是探針為熒光探針，其序列為5'-FAM-CCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGG-TAMRA-3'。7.如權利要求1所述的實時熒光定量RT-PCR檢測Ki67mRNA試劑盒，其特征是標準品序列為GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAGCTCCTAGCAGTCGGCAAGTTCACACGGACGTCAGGGGAGACCACGCACACGCACAGAGAGCCAGCAGGAGATGGCAAGAGCATCAGAACGTTTAAGGAGTCTCCAAAGCAGAT8.如權利要求1所述的實時熒光定量RT-PCR檢測Ki67mRNA試劑盒，其特征是陰性對照為無Ki67mRNA的RNA樣品，陽性對照為含有Ki67mRNA的RNA樣品。9.如權利要求l所述的實時熒光定量RT-PCR檢測Ki67mRNA試劑盒，其特征是利用該試劑盒將待測標本所含的Ki67mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成K167cDNA;利用權利要求3所述的引物，擴增Ki67cDNA;利用權利要求3所述的熒光探針對Ki67cDNA進行定量檢測。10.如權利要求1所述的試劑盒，其特征是利用該試劑盒檢測腫瘤患者外周血、淋巴結(jié)、骨髓、手術切除組織、細胞株等標本中Ki67mRNA表達，用以輔助診斷、指導治療、提示預后及科學研究。全文摘要本發(fā)明公開了一種Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒；屬生物
技術領域：
。為一種檢測腫瘤增殖相關基因Ki67mRNA的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒。該試劑盒對樣品中存在的Ki67mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術，通過設計的特異性引物和探針精確定量檢測標本中Ki67mRNA的表達量。該試劑盒可以用于臨床檢測腫瘤患者外周血、淋巴結(jié)、骨髓、手術切除組織、細胞株等標本中Ki67mRNA表達。有益效果是采用了PCR擴增技術，使得檢測Ki67mRNA的敏感性大大提高，能保證在極少的標本中獲得足夠的信息。熒光探針的應用，使得檢測的特異性大大提高，能有效降低常規(guī)PCR擴增的假陽性率。文檔編號C12Q1/68GK101665834SQ20091018257公開日2010年3月10日申請日期2009年9月16日優(yōu)先權日2009年9月16日發(fā)明者底潔卉,張寶福,為徐,望李,裴冬生,鄭駿年,陳菲菲,峰顧,萍馬申請人:鄭駿年