專利名稱：一種固相化sumo化系統(tǒng)及固相化去sumo化系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種固相化SUMO化系統(tǒng)及一種固相化去 SUMO化系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在1996年，Blobel發(fā)現(xiàn)SUM0(Smt3)能夠共價(jià)的結(jié)合一個(gè)小G蛋白的激活蛋 白R(shí)anGAPl，并能影響此蛋白在細(xì)胞核與核質(zhì)的運(yùn)輸，隨后第一次將此類小蛋白命名為 SUMO (small ubiquitin-like modifier)。隨后，SUMO化修飾在多種生命過(guò)程，在多種生物 體(酵母，昆蟲(chóng)，線蟲(chóng)甚至高等脊椎動(dòng)物)中被發(fā)現(xiàn)，并得到闡釋。SUMO在細(xì)胞的多項(xiàng)生理 過(guò)程，在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中和某些藥物的作用過(guò)程中，都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，成為 現(xiàn)階段蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容和商業(yè)化應(yīng)用的重要領(lǐng)域。因此，如何對(duì) 目的蛋白方便、快捷地進(jìn)行SUMO化和去SUMO化就成為了其研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前對(duì)于SUMO化的研究方法主要為首先通過(guò)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)尋找感興趣的可能被 SUMO化的蛋白，然后通過(guò)SUMO激活酶El (包括異源二聚體SAEI和SAEII)和SUMO轉(zhuǎn)移酶 Ubc9進(jìn)行SUMO化確證，然后集中于研究SUMO化后的蛋白底物的功能。但由于進(jìn)行SUMO化 確證時(shí)，沒(méi)有一個(gè)合適的操作平臺(tái)，導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)蛋白的SUMO化及SUMO化后的后續(xù)處理均不 方便，因此，需要一種能夠用于快速高通量鑒定蛋白SUMO化的系統(tǒng)，以簡(jiǎn)化SUMO化操作。同時(shí)，在后基因組時(shí)代的研究中，研究一個(gè)基因的重要方面就是對(duì)它的翻譯產(chǎn)物 的體外功能進(jìn)行分析，因此，要求能夠方便快捷經(jīng)濟(jì)地獲得重組蛋白質(zhì)。然而隨后的實(shí)踐證 明，在最為普遍使用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，人類基因組中只有約25%的基因能夠以可溶 蛋白的方式表達(dá)。解決上述兩個(gè)問(wèn)題的常用方法就是使用促溶表達(dá)融合標(biāo)簽，比如葡萄糖親和標(biāo)簽 MBP (maltose-binding protein)，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽 GST (glutathione S-transferase) 等。當(dāng)外源蛋白質(zhì)融合某些特定的標(biāo)簽后，能夠有效增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和溶解性。但是，在融合標(biāo)簽切除過(guò)程中，一個(gè)非常值得注意的問(wèn)題就是許多蛋白質(zhì)要獲得 生物活性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都需要特定的N端氨基酸殘基，尤其是很多用于結(jié)構(gòu)研究以及醫(yī) 療用途的蛋白質(zhì)。然而所有新生蛋白質(zhì)在其N端都是甲硫氨酸，然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后加工修飾 才形成其它不同的氨基酸。而常用的GST，NusA或者M(jìn)BP標(biāo)簽的切除，只能通過(guò)引入蛋白酶 位點(diǎn)，在融合蛋白完成表達(dá)和純化后，加入蛋白酶切除蛋白質(zhì)標(biāo)簽。這樣在融合標(biāo)簽切除過(guò) 程中如何避免產(chǎn)生非天然N端氨基酸或者產(chǎn)生特異的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用過(guò)程 中所面臨的挑戰(zhàn)。而SUMO不僅是較好的促溶蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)簽之一，更重要的是，SUMO融合標(biāo)簽可以 在體外被源于酵母的SUMO特異的蛋白質(zhì)水解酶Ulpl極為高效和特異地切除，從而獲得與 天然靶蛋白完全相同的重組蛋白質(zhì)，滿足結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和醫(yī)療用途的蛋白質(zhì)需要。但使用水解酶Ulpl進(jìn)行去SUMO化處理時(shí)，現(xiàn)尚沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)單合適的操作平臺(tái)， Ulpl酶的獲得需要繁瑣的純化過(guò)程，同時(shí)Ulpl的加入也會(huì)給目標(biāo)蛋白的純化及其后續(xù)處理帶來(lái)了不便，因此，需要一種能夠十分簡(jiǎn)便而又能高通量的進(jìn)行去SUMO化的系統(tǒng)，從而 能夠很好的解決上述問(wèn)題，簡(jiǎn)化去除SUMO融合標(biāo)簽的操作。