專利名稱：經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法及部分dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫菜種質(zhì)資源的鑒定，即經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法及鑒定中所用的中國沿海紫菜栽培種DNA序列。
背景技術(shù)：
紫菜是重要的經(jīng)濟(jì)海藻，應(yīng)用歷史悠久。紫菜營養(yǎng)價值極高，歷來被人們視為海昧珍品，蛋白含量高，氨基酸種類多、數(shù)量大，維生素的含量也很豐富，此外，還含有大量的鈣、磷、鐵等無機(jī)鹽等，許多國家把它譽(yù)為“保健食品”。紫菜還具有重要的藥用價值。我國古代的《食療本草》、《本草綱目》及近代的《中國海洋生物藥》中記載紫菜味甘、寒，清熱、軟堅、補(bǔ)胃、利水腫；主治甲狀腺腫大、水腫、慢性氣管炎、濕性腳氣、喉炎、麻疹等癥?！吨袊Ｔ逯尽酚涊d紫菜有壇紫菜(Porphyra haitanensis)、條斑紫菜(P.yezoensis)、半葉紫菜(P.katadai)、邊紫菜(P.marginata)、圓紫菜(P.suborbiculata)和岡村紫菜(P.okamurai)等。
大多數(shù)紫菜依據(jù)其外部形態(tài)特征較難鑒別其種類，目前主要是采外形和顯微結(jié)果觀察相結(jié)合的方法。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，一些分子標(biāo)記技術(shù)諸如隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)和簡單序列重復(fù)間區(qū)(ISSR)等已被廣泛的應(yīng)用于重要經(jīng)濟(jì)海藻的鑒定。由于這幾種標(biāo)記方法穩(wěn)定性和重復(fù)性不高，從而影響了鑒定的準(zhǔn)確性。
核糖體DNA是編碼核糖體RNA的基因，在植物細(xì)胞核中以頭尾相連的方式在染色體上重復(fù)排列，每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)目在1000到10000之間。核糖體DNA中包含了進(jìn)化速率不等的編碼區(qū)、非編碼區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)，ITS(Internal transcribed spacer)是核糖體DNA中介于18S和5.8S之間(ITS1)以及5.8S和26S之間(ITS2)的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，目前研究顯示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的堿基對序列非常保守，不同植物間的差別很??；而位于植物rDNA基因間的ITS1和ITS2的堿基對序列則差異較大。由于ITS存在于高重復(fù)的核糖體DNA中，進(jìn)化速率快且片段長度不大(在紅藻中ITS1在100-400bp之間，ITS2在400-1400bp之間)，加上協(xié)調(diào)進(jìn)化(concerted evolution)使該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致，因而十分適合于植物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化和種質(zhì)鑒定的研究。尤其是近些年來，建立在PCR基礎(chǔ)上直接測序方法的建立和廣泛應(yīng)用，ITS序列分析已成為在序列水平上對科內(nèi)屬間及屬下種間的植物進(jìn)行命名、分類、親緣關(guān)系確定和系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法及部分DNA序列，使結(jié)果更可靠、更準(zhǔn)確，用特定的DNA序列對中國沿海紫菜栽培種進(jìn)行鑒別。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用rDNA ITS區(qū)DNA序列鑒別中國沿海紫菜，所采用的方法包括如下步驟收集藻體材料，進(jìn)行品種鑒定工作；(1)總DNA提取取新鮮健康的藻體材料，用無菌水處理后，在液氮種研磨成粉末，提取總DNA；(2)PCR擴(kuò)增利用以寡核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，引物的設(shè)計分別參考海藻的18S和26S保守區(qū)段，正向引物P15’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’，反向引物P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；以步驟(1)提取的DNA為模板，對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增ITS區(qū)段；(3)RCR產(chǎn)物純化；(4)DNA序列測定純化后的DNA進(jìn)行序列測定(應(yīng)用直接測序技術(shù))，確立rDNA ITS區(qū)，包括ITS1、5.8S和ITS2區(qū)的全序列；(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析待分析的rDNA ITS區(qū)的序列一經(jīng)測定，用對位排列軟件進(jìn)行對位排列，并輔以人工校對，用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件分析各樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫中各個序列間的差異。
每一個樣品從DNA提取到測序至少重復(fù)3次。
