專利名稱：提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法，屬于海洋生物功能 成分制備技術領域，用于研制開發(fā)醫(yī)藥保健品和功能食品的基料。
二背景技術：
藻膽蛋白是藻類藻膽體中的捕光色素蛋白，能把捕獲的光能高效的傳遞給葉綠 素，從而使海藻的光合作用得以發(fā)生。藻膽蛋白主要包括藻藍蛋白(Phycocyanin)、 藻紅蛋白(Phycoerythrim)和別藻藍蛋白(Allphycocyanin)三類，其中藻藍蛋白(PC) 和藻紅蛋白(PE)在藻體中的含量較為豐富。
藻膽蛋白是一種非常重要的光動力藥物的原料，特有的光敏效應可輔助激光治 癌，在病灶部位富集，吸收光后高效產(chǎn)生自由基和活潑態(tài)氧，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的 殺傷。有光毒性而沒有暗毒性，在人體內(nèi)代謝快。藻膽蛋白可作為功能因子用于保健 食品和功能食品及特殊飼料，同時還是理想的天然色素，可大量用于食品工業(yè)和化妝 品工業(yè)等，無毒副作用，是安全的添加劑。藻膽蛋白還具有抗氧化清除自由基和提高 免疫力的功效。其制作的免疫熒光標記抗體，檢測靈敏度遠遠高于傳統(tǒng)的熒光標記物， 可用于特殊分子定位和重要分子檢測，包括SARS病毒的免疫分子檢測，能準確地診 斷腫瘤、確定病變部位和病情輕重程度等。
我國海域?qū)拸V，藻類資源十分豐富，是世界上最大的紫菜生產(chǎn)大國，我國養(yǎng)殖和 加工又主要集中在江蘇沿海，其產(chǎn)量占全國的95%以上。紫菜的市場價格便宜，是紅 毛菜的1/10,小球藻和螺旋藻的1/3。紫菜中藻紅蛋白含量很高，如條斑紫菜所含粗 蛋白質(zhì)約40%,其中藻膽蛋白約占4%,其藻膽蛋白絕大部分為藻紅蛋白。選用紫菜 提取藻紅蛋白，具有成本低，得率高的優(yōu)點，極具研究價值。
藻紅蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，在天然使用色素方面有廣泛的應用前景，但其穩(wěn)定性及活性較低，且易沉淀。在實際應用中，許多因素影響著紫菜藻紅蛋白的穩(wěn)定性， 因此本發(fā)明用木瓜蛋白酶酶解的生物修飾方法來制備藻膽蛋白色基短肽。修飾后的這 些色基短肽既保留了原來鮮艷的顏色、豐富的營養(yǎng)等優(yōu)點，還克服了藻膽蛋白穩(wěn)定性 差的缺點。因此，蛋白酶解修飾是使其得到更合理、更充分利用的一種好方法。
與傳統(tǒng)的堿、酸物理修飾方法相比，生物修^飾的蛋白水解液中具有更多的營養(yǎng)成 分，研究己經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白經(jīng)酶解后，其水解產(chǎn)物的功能特性發(fā)生了極大的變化，顏色也 有較大的改變，這主要是因為大的蛋白分子被酶切成了大小不等的肽段和游離氨基 酸，改變了原有蛋白的特性，并且，經(jīng)過生物修飾后，蛋白的功能會變得更加和諧。 蛋白質(zhì)經(jīng)酶解作用生物修飾后，功能和品質(zhì)得到了進一步的提高，蛋白酶解產(chǎn)生的分 子量較小的肽可以被人體直接吸收，而且小肽比單個的氨基酸有著更好的消化吸收性 能，同時具有更優(yōu)越的營養(yǎng)和生理功效。
不同蛋白酶的選擇會極大的影響水解產(chǎn)物的理化功能特性，這主要是因為，不同 的蛋白酶酶解海洋蛋白后，由于酶切位點的位置及多少的不同，會造成酶解片斷分子 量大小的差異和氨基酸組成的變化。比如胰蛋白酶酶解位點較少，只有Arg和Lys 右側(cè)的肽鍵，所以用它作用蛋白資源后， 一般酶解的片斷都較大，而胃蛋白酶的酶解 位點為芳香族氨基酸、木瓜蛋白酶酶切位點在Arg、 Lys和Gly處的肽4定等，所以， 不同酶的選擇對生物修飾后的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)有較大影響。本發(fā)明選擇木瓜蛋白酶， 因藻紅蛋白中甘氨酸、賴氨酸及精氨酸的含量較高，經(jīng)木瓜蛋白酶生物修飾的位點較 多，生物功能性價值可得到明顯提高。