ChBD作為一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于膽堿或者膽堿類似物有很強(qiáng)的親和吸附能力， 能夠特異性的吸附在二乙氨乙基纖維素(DEAE cellulose)上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種固相化SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供固相化SUMO化系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供固相化SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種固相化去SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供固相化去SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)為固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶 SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的SUMO化系統(tǒng)；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII 的SUMO化系統(tǒng)；其中，SUMO化系統(tǒng)包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移 酶Ubc9。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述SUMO激活酶SAEI的序列選自(a) SEQ ID NO 1 -M(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述SUMO激活酶SAEII的序列選自(i)SEQ ID NO :2 ；或(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的序列選自(I)SEQ ID NO :3 ；或(II)在(I)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9活性的由(I)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn) 移酶Ubc9的固相化為通過(guò)ChBD序列的連接將所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII 和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9吸附在二乙氨乙基纖維素上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述ChBD序列選自(I)SEQ ID NO :4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟:A)分別制備蛋白 pChBD-SAEI，pChBD-SAEII 和 pChBD-SUMO 轉(zhuǎn)移酶 Ubc9 ；B)將步驟 A 中制備好的 pChBD-SAEI， PChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9分別與二乙氨乙基纖維素充分混合，或?qū)⒉襟EA中 制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9分別兩兩混合，再與二乙氨乙基纖維素充分混合，或?qū)⒉襟EA中制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD_SUM0轉(zhuǎn) 移酶Ubc9與二乙氨乙基纖維素共同充分混合，以獲得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激 活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用為用于高通量鑒定可SUMO化蛋白，或用 于將可SUMO化蛋白SUMO化，以研究該可SUMO化蛋白的功能。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的SUMO水解酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述SUMO水解酶的序列選自(I)SEQ ID NO 5 ；或 SEQ ID NO 6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，SUMO水解酶的固相化通過(guò)ChBD序列吸附在二乙 氨乙基纖維素上而將水解酶固相化。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟:A)制備蛋白 pChBD-Ulpl ；B)將步驟A中制備好的pChBD-Ulpl與二乙氨乙基纖維素充分混合，以獲得固 相化SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用為在體外將SUMO化蛋白去SUMO化。使用本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便地將可SUMO化 的蛋白進(jìn)行SUMO化；使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便 地將SUMO化的蛋白去SUMO化，同時(shí)，上述固相化系統(tǒng)還可重復(fù)利用。


圖Ia為改造后的表達(dá)載體pET28a的改造部分的結(jié)構(gòu)示意圖。圖Ib為改造后的表達(dá)載體pET28a的多克隆位點(diǎn)MCS序列。圖2為pChBD-Ulpl的固相化酶催化反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1為Marker，泳 道2為未加入游離Ulpl酶，只加入催化反應(yīng)底物的陰性對(duì)照，泳道3為加入游離的Ulpl 酶的陽(yáng)性對(duì)照，泳道4為固相化pChBD-Ulpl第1次催化反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，泳道5為固相化 pChBD-Ulpl第2次催化反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，泳道6為固相化pChBD-Ulpl第3次催化反應(yīng)的檢 測(cè)結(jié)果。圖3為未優(yōu)化的固相化SAEI，SAEII, Ubc9的SUMO化反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1 為三酶全游離的檢測(cè)結(jié)果，泳道2為三酶全固相化的檢測(cè)結(jié)果，泳道3-5為雙酶固相化的檢 測(cè)結(jié)果，泳道6-8為單酶固相化的檢測(cè)結(jié)果。