所述總DNA提取為新鮮的藻體加液氮研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移到提取緩沖液中，63-65℃水浴30-60min后用氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)抽提一次；上清液中加10％SDS和1/3體積的4M的KAC，冰浴10-20min后再用氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3體積異丙醇沉淀DNA；DNA溶解在TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)抽提一次，加1/3體積異丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；純化部分DNA；提取緩沖液的組成為10mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1EDTA，1.4M NaCl，1.5-2.5％CTAB，1-2％SDS；提取所用的KAc濃度為4.0-5.0M，pH值范圍在5.2-7.5；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)液含10mmol/LTris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個引物各4-6mmol/L，DNA模板40-100ng；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5分鐘；90℃1分鐘，50-53℃2分鐘，5個循環(huán)；72℃1分鐘；90℃1分鐘，58-60℃1分鐘，72℃1分鐘，28-35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；所述ITS區(qū)擴(kuò)增后測序所采用的引物為，正向引物P35’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’，反向引物P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。
本發(fā)明還提供經(jīng)濟(jì)海藻紫菜ITS1、5.8S和ITS2擴(kuò)增的特異DNA序列，即中國沿海紫菜栽培種ITS(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))區(qū)DNA序列，具有序列表SEQ ID NO1～9中任意一組堿基序列，其可應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定方法中。
申請人從中國沿海不同地點(diǎn)采集了9個樣品，所有樣品都經(jīng)過紅藻專家鑒定。分析結(jié)果顯示，幾種中國紫菜的ITS序列長度在1050左右，與Genebank中已經(jīng)注冊的幾種紫菜(ITS1，5.8S rDNA和部分ITS2)的序列相似度在90％左右，說明紫菜ITS序列的保守性比較強(qiáng)。如果單獨(dú)考慮ITS1，所測得同種紫菜在DNA水平的變異百分率范圍為0.76-3.80％，紫菜種間DNA序列的差異為0.76-9.62％；如果考慮整個ITS區(qū)(包括ITS1、5.8S和ITS2)，同種紫菜在DNA水平的差異為2.07-3.01％，紫菜種間DNA序列差異為2.07-8.18％。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明首先提供了一種有效的提取紫菜高質(zhì)量DNA的方法。
2.本發(fā)明提供了利用經(jīng)濟(jì)海藻紫菜的DNA序列對紫菜種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定的方法，也即利用經(jīng)濟(jì)海藻紫菜的ITS1及5.8S rDNA和ITS2部分或全部DNA序列及利用該序列鑒定其種質(zhì)資源的方法。
3.本發(fā)明對中國沿海紫菜的rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行了測序，獲得了rDNA ITS(包括ITS1，5.8S和ITS2)的全序列。


圖1為采用相同的PCR反應(yīng)程序用兩套不同的引物擴(kuò)增紫菜的ITS序列電泳結(jié)果圖。
圖2為采用P1和P2為引物，用兩套PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)描述所述方法實(shí)施例1(1)總DNA提取(簡單高效法)新鮮的藻體加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到提取緩沖液[10mmol L-1Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，1.4M NaCl，2％cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)，1.5％sodium dodecyl sulfate(SDS)]中，65℃水浴1h后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。上清液中加10％SDS和1/3體積的4M的KAC，冰浴10min后再用氯仿∶異戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3體積異丙醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，加1/3體積異丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中。部分DNA用北京生物發(fā)展科學(xué)與技術(shù)有限公司提供的試劑盒(商品號MK 001-3)進(jìn)行純化。瓊脂糖凝膠電泳后染色顯示提取的基因組DNA大小在23Kb以上。
(2)PCR擴(kuò)增紫菜ITS區(qū)擴(kuò)增的引物為P1和P2，序列如下P1(正向)為5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’位于18S上，P2(反向)為5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’，位于26S上。
PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)在20μL的體系種完成，反應(yīng)液含10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個引物各5mmol/L，DNA模板約50ng。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5分鐘；90℃1分鐘，50℃2分鐘，5個循環(huán)；72℃1分鐘；90℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘，30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。以ddH2O代替模板DNA做空白對照。
(3)PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用Watson試劑盒純化，具體操作按試劑盒使用指南進(jìn)行。
(4)DNA序列測定用BigDyeTM測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)，測序反應(yīng)參數(shù)為Mix 1μL，純化后的DNA約30-50ng，Primer 1.5pmol，buffer 1.2μL，ddH2O適量。測序反應(yīng)條件為95℃1min，95℃30s，50℃30s，60℃4min，總共35各循環(huán)。用ABI 310全自動測序儀上進(jìn)行序列測定。
