專利名稱：：條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物活性測定方法,特別是涉及條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性的測定方法。
背景技術(shù)：
：光動力療法是近20年來建立和發(fā)展起來的一種新型腫瘤療法。其原理主要通過光敏劑富集于病灶處，并在光照下產(chǎn)生光敏損傷來實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。光動力治療在很大程度上取決于采用的光敏劑的性質(zhì)。傳統(tǒng)光敏劑具有嚴(yán)重的皮膚光毒性等缺點，開發(fā)新型光敏劑成為研究熱點。藻膽蛋白是很好的純天然色素，可用于食物、化妝品、熒光檢測等領(lǐng)域，近年來，根據(jù)其吸收光譜的特征和產(chǎn)生自由基特點，藻紅蛋白、藻藍蛋白均可作為光敏劑。國內(nèi)首先有蔡心涵、何立明等報道100ug/mL螺旋藻藻藍蛋白經(jīng)銅泵激光器輻照12J/cm2,使人大腸癌細(xì)胞服8348存活率僅為22.2%。之后又有李冠武、王廣策等報道用提取自多管藻的藻紅蛋白處理人口腔8113細(xì)胞和小鼠S180細(xì)胞，再經(jīng)488nm氬離子激光器輻照25J/cm2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率分別為25%和24%。藻膽蛋白以其高效、無毒、副作用小等優(yōu)點，被認(rèn)為是光動力學(xué)治療法中一種非常有前景的光敏劑。相比螺旋藻、多管藻，條斑紫菜在我國已大量人工栽培，具有量上的優(yōu)勢，其本身作為高等紅藻也富含藻膽蛋白。建立條斑紫菜藻膽蛋白抑瘤活性的測定模型，有利于為新型抑瘤光敏劑的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)方案。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性的測定方法以條斑紫菜為原料，通過對小鼠B-16肉瘤的抑制作用研究，測定紫菜藻膽蛋白的抑瘤活性；為紫菜藻膽蛋白在抑瘤方面的應(yīng)用，提供研究模型；為藻膽蛋白在抑瘤領(lǐng)域提供更為豐富廉價且有效的原料；為新型光敏劑開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)方案。本方法以INNOVR400氬離子激光器為光源時，對肉瘤殺傷率更高。3本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性測定方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞；(2)待細(xì)胞生長旺盛時，用胰酶消化細(xì)胞，洗滌吹散細(xì)胞于離心管中冰浴，在小鼠左前肢肋下皮下接種；(3)飼養(yǎng)7-IO天后，挑選移植瘤直徑長至0.5-0.7cm的小鼠實驗；(4)將小鼠于瘤邊緣0.5cm處皮下注射高純度蛋白溶液，4h后給予激光輻照，輻照后的小鼠避光飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10天并記錄瘤重；(5)計算抑瘤率，測定抑瘤活性。所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為10%小牛血清的1640培養(yǎng)液；所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件為37°C、5%0)2濃度及飽和濕度；所述的激光輻照能量為100-200J/cm2。由于本發(fā)明以條斑紫菜藻膽蛋白和小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞為材料，通過激光輻照殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，具有以下優(yōu)點1、藻膽蛋白來源豐富，我國是紫菜生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量20億張左右，目前市場上大多是自然晾干的紫菜，銷售價格在每千克20-30元，而每噸詞料級螺旋藻干粉6-8萬元人民幣(60-80元/千克)，曾一度高達每kg30美元(約240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本發(fā)明所用原料來源廣泛，無需加工，成本相對于螺旋藻便宜的多；2、藻膽蛋白提取方便，根據(jù)之前制備流程(發(fā)明專利申請?zhí)?004100990370)，目前從條斑紫菜提取高純度藻膽蛋白工藝簡單，成本低廉，得率較高；3、黑色素瘤細(xì)胞一般見于皮膚表層，便于光動力治療；4、黑色素瘤發(fā)病率逐年增髙，光動力治療腫瘤副作用小，該方法一旦應(yīng)用于臨床，市場前景廣闊；5、從結(jié)果看，條斑紫菜藻紅蛋白和藻藍蛋白均對癌細(xì)胞有較高殺傷率，是一種有效的光敏劑。圖l:R-PE對小鼠B16黑色素實體瘤生長的抑制作用。圖2:C-PC對小鼠B16黑色素實體瘤生長的抑制作用。