圖4為優(yōu)化的固相化雙酶及三酶的SUMO化反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1為三酶全 游離的檢測(cè)結(jié)果，泳道2為三酶全固相化的檢測(cè)結(jié)果，泳道3-5為雙酶固相化的檢測(cè)結(jié)果。圖5為優(yōu)化的固相化SAEI，SAEII雙酶的SUMO化反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1_3分 別為同時(shí)固相化SAEI，SAEII雙酶，催化SUMO化反應(yīng)的第一次至第三次的催化反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式蛋白及其衍生的蛋白本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的衍生形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50 個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè) 以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)或 多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有相應(yīng)活性。可采用輻射或暴露于誘變劑下來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知 的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)獲得上述衍生的蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術(shù)語(yǔ)還包括蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與本發(fā)明蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以 及利用抗本發(fā)明蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含本發(fā) 明蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了本發(fā)明蛋白的可溶 性片段。通常，該片段具有本發(fā)明蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連 續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約 100個(gè)連續(xù)氨基酸。如本文所用，衍生蛋白是指與本發(fā)明蛋白序列可高度同源或與上述分子高度同源 的家族基因分子，所述蛋白具有相應(yīng)活性?，F(xiàn)有技術(shù)中已公開(kāi)了本發(fā)明及其同源蛋白的序列，這些本領(lǐng)域已知的蛋白均包括 在本發(fā)明中。本發(fā)明中SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII，SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9優(yōu)選獲自人。 本發(fā)明中SUMO水解酶優(yōu)選為酵母SUMO水解酶Ulpl。應(yīng)理解，獲自其它生物(與本發(fā)明如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、 65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98% 序列相同性)的其它蛋白也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和 工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。親和標(biāo)簽本發(fā)明所述的親和標(biāo)簽選自但不僅限于以下標(biāo)簽Chitin binding domain (ChBD), amino acid recognition sequence of a biotin ligase (例如 AviTag), Glutathione-S-Transferase (GST, Invitrogen), His6 hexapeptide, Strep-tag II (Sigma GenoSys), calmodulin binding peptide(CBP, KRRWKKNFIAVSMNRFKKISSSGAL, Stratagene), hemagglutinin (HA, YPYDVPDYA, BD Biosciences), FLAG(DYKDDDD, Sigma Aldrich)，Myc(EQKLISEEDL, Stratagene)。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或產(chǎn) 商推薦的條件進(jìn)行。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，按照Invitrogen公司的手冊(cè)，將Ulpl酶活定 義為1 單位 Ulpl 活性為在 20μ 1 體系(50mM Tris-HCl, pH8. 0,150mM NaCl,5mM β -mercaptoethanol)中，30°C 1小時(shí)能夠切割2ug的SUM0EGFP標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)底物的酶量。以下實(shí)施例中，使用的材料來(lái)源如下QIAEX II Gel Extraction Kit 150 試劑盒購(gòu)自 QIAGEN 公司。載體pET28a 購(gòu)自 Novagen 公司。Taq酶、溶菌酶購(gòu)自Tiangen公司，限制性內(nèi)切酶HindIII和Kpnl、NheI和Xhol、 XbaI，SalI、DNase I 均購(gòu)自 NEB 公司。pEGFP-Cl 購(gòu)自 Clontech 公司。大腸桿菌 BL21 購(gòu)自 Invitrogen。superscript III 試劑盒購(gòu)自 Invitrogen。