人體內(nèi)的&02可產(chǎn)生羥自由基，可攻擊核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及糖類等生物大分 子，*OH積累過量或生物體內(nèi)抗氧化防御體系削弱時，易損傷細胞及組織，引起機體 衰老或癌變引起細胞的氧化、衰老甚至死亡，人的衰老、血栓動脈硬化、癌癥、高血 脂等許多疾病都與之有密切關系。還原力是供電子能力的衡量標準，還原力強的樣品 為良好的電子供應者，其供應的電子可與自由基反應而清除自由基，還原力越強，抗 氧化性越強。所以還原力及鞋自由基清除能力是衡量樣品的重要指標，這兩種活性的提高令今后紫菜的深加工成為可能，并具有重要的意義。
該發(fā)明技術率先采用木瓜蛋白酶修飾紫菜藻紅蛋白的生物修飾方法，運用正交技 術確定了影響生物修飾關鍵因子的最佳修飾條件，經(jīng)生物修飾后的藻紅蛋白抗氧化能 力有大幅度的提高，具有較高的應用于化妝品、醫(yī)藥保健品、藥品等領域的價值。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題
本發(fā)明的目的是提供一種提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾方法。該方法成本低 廉，簡便，高效，得到的藻紅蛋白具有活性高，無毒、安全的特點，達到藥品級要求， 具有較高的應用于化妝品、醫(yī)藥保健品和檢測試劑等領域的價值。
技術方案
提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法，其特征在于
(1) 紫菜經(jīng)50倍體積的lmM， pH6.8的PBS緩沖液溶月長24 h,再用800瓦功率 超聲波作用1200秒進行細胞破碎，得到藻紅蛋白的粗提物，四層紗布過濾后，用飽 和度為20%~45%的硫酸銨沉淀、流水透析48h兩次，得純度為3.04的藥品級藻紅蛋 白(食品級A562/A280 > 0.7;藥品級A562/A28o〉2.0;試劑級A562/A280 〉 4.0 )。
即藻紅蛋白的粗提物用飽和度為20% ~45%的硫酸銨沉淀，5000 rpm, 20 min離 心，將沉淀溶于lmM， pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇 檢驗無白色沉淀，再次用飽和度為20%~45%的疏酸銨沉淀，5000rpm, 20min離心， 再將沉淀溶于lmM, pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢 驗無白色沉淀，透析后樣品冷凍干燥即獲得藥品級A562/A280 >2的藻紅蛋白。
(2) 將藻紅蛋白用lmM, pH6.8的PBS緩沖液溶解，使藻紅蛋白濃度達到 lmg/mL，加入木瓜蛋白酶對藻紅蛋白進行生物修飾，分別建立修飾時間、酶添加量、 緩沖液pH、修飾溫度四因素單因素實驗，并通過正交試驗確定修飾最佳條件。修飾 的條件為木瓜蛋白酶酶濃度15000~25000 p/g; pH6.5 7.5;修飾溫度50~60 。C; 修飾時間2h。將酶解液冷凍干燥后得到生物修飾后的藻紅蛋白。
5有益效果
本發(fā)明創(chuàng)立了提高紫菜藻紅蛋白抗氧化活性的方法，生物修飾后的藻膽蛋白在醫(yī) 藥和功能食品領域更具應用價值。
本發(fā)明采用超聲波細胞破碎、錄u酸銨兩次分步沉淀、透析后的得到的藻紅蛋白純
度(A562M/A280nm )達到3.04,達到藥品級要求(食品級A562/A280 〉 0.7;藥品級A562/A280 >2.0;試劑級八562/八280 〉4.0)，可應用于食品、化妝品、醫(yī)藥保健和檢測試劑等領域， 可用作分子探針和光敏劑等，大大提高了紫菜的深加工價值。經(jīng)過木瓜蛋白酶生物修 飾的藻紅蛋白(lmg/mL)活性顯著提高，還原力(A7oonm)為0.573,羥自由基清除 能力增加至51.03%,分別增加了 0.329和35.17%。
四

圖1生物修飾藻紅蛋白工藝路線
五、 發(fā)明的
具體實施例方式
實施例1
(1) 稱取20克紫菜粉，按體積比1:50的比例用lmM， pH6.8的PBS緩沖液浸 泡24小時，充分溶脹。在冰浴中用800 W功率的超聲波超聲1200 s進行細胞破碎。 在5000 rpm條件下離心20 min，得藻紅蛋白粗溶液；
(2) 藻紅蛋白粗溶液四層紗布過濾，用飽和度為20%~45%的硫酸銨沉淀，離 心(5000rpm, 20min),將沉淀溶于lmM, pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小 時，直至20%氯化鋇檢驗無白色沉淀，再次用飽和度為20%~45%的硫酸銨沉淀，離 心(5000rpm， 20min)，將沉淀再溶于lmM， pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48 小時，直至20%氯化鋇檢驗無白色沉淀，透析后樣品冷凍干燥即獲得藥品級(A562/A280 >2)的藻紅蛋白，得率3.12%;