具體實施例方式以下將結(jié)合實施例，對條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性測定方法，作進一步詳細(xì)的描述。條斑紫菜(采自江蘇呂泗條斑紫菜栽培海區(qū))；小鼠(昆明鼠，購自復(fù)旦大學(xué)動物房)；小鼠B-16肉瘤細(xì)胞(購自中科院細(xì)胞庫)；其它試劑均為以化學(xué)分析純按常規(guī)配制。實施例一本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻紅蛋白(R-PE，紫菜藻紅蛋白)和小鼠B-16肉瘤，具體步驟如下(1)、小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C，5%0)2濃度及飽和濕度。待細(xì)胞生長旺盛時，用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，洗滌吹散細(xì)胞于事先冷凍的2mL離心管中冰浴，以備小鼠體內(nèi)接種；(2)、小鼠隨機分組后于左前肢肋下皮下接種，每只接種0.2mL，約l(f個細(xì)胞，常規(guī)方法飼養(yǎng)，每兩天觀察腫瘤大小變化，7-10d后，挑選移植瘤直徑長至0.5-0.7cm的小鼠實驗；(3)、荷瘤小鼠于瘤邊緣0.5cm處皮下注射0.5mL純度為5.5(A鵬加/A280nra)的藻紅蛋白溶液，濃度梯度分別取0.5、1、2mg/mL;(4)、4h后，使用I,OVR400氬離子激光器(美國Coherent公司儀器)，各組給予200J/cm2的激光照射，輻照后的小鼠避光飼養(yǎng)；(5)、以荷瘤對照組、5-氟尿嘧啶陽性給藥組、激光單獨輻照組、R-PE濃度(2mg/mL)單獨治療組作對照，并設(shè)空白組；(6)、長有腫瘤各組小鼠每兩天測量記錄下其腫瘤的長徑a與橫徑b，瘤重按體積二aXb2(cm)/2折算。連續(xù)觀察記錄10d，觀察結(jié)束后，解剖小鼠取出瘤體，稱瘤體重量，計算抑瘤率；(7)、結(jié)果見圖1，顯示lmg/mL濃度藻紅蛋白對小鼠B-16黑色素瘤的抑制率最大，為64%。圖中曲線標(biāo)注與相應(yīng)處理條件的關(guān)系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例二本實施例中所用的材料為條斑紫菜藻藍蛋白(C-PC，紫菜藻藍蛋白)和小鼠B-16肉瘤，具體步驟如下(1)、同實施例l;(2)、同實施例l;(3)、荷瘤小鼠于瘤邊緣0.5cm處皮下注射0.5mL純度為4.0(A615B/A肌》的藻藍蛋白溶液，濃度梯度分別取0.5、1、2mg/mL;(4)、4h后，使用He-Ne激光器(QHP型，上海玻璃儀器一廠)，各組給予100J/cm2的He-Ne激光輻照，輻照后的小鼠避光伺養(yǎng)；(5)、以荷瘤對照組、5-氟尿嘧啶陽性給藥組、激光單獨輻照組、C-PC濃度(2mg/mL)單獨治療組作對照，并設(shè)空白組；(6)、長有腫瘤各組小鼠每兩天測量記錄下其腫瘤的長徑a與橫徑b，瘤重按體積二aXb2(cm)/2折算。連續(xù)觀察記錄10d，觀察結(jié)束后，解剖小鼠取出瘤體，稱瘤體重量，計算抑瘤率；(7)、結(jié)果見圖2，顯示2mg/mL濃度藻藍蛋白對小鼠B-16黑色素瘤的抑制率最大，為55%。圖中曲線標(biāo)注與相應(yīng)處理條件的關(guān)系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性測定方法，其特征在于包括如下步驟(1)培養(yǎng)小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞；(2)待細(xì)胞生長旺盛時，用胰酶消化細(xì)胞，洗滌吹散細(xì)胞于離心管中冰浴，在小鼠左前肢肋下皮下接種；(3)飼養(yǎng)7-10天后，挑選移植瘤直徑長至0.5-0.7cm的小鼠實驗；(4)將小鼠于瘤邊緣0.5cm處皮下注射高純度蛋白溶液，4h后給予激光輻照，輻照后的小鼠避光飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10天并記錄瘤重；(5)計算抑瘤率，測定抑瘤活性。2、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為10%小牛血清的1640培養(yǎng)液。3、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件為37r:、5^C(V濃度及飽和濕度。4、如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的激光輻照能量為100-200J/cm2。全文摘要本發(fā)明提供一種條斑紫菜藻膽蛋白肉瘤抑制活性的測定方法以條斑紫菜為原料，采用INNOVR400氬離子激光器為光源，通過對小鼠B-16肉瘤的抑制作用研究，測定紫菜藻膽蛋白的抑瘤活性。為紫菜藻膽蛋白在抑制肉瘤方面的應(yīng)用，提供研究模型；為腫瘤治療提供更為豐富廉價且有效的原料。文檔編號A61K49/00GK101642578SQ20091019450公開日2010年2月10日申請日期2009年8月25日優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日發(fā)明者何培民,李春霞,卿汪,源王,蔡春爾申請人:上海海洋大學(xué)