TIANamp酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN。293T 細(xì)胞購(gòu)自 ATCC。Ulpl 酶購(gòu)自 Fulengen。TlBuffe 的配方為T(mén)ris_HCl (ρΗ7· 5) 50mM, NaCl 50mM, EDTA ImM。Ulpl 酶切反應(yīng) buffer 的配方為50mM Tris-HClpH 8. 0,150mM NaCl, 5mMβ -mercaptoethanolο實(shí)施例1、制備ChBD目標(biāo)序列1.1、引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物Primerl-10，用于擴(kuò)增制備ChBD目標(biāo)序列，其中，Primerl-IO的序列分 別如下所示Primerl 5' -GGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCA AA-3‘；Primer2 5' -CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTCAAACTTGTCTTTTGGATAAGAGCCGT CT-3‘；Primer3 5' -GCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCTGGAGGAAGC AC-3‘；Primer4 5' -ATTTCGCCTGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTGCCGTCTGTGTGCTTCCTCCAGCGG TC-3 ‘；Primer5 5' -CGACAACTCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAMATCGCTGATAAGTGGTACTA TT-3 ‘；Primer6 5' -GTACTTGACCCAGCCTGTCTTCATGGCACCTTCTTCGTTGAAATAGTACCACTTATC AG-3 ‘；Primer7 5' -ACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCC AT-3 ‘；Primer8 5' -AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAAGGCATTTGATACCATGGCGCCTTCTTTAG
Primer9 5' -CAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACTGGCAGACAGGC CA-3‘；PrimerlO 5' -TGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGTCTGGTTT-3‘。1.2、PCR 擴(kuò)增分別以Primer2和3為模板，Primerl和4為引物對(duì)；Primer6和7為模板，Primer5 和8為引物對(duì)；Primer8和9為模板，Primer7和10為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒分別純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并 將得到的3個(gè)PCR擴(kuò)增片段作為模板，以Primerl和10為引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增完成后，加入Taq酶lul，于72°C反應(yīng)30min，以在目的片段兩端加上A，然 后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒純化回收，獲得在序列兩端加A的ChBD 序列。1. 3、連接與轉(zhuǎn)化將步驟1. 2中獲得的在序列兩端加A的ChBD序列通過(guò)TA克隆插入T載體，然后 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到RbCl感受態(tài)細(xì)胞中。使用堿法抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. :4所示， 根據(jù)酶切鑒定和序列測(cè)定的結(jié)果，ChBD目標(biāo)序列轉(zhuǎn)化成功。實(shí)施例2、ChBD序列轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞2. 1、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物Primerll和Primerl2，其序列分別如下所示Primerll 5' -CCCMGCTTATGGTACATTCAGACGGCTCTTATCC-3‘；Primerl2 5' -CGGGGTACCTGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGT-3‘。其中，Primerll中下劃線標(biāo)識(shí)的序列為HindIII識(shí)別位點(diǎn)；Primerl2中下劃線標(biāo) 識(shí)的序列為KpnI識(shí)別位點(diǎn)。以實(shí)施例1. 3中獲得的質(zhì)粒為模版，以Primerll和Primerl2為引物對(duì)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，獲得ChBD擴(kuò)增序列。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。2. 2、連接與轉(zhuǎn)化使用酶HindIII和KpnI分別對(duì)經(jīng)改造的表達(dá)載體pET28a(改造部分的結(jié)構(gòu)如圖1 所示)和步驟2. 1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后使用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli 感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。然后使用堿法小量抽提質(zhì)粒，并對(duì)抽提獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，ChBD 序列轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α成功，獲得pChBD載體。