(3)將冷凍干燥后的藻紅蛋白用lmM,pH6.8的PBS緩沖液溶解，使?jié)舛冗_到1 mg/mL,加入木瓜蛋白酶對藻紅蛋白進行生物修飾，修飾的條件為木瓜蛋白酶酶濃 度25000 p/g， PBS緩沖液pH7.0,酶解溫度50。C,酶解時間2h。將酶解液冷凍千燥后得到生物修飾后的藻紅蛋白。
用鐵氰化鉀法和a-脫氧核糖法分別測定生物修飾后的藻紅蛋白與修飾前的藻紅 蛋白還原力及羥自由基的清除能力。所得生物修飾后的藻紅蛋白產(chǎn)物還原力(A700nm ) 0.573,清除自由基能力51.03%,未經(jīng)修飾的藻紅蛋白還原力(A700nm) 0.244，清除 自由基能力18.53%,分別增加了 0.329和35.17%。
實施例2
(1) 稱取20克紫菜粉，按體積比1: 50的比例用lmM, pH6.8的PBS緩沖液浸 泡24小時，充分溶脹。在冰浴中用800 W功率的超聲波超聲1200s進行細胞破碎。 在5000 rpm條件下離心20 min，得藻紅蛋白粗溶液；
(2) 用飽和度為20% ~ 45Q/o的碌u酸銨沉淀，離心(5000 rpm, 20 min),將沉淀 溶于ImM, pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢^驗無白色 沉淀，再次用飽和度為20%~45%的疏酸銨沉淀，離心(5000rpm， 20 min),將沉淀 再溶于lmM，pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢驗無白 色沉淀，透析后樣品冷凍干燥即獲得藥品級(A562/A28。 > 2 )的藻紅蛋白，得率3.12 %;
(3) 將冷凍千燥后的藻紅蛋白用lmM，pH6.8的PBS緩沖液溶解，使?jié)舛冗_到 Img/mL,加入木瓜蛋白酶對藻紅蛋白進行生物修飾，修飾的條件為木瓜蛋白酶酶 濃度25000 p/g, PBS緩沖液pH7.0,酶解溫度60°C,酶解時間2h。將酶解液 冷凍干燥后得到生物修飾后的藻紅蛋白。
所得生物修飾后的藻紅蛋白產(chǎn)物還原力(A7oonm)0.617,清除自由基能力59.86%, 未經(jīng)修飾的藻紅蛋白還原力(A7Wnm) 0.244，清除自由基能力18.53%,分別增加了 0.373和41.33%。
實施例3
(1) 稱取20克紫菜粉，按體積比1: 40的比例用lmM， pH6.8的PBS緩沖液浸 泡24小時，充分溶脹。在冰浴中用800 W功率的超聲波超聲1200s進行細胞石皮碎。 在5000 rpm條件下離心20 min，得藻紅蛋白粗溶液；
(2) 用飽和度為20% ~ 45%的硫酸銨沉淀，離心(5000 rpm, 20 min),將沉淀溶于lmM, pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鉬檢驗無白色 沉淀，再次用飽和度為20°/0~45%的疏酸銨沉淀，離心(5000rpm， 20min)， 4夸;冗淀 再溶于lmM，pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢-瞼無白 色沉淀，透析后樣品冷凍干燥即獲得藥品級(As62/A28?！?)的藻紅蛋白，得率2.97 %;
(3)將冷凍干燥后的藻紅蛋白用lmM,pH6.8的PBS緩沖液溶解，使?jié)舛冗_到 lmg/mL,加入木瓜蛋白酶對藻紅蛋白進行生物修飾，修飾的條件為木瓜蛋白酶酶 濃度15000 n/g， PBS緩沖液pH6.5,酶解溫度5(TC，酶解時間2h。將酶解液 冷凍干燥后得到生物修飾后的藻紅蛋白。
所得生物修飾后的藻紅蛋白產(chǎn)物還原力(A7oonm )0.496,清除自由基能力46.16%, 未經(jīng)修飾的藻紅蛋白還原力(A700 nm) 0.244,清除自由基能力18.53%，分別增加了 0.252和27.63%。
藻紅蛋白最佳修飾條件的確定
用鐵氰化鉀法和a-脫氧核糖法分別測定生物修飾后的藻紅蛋白與修飾前的藻紅 蛋白還原力及羥自由基清除能力。
建立影響修飾結果的修飾時間、修飾溫度、pH及修飾酶濃度四個因素的單因素 試驗，以還原力為指標，確定修飾時間為2h,并從修飾溫度、pH及修飾酶濃度三個 單因素實驗中各選擇了有較高還原力能力的三個水平作為正交試驗因子(表1 )。