(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析ITS1和ITS2的起止范圍參照Genbank中已經(jīng)注冊的部分紫菜ITS1和5.8S rDNA序列，所得序列輸入計算機(jī)后用Clustal W軟件進(jìn)行比對排列，并輔以人工校對。用MEGA 2.1分析軟件包分析各樣品DNA序列之間的差異(同種間核苷酸序列堿基差異率一般應(yīng)小于4％)。
實(shí)施例2用1g新鮮的紫菜，采用CTAB法、SDS法和申請人提供的簡單高效法分別提取基因組DNA。
CTAB法新鮮的藻體加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到提取緩沖液[5％cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)，100mmol Tris-HCl(pH 8.0)，100mm EDTA(pH 8.0)，1.4mol NaCl，1％PVP]中，65℃水浴1h后加蛋白酶k，再用氯仿抽提。向上清液中加2倍體積95％冷乙醇將DNA沉淀下來，洗滌風(fēng)干后溶于TE中。加入Rnase以除去RNA，用氯仿抽提一次后用異丙醇沉淀，得到的DNA重新溶解在TE中備用。
SDS法新鮮的藻體加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到提取緩沖液[100mmolL-1Tris.HCl，pH 8.0，50mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，0.2M NaCl，1％Proteinase K(20mg/ml)，1％sodium dodecylsulfate(SDS)]中，65℃水浴1h后用氯仿抽提二次。上清液中加2/3體積異丙醇沉淀DNA。風(fēng)干后的DNA溶解在TE中，加入Rnase以除去RNA，用氯仿抽提一次后用異丙醇沉淀，得到的DNA重新溶解TE中備用。
測定上述兩種方法得到的DNA的得率和純度(OD260/280)，與申請人提供的簡單高效法得到的結(jié)果進(jìn)行比較，如下表1所示表1

實(shí)施例3在本試驗(yàn)中，以本申請?zhí)峁┑暮唵胃咝Хㄌ崛』蚪MDNA；采用相同的PCR程序用兩套不同的引物擴(kuò)增紫菜的ITS序列，他們分別是P1(正向)5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’和P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；W1(正向)5’-AGCCATGTGAGCCCTCTATGAG-3’和W2(反向)5’-GTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTT-3’。
電泳結(jié)果結(jié)果(圖1，圖1上半部分引物W1和W2擴(kuò)增結(jié)果，下半部分引物P1和P2擴(kuò)增結(jié)果)顯示以W1和W2為引物擴(kuò)增時，少數(shù)樣品能擴(kuò)增出大小為1100bp左右的條帶，大部分樣品擴(kuò)增出兩到三條帶，大小在500-700之間；當(dāng)以P1為P2為引物擴(kuò)增時，所有樣品都得到一條大小為1050bp的條帶。
實(shí)施例4在本試驗(yàn)中，以本申請?zhí)峁┑暮唵胃咝Хㄌ崛』蚪MDNA，以實(shí)施例3中提供的P1和P2為引物，用兩套PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。程序a95℃5分鐘；90℃1分鐘，50℃2分鐘，5個循環(huán)；72℃1分鐘；90℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘，30個循環(huán)；72℃10分鐘。程序b96℃3分鐘；94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，2個循環(huán)；94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環(huán)；72℃5分鐘。電泳結(jié)果(圖2，圖2上半部分程序b擴(kuò)增結(jié)果，下半部分程序a擴(kuò)增結(jié)果)顯示程序a能穩(wěn)定地擴(kuò)增出一條大小為1050bp左右的條帶，程序b中大多數(shù)樣品能得到一條單一的大小約1050bp的條帶，但有兩三個樣品不穩(wěn)定，有時有兩條帶。
實(shí)施例5在本試驗(yàn)中，以本申請?zhí)峁┑暮唵胃咝Хㄌ崛』蚪MDNA，以實(shí)施例3中提供的P1和P2為引物，以實(shí)施例4提供的程序a作為PCR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用兩套引物進(jìn)行測序，他們分別是P1(正向)5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’和P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；P3(正向)5’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’和P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。
測序結(jié)果顯示用P3和P2進(jìn)行測序反應(yīng)時，所有樣品測序的訊號都很強(qiáng)，基本上可以一次測通。而用P1和P2這對引物進(jìn)行測序反應(yīng)時，多數(shù)樣品測序訊號很弱，難以測出結(jié)果，或者需要二次測序。
序列附表(中國經(jīng)濟(jì)海藻紫菜rDNAITS區(qū)(包括ITS1、5.8S和ITS2)的全序列)1.源于山東青島的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCCAACCAAATCGTCCGCACAGCAGGTGGCAATGAAAAAGAGACTCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTAGCAAGCAGCACTCTTCTGCCATCGGCTCTGTGCAGGGCGTAAATTCCCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTGCCTTCTAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCCCTTATATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTCTTCTATGAGGAGCTTGTGGGAAGACTGTCTCCATACAATAACAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATACCTGTGAATTGCAGAAGACTTCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGC2.