實(shí)施例3、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD~Ubc9, pChBD-Ulpl 載體及 SUM01-pET28a 和 TopI_pET28a 質(zhì)粒構(gòu)建參考產(chǎn)品使用手冊(cè)，使用superscript III試劑盒，用人源的293T細(xì)胞構(gòu)建cDNA 文庫(kù)。參考產(chǎn)品使用手冊(cè)，使用TIANamp酵母基因組DNA提取試劑盒提取釀酒酵母基因組。設(shè)計(jì)引物SAEI-pF、SAEI-pR、SAEII-pF、SAEII-pR、Ubc9_pF、Ubc9_pR、Ulpl-pF、Ulpl-pR、SUM01-pF、SUMOl-pR、Topol-pF 和 Topol-pR，序列如下SAEI-pF :AATCCGGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGC ；SAEI-pR :AAGAAGAATTCCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCA ；SAEII-pF CCGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCT ；SAEII-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATCA ；Ubc9-pF GGGAATTCCATATGTCGGGGATCGCCCT ；Ubc9-pR :AACCCAAGCTTATGAGGGCGCAAACTTCTT ；Ulpl-pF :GGGAATTCCATATGGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATG ；Ulpl-pR:CCGGAATTCACTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA ；SUMOl-pF :ATGGGAATTCGGTACCCATATGTCTGACCAGGAGGCAAAA ；SUMOl-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGCTAACCCCCCGTTTGTTCCTGA ；Topo1-pF :AATAGGGCTAGCGATCGCCATGAGTGGGGACCACCTCC ；Topol-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTTCCTCTTCTTTCTT CGGCTT。以構(gòu)建好的人cDNA文庫(kù)為模板，分別以引物SAEI-pF和SAEI-pR、SAEII-pF和 SAEII-pR、Ubc9-pF 和 Ubc9_pR、SUMOl-pF 和 SUMOl-pR、以及 Topo 1-pF 和 Topol-pR 為引物 對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAEX II Gel Extraction Kit 150膠回收，獲得相應(yīng) 的基因片段，其中，SAEI基因片段序列如SEQ ID NO 1所示，SAEII基因片段序列如SEQ ID NO 2所示，Ubc9基因片段序列如SEQ ID NO 3所示。以提取的酵母基因組為模板，以Ulpl-pF，Ulpl-pR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)QIAEX II Gel Extraction Kit 150膠回收，獲得Ulpl基因片段，獲得Ulpl基因 片段如SEQ ID NO 5所示，Ulpl基因片段的全長(zhǎng)序列如如SEQ ID NO 6所示。將SAEI基因片段和SAEII基因片段通過(guò)NheI和XhoI雙酶切，并將酶切產(chǎn)物連接 入同樣經(jīng)過(guò)NheI和XhoI雙酶切的pChBD載體中，經(jīng)測(cè)序確定，得到了 N端為ChBD，C端為 SAEI 和 SAEII 的融合克隆 pChBD-SAEI 和 pChBD-SAEII。采用同樣的方法，分別得到了 N端為ChBD，C端為Ubc9的融合克隆、N端為ChBD， C 端為 Ulpl 的融合克隆 pChBD-Ubc9 和 pChBD-Ulpl，以及 pET28a_SUM01 和 pET28a_Topol。將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)其相應(yīng)的蛋白并進(jìn)行 檢測(cè)，具體操作如下接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)12 14小時(shí)；取上述培養(yǎng)菌液按1 100 比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6 0. 8，加入異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，22°C培養(yǎng)16-20h。6000rpm離心1分鐘收集菌體。然后將菌體溶于含有0. 5mg/ml溶菌酶的破菌緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加 入DNase I至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，18000rpm/min 離心15分鐘后分別取上清S，沉淀P和全菌W，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并以未誘導(dǎo)全菌Neg作 為對(duì)照。結(jié)果顯示，分別獲得了表達(dá)pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9，pChBD-Ulpl， SUMOl和TopoI的菌株。實(shí)施例4、SUM0-EGFP融合蛋白制備