表l正交實驗因素水平表因素酶添加量u / g 修飾溫度(。C)pH
115000 506.5
220000 557
325000 607.5
表2正交試驗結果
酶添加量u/g修飾溫度(。C) pH還原力(A700 )
11500050 6.50.496
21500055 70.39515000607.50.385
200005070.484
20000557.50.457
20000606.50.365
25000507.50.542
25000556.50.549
250006070.617
0.4250.5070.47
0.4350.4670.499
0.5690.4560.461
0.1440.0510扁
表3方差分4斤表因素偏差平方和自由度F比F臨^f直顯著性
酶添加量0扁 219.519 *
修飾溫度(。C)0.004 2219
PH0.002 2119
誤差0 2
正交試驗結果(表2、 3)表明，三個因素對修飾后產(chǎn)物性能影響程度大小依次 為酶濃度〉修飾溫度〉pH,并且酶濃度對結果有顯著性影響，試驗確定了木瓜蛋 白酶修飾藻紅蛋白的最佳條件木瓜蛋白酶酶濃度25000 p/g， PBS緩沖液pH7.0，
酶解溫度50°C。按照此條件修飾藻紅蛋白進行驗證實驗，所得產(chǎn)物還原力(A7加nm)
0.573，清除自由基能力51.03%,未經(jīng)修飾的藻紅蛋白還原力(A700nm) 0.244，清除 自由基能力18.53%,分別增加了 0.329和35.17%。
8 9值值值u
均均均極
權利要求
1、提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法，其特征在于(1)紫菜經(jīng)40～50倍體積的1mM，pH6.8的PBS緩沖液溶脹，再用800瓦功率超聲波作用1200秒進行細胞破碎，得到藻紅蛋白的粗提物，四層紗布過濾后用飽和度為20％～45％的硫酸銨沉淀、流水透析48h兩次，得藥品級A562/A280＞2藻紅蛋白；(2)將藻紅蛋白用1mM，pH6.8的PBS緩沖液溶解，使藻紅蛋白濃度達到1mg/mL，加入木瓜蛋白酶對藻紅蛋白進行生物修飾，修飾的條件為木瓜蛋白酶酶濃度15000～25000μ/g；pH6.5～7.5；修飾溫度50～60℃；修飾時間2h，將酶解液冷凍干燥后得到生物修飾后的藻紅蛋白。
2、 根據(jù)權利要求1所述提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法，其特征在 于藻紅蛋白的粗提物用飽和度為20%~45%的硫酸銨沉淀，5000 rpm, 20min離心， 將沉淀溶于lmM, pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢驗 無白色沉淀，再次用飽和度為20%~45%的硫酸銨沉淀，5000rpm， 20min離心，再 將沉淀溶于lmM， pH6.8的PBS緩沖液中，流水透析48小時，直至20%氯化鋇檢驗 無白色沉淀，透析后樣品冷凍干燥即獲得藥品級A562/A28Q > 2的藻紅蛋白。
3、 權利要求1或2所述方法所獲得的藻紅蛋白產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高紫菜藻紅蛋白活性的生物修飾制備方法，屬于海洋生物功能成分制備技術領域。紫菜經(jīng)PBS緩沖液溶脹，用超聲波細胞破碎破壁得到粗提物，再用飽和度20％～45％硫酸銨沉淀透析，得到純度(A₅₆₂/A₂₈₀)達到3.04的紫菜藻紅蛋白。再經(jīng)木瓜蛋白酶生物修飾，酶濃度15000～25000μ/g；pH6.5～7.5；溫度50～60℃；時間2h。修飾后的藻紅蛋白活性顯著提高，還原力(A_700nm)增加至0.573，羥自由基清除能力增加至51.03％，分別增加了0.329和35.17％。本發(fā)明創(chuàng)立了提高紫菜藻紅蛋白抗氧化活性的方法，生物修飾后的藻膽蛋白在醫(yī)藥和功能食品領域更具應用價值。
文檔編號C12P21/06GK101624613SQ20091018198
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權日2009年8月6日
發(fā)明者安辛欣, 楊方美, 胡秋輝, 趙殿鋒, 趙立艷, 辛志宏 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學 被以下專利引用 (1),