源于山東青島的半葉紫菜(porphyra katadai)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACAGAAACACACGCCAACCAAATCGTCCACACAGGTGGCGATGAAAAAGAGAATCTGTTTGTCGCCTTTTGGGGTATACAAGCACTCTTTTCCATCGCCTCTGTGCAGGGCGTAACTTCCCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCCTCTATGCTTGGCAATTTTTTTATTGCCTTTCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCACATAGACATTTACATCATCATATGCCCGTTTTTCTTTCTTAACCGCTTGCCACAGTTTCTCCTGTAAGGAGCTTGTGGGAAGACCGTCTCCATACAATAACAAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGGACTCCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCATCCCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAACACAATCGGCTCTCTTCCCTTCCTGCCTTCCCCGGCAAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATGGGGACTTCGTCGCCCCTTTCTATTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTGGCGAGGTCATAGAGCATGAGTTTCAAGCACCATGGCTCTCAAGTCAGAGTAAAACGTCCTGAGCGACGGTCTGCATTGATTCACTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTCTGTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTGTCTGACGTAGAGACAGGTGCGGTCACTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAACAACAACAACCGTATCACACGTCATAGAGGGTCGTCGGAACGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG3.源于山東青島的少精紫菜1(Porphyra oligospermatangia)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCCAACCAAATCGTCCACACAGGTGGCGATGAAAAAGAGAATCTGTTTGTCGCCTTTTGGGGTATACAA
GCACTCTTTTCCATCGCCTCTGTGCAGGGCGTAACTTCCCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCCTCTATGCTTGGCAATTTTTTTATTGCCTTTCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCACATAGACATTTACATCATCATATGCCCGTTTTTCTTTCTTAACCGCTTGCCACAGTTTCTCCTGTAAGGAGCTTGTGGGAAGACCGTCTCCATACAATAACAAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATACCTAATGTGAATTGCAGGACTCCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCATAACTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAACAGAATCGGCTCTCTTCCCTTCCTGCCTTCCCCGGCAAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATGGGATCTTCGTCGCCCCTTTCTATTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTGGGAAGGTCATAGAGCATGAGTTTCAAGCACCATGGCTCTCAAGTCAGAGTAAAACGTCCTGAGGCACGGTCTGCATTGATTCACTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTCCATGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTGTCTGACGTAGAGACAGGTGCGGTCACTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAACAACAACAACCGTATCACACGTCACTGAGGGTCGTCGGAACGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG4.源于山東青島的少精紫菜2(Porphyra oligospermatangia)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCCAACCAAATCGTCCACACAGGTGGCGATGAAAAAGAGAATCTGTTTGTCGCCTTTTGGGGTATACAAGCACTCTTTTCCATCGCCTCTGTGCAGGGCGTAACTTCCCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCCTCTATGCTTGGCAATTTTTTTATTGCCTTTCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCACATAGACATTTACATCATCATATGCCCGTTTTTCTTTCTTAACCGCTTGCCACAGTTTCTCCTGTAAGGAGCTTGTGGGAAGACCGTCTCCATACAATAACAAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGGACTCCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCAACTCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAAGACAATCGGCTCTCTTCCCTTCCTGCCTTCCCCGGCAAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATGGTGGCTTCGTCGCCCCTTTCTATTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTGACGAGGTCATAGAGCATGAGTTTCAAGCACCATGGCTCTCAAGTCAGAGTAAAACGTCCTGACCGACGGTCTGCATTGATTCACTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTATCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTGTCTGACGTAGAGACAGGTGCGGTCTCTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAACAACAACAACCGTATCACACGTCGAAGAGGGTCGTCGGAACGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATC
TGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG5.源于江蘇南通的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCGAACCAAATCGTCCGCACAGGTGGTGGCAATGAAAGAGAGAATCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTATAGCAAGCAGCACTCTTTTGCCATCGCCTCTGTGCCGGGCGGGGATTCTCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTTTTGCCTTCCAGGGAGGATTCCGCCAATGGACCCCCATATAATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTCTTCTATGAGGAGCTTGTGGGAAGACTGTCTCCATACAACAACATAGATTCAACTCTTAGCGGGGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGTGATAACTAATGTGAATTGCAGGACTTCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCCCATCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACCTAACAATCGGCTCTCTTATCTTCCTGCCTTCTTGGGGCAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATCTGGGCTTTGTCGCCCCTTTCTCTTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCAGTGGAGGTCATAGAGCATGAGTTTAAAGCACCACATCTCTCAAGTCAGAGTGAGCGTCTTGTTAGTAGGTCCGCATTGATTCAGTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCAGTCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTCTCTGACGTAGAGACAGGTGCCGGTTCTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAAGAAAAAACCGTACCACATGTCATTAAAGAGGCAGATTGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG6.源于江蘇連云港的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCGAACCAAATCGTCCGCACAGGTGGTGGCAATGAAAGAGAGAATCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTATAGCAAGCAGCACTCTTTTGCCATCGCCTCTGTGCCGGGCGTAAATTCTCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTTTTGCCTTCCAGGGAGGATGCCGCCAATGGACCCCCATATAATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTCTTCTATGAGGAGCTTGTGGGAAAACTGTCTCCATACAATAACAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATACCTAGTGTGAATTGCAAGGACTTCGTGAATCATAAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCCAATCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAATACAATCGGCTCTCTTATCTTCCTGCCTTCTTGGGGCAAAAGGAGTGCATGCCGGAGATGGAGGCTTTGTCGCCCCTTTCTCTTGAAAGAGGCGTCGT
CCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTCCGGAGGTCATAGAGCATGAGTTTAAAGCACCACATCTCTCAAGTCAGAGTGAGCGTCTTGAACGTAGGTCCGCATTGATTCAGTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTATCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTCTCTGACGTAGAGACAGGTGCCGTCACTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAAGAAAAAACCGTACCACATGTCAAGGAAGAGGCAGATTGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG7.源于江蘇如東的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCGAACCAAATCGTCCGCACAGGTGGTGGCAATGAAAGAGAGAATCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTATAGCAAGCAGCACTCTTTTGCCATCGCCTCTGTGCCGGGCGTAAATTCTCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTTTTGCCTTCCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCCCATATAATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTCTTCTATGAGGAGCTTGTGGGAAGACTGTCTCCATACAATAACAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCCAACTGCGATAACTAATGTGAATTGCAGGACTTCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTGCCATCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAGAACAATCGGCTCTCTTATCTTCCTGCCTTCTTGGGGCAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATACGGGCTTTGTCGCCCCTTTCTCTTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCGCTGGAGGTCATAGAGCATGAGTTTAAAGCACCACATCTCTCAAGTCAGAGTGAGCGTCTTGACAGTAGGTCCGCATTGATTCAGTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTATCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTCTCTGACGTAGAGACAGGTGCCGGTTCTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAAGAAAAAACCGTACCACATGTCAAGAAAGAGGCAGATTGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG8.源于江蘇啟東的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCGAACCAAATCGTCCGCACAGGTGGTGGCAATGAAAGAGAGAATCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTATAGCAAGCAGCACTCTTTTGCCATCGCCTCTGTGCCGGGCGTGGATTCTCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTTTTGCCTTCCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCCCATATAATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTC
TTCTATGAGGAGCTTGTGGGAAGACTGTCTCCATACAATAACAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCACCCAACTGCGAACTAACTAATGTGAATTGCAGGACTTCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTCGTATCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACATGACAATCGGCTCTCTTATCTTCCTGCCTTCTTGGGGCAAAAGGTAGTGCATGCCGGAGATGGTGGCTTTGTCGCCCCTTTCTCTTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTCTGGAGGTCATAGAGCATGAGTTTAAAGCACCACATCTCTCAAGTCAGAGTGAGCGTCTTGATTGTAGGTCCGCATTGATTCAGTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTTCCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTCTCTGACGTAGAGACAGGTGCCGTTTCTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAAGAAAAAACCGTACCACATGTCAAATAAGAGGCAGATTGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG9.源于江蘇啟東最初來源于日本的條斑紫菜(Porphyra yezoensis)ITS1、5.8S和ITS2區(qū)DNA序列CACAAACTATTGACACAAACACACGCGAACCAAATCGTCCGCACAGGTGGTGGCAATGAAAGAGAGAATCTGCATGTCGCCTTTCGGGGTATAGCAAGCAGCACTCTTTTGCCATCGCCTCTGTGCCGGGCGTGGGTTCTCATTGAGAGGATGTGAGGGCACCACAGGAAGCTTTTCCACAGGAAGTCGCCATCCTTCTCCCTCCACGGCGGCGCTTCTGTGCTTGGCAGTTTTTTTTTTTGCCTTCCAGGGAGGATGCCGCCAATGGAGCCCCATATAATATATACATCATCATATGCCCCTTTTTTTCTTAACCGCTTGCCACAGCTTCTTCTATAAGGAGCTTGTGGGAAGACTGTCTCCATACAATAACAAAGATACAACTCTTAGCGGTGGATATCTTGGTTCTCGCAACGATAAAGAACGCAGCCAACTGCGATAACTAATGTGAATTGCAGGACTTCGTGAATCATTAAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCTAGCATCTCCATGAGGAGGTGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCGATGGGAAAAACAATACATAACAAAACAATCGGCTCTCTTATCTTCCTGCCTTCTTGGGGCAAAAGTAGTGCATGCCGGAGATGCGGGCTTTGTCGCCCCTTTCTCTTGAAAGAGGCGTCGTCCGAAACACGTATCGTTGCCCGCTTCGGAGGTCATAGAGCATGAGTTTAAAGCACCACATCTCTCAAGTCAGAGTGAGCGTCTTGATAGTAGGTCCGCATTGATTCAGTTTCAACCCAGGTGGCGTTGGTTACTTGCCATAAGCCTCTCGCTGGGGTTTCTTTGCTTGGACCTCTCTTGTCAGTTTCTCTGACGTAGAGACAGGTGCCGTCACTCATGGGCGTTGCCCTCTGGAACGTGCTAAAAAAAAGAAAAAACCGTACCACATGTCAATCAAGAGGCAGATTGTGCTTGACGGCGGGAGATCCTTTGTTTCTCGCTTGTCCTGAGCGAATCTGCCAGTCTTTGACGAGTGTGTTCCTTCCATAAACCCGATCTCACATCAGGTAGG
權(quán)利要求
1.經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于，步驟如下(1)總DNA提取取新鮮健康的藻體材料，用無菌水處理后，在液氮種研磨成粉末，提取總DNA；(2)PCR擴(kuò)增利用正向引物P15’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’，反向引物P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；以步驟(1)提取的DNA為模板，對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物純化；(4)DNA序列測定純化后的DNA進(jìn)行序列測定，確立rDNA ITS區(qū)，包括ITS1、5.8S和ITS2區(qū)的全序列；(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析待分析的rDNA ITS區(qū)的序列一經(jīng)測定，用對位排列軟件進(jìn)行對位排列，并輔以人工校對，用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件分析各樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫中各個序列間的差異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于所述總DNA提取為新鮮的藻體加液氮研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移到提取緩沖液中，63-65℃水浴30-60min后用氯仿∶異戊醇抽提一次；上清液中加10％SDS和1/3體積的4M的KAC，冰浴10-20min后再用氯仿∶異戊醇再抽提一次，取上清液加2/3體積異丙醇沉淀DNA；DNA溶解在TE緩沖液中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶異戊醇抽提一次，加1/3體積異丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；純化部分DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于所述提取緩沖液的組成為10mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，20mmol L-1EDTA，1.4M NaCl，1.5-2.5％ CTAB，1-2％ SDS；提取所用的KAc濃度為4.0-5.0M，pH值范圍在5.2-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)液含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個引物各4-6mmol/L，DNA模板40-100ng。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5分鐘；90℃ 1分鐘，50-53℃2分鐘，5個循環(huán)；72℃1分鐘；90℃1分鐘，58-60℃1分鐘，72℃1分鐘，28-35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于所述ITS區(qū)擴(kuò)增后測序所采用的引物為，正向引物P35’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’，反向引物P25’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。
7.一種權(quán)利要求1所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定方法中可以采用的部分DNA序列，其特征在于其為中國沿海紫菜栽培種ITS區(qū)DNA序列，具有序列表SEQ ID NO1～9中任意一組堿基序列。
8.按照權(quán)利要求7所述的經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定方法中可以采用的部分DNA序列，其特征在于中國經(jīng)濟(jì)海藻紫菜如果單獨(dú)考慮ITS1，同種紫菜在DNA水平的變異百分率范圍為0.76-3.80％，紫菜種間DNA序列的差異為0.76-9.62％；如果考慮整個ITS區(qū)，同種紫菜在DNA水平的差異為2.07-3.01％，紫菜種間DNA序列差異為2.07-8.18％。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫菜種質(zhì)資源的鑒定，即經(jīng)濟(jì)海藻紫菜種質(zhì)資源鑒定的方法及鑒定中所用的中國沿海紫菜栽培種DNA序列；步驟為1)總DNA提??；2)以上步驟提取的DNA為模板，對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)PCR產(chǎn)物純化；4)純化后的DNA進(jìn)行序列測定，確立rDNA ITS區(qū)，包括ITS1、5.8S和ITS2區(qū)的全序列；5)用對位排列軟件進(jìn)行對位排列，并輔以人工校對，用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件分析各樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫中各個序列間的差異。本發(fā)明提供了一種有效的提取紫菜高質(zhì)量DNA的方法和利用DNA序列對紫菜種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定方法，并對中國沿海紫菜的rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行了測序。
文檔編號C12Q1/68GK1614031SQ20031010503
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者段德麟, 胡自民, 赫英俊 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所