4.1、引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3和P4，序列如下所示Pl :5，-GCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ ；P2 :5， -CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’ ；P3 5' -CACCTACCATGGGTCATCACCATCA-3’ ；P4 5，-GGAATTCTTTCATACCTCCAATCTGTTCGCGG-3，。其中，引物Pl和P4的下劃線為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，引物P2的下劃線為XholI識(shí)別 位點(diǎn)，引物P3的下劃線為NcoI識(shí)別位點(diǎn)。4. 2、pET28a-6His-EGFP 質(zhì)粒構(gòu)建以質(zhì)粒pEGFP-Cl為模板，以引物Pl和P2為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150回收，獲得EGFP序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。將EGFP序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a分別使用EcoRI和XhoI酶切，并連接 后，轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，經(jīng)檢測(cè)獲得pET28a-6His_EGFP質(zhì)粒。4. 3、SUM0-EGFP融合表達(dá)載體構(gòu)建以釀酒酵母基因組為模板，以引物P3和P4為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增獲得SUMO基因，然 后以NcoI和EcoRI酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET28a-6His-EGFP中，獲得SUM0-EGFP 融合表達(dá)載體。4. 4、SUM0-EGFP 融合蛋白獲得將步驟4. 3中獲得的SUM0-EGFP融合表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)Ni柱純化， 獲得SUM0-EGFP融合蛋白。實(shí)施例5、pChBD_Ulpl固相化取步驟3. 3中獲得的表達(dá)pChBD-Ulpl的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后，進(jìn)行如下操作， 以實(shí)現(xiàn)PChBD-Ulpl固相化(1) 5ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心后去除培養(yǎng)液加入600ul Tl Buffer混勻。(2)加入溶菌酶至終濃度0. 5mg/ml，冰上1小時(shí)。(3)超聲破菌(400w,40次，每次2s，間隔8s)。(4)超聲后的菌液4度離心13000rpm離心30分鐘。(5)與此同時(shí)對(duì)DEAE Beads進(jìn)行處理，每份樣品取Beads lOOul，離心以去除保存 液，并用TlBuffer洗滌3次。(6)超聲后的菌液離心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗滌后的Beads中。(7)4度混旋儀上旋轉(zhuǎn)混勻1小時(shí)以充分結(jié)合。(8)6000rpm離心1分鐘，收集結(jié)合后的上清。(9) Tl Buffer 500ul 洗滌 Beads。6000rpm 離心 1 分 中。(10)再用高鹽洗脫Buffer 500ul洗滌2次，去除雜蛋白。經(jīng)檢測(cè)，流出液中的Ulp 1含量明顯少于上清蛋白粗提物中的Ulp 1含量，從而可確 SpChBD-Ulpl固相化成功。實(shí)施例6、pChBD-Ulp 1的固相化酶催化反應(yīng)使用實(shí)施例5中獲得的pChBD-Ulpl進(jìn)行固相化酶催化反應(yīng)，其中，向底物中加入 Ulpl酶作為陽(yáng)性對(duì)照；底物中不加入U(xiǎn)lpl酶，作為陰性對(duì)照；具體步驟和條件如下
(1)結(jié)合 pChBD-Ulp 1 后的 DEAE Beads 再用 Ulpl 酶切反應(yīng)buffer 500ul 洗滌一 次。離心，洗盡上清。(2)加入U(xiǎn)lpl酶切反應(yīng)Buffer IOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，4度混旋儀反應(yīng) 過(guò)夜。(3)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為SUM0-EGFP融合蛋白2ug，Ulpl酶1U， Buffer補(bǔ)足至20ul ；陰性對(duì)照為加入SUM0-EGFP融合蛋白2ug，不加Ulpl酶，同樣補(bǔ)足 Buffer至20ul，4度混旋儀反應(yīng)過(guò)夜。(4)過(guò)夜反應(yīng)后，6000rpm離心1分鐘，取上清樣品，加入Loading Buffer于100°C 煮樣品10分鐘，留待SDS-PAGE膠電泳分析。(5)固相化的Ulpl酶在取盡上清后，再用酶切反應(yīng)buffer 500ul洗滌1次，再加 入酶切反應(yīng)bufferlOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，繼續(xù)4度混旋儀反應(yīng)8小時(shí)。(6)重復(fù)步驟⑷、(5)以進(jìn)行第三次反應(yīng)。樣品進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)圖2結(jié)果，固相化之后的Ulpl仍然具有很好的酶活性，通過(guò)簡(jiǎn)單的高鹽洗脫 過(guò)程可以將雜蛋白洗脫，只在beads上留下所需的Ulpl酶。同時(shí)，由于酶的催化反應(yīng)本身的特性，在反應(yīng)的過(guò)程中并不會(huì)被消耗，利用溫和的 反應(yīng)條件可以使固相化酶的重復(fù)利用成為可能。在4度的反應(yīng)條件下，進(jìn)行到第三次酶催 化反應(yīng)，被固相化的Ulpl仍然具有很好的活性。同時(shí)，由于Ulpl酶本身不會(huì)隨著反應(yīng)液的 洗脫而存在與反應(yīng)之后的底物中，更利于后面相應(yīng)的檢測(cè)和反應(yīng)。因此，固相化Ulpl酶催 化反應(yīng)體系存在的潛在商業(yè)價(jià)值。實(shí)施例7、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9 的固相化及催化7. 1、單酶固相化采用實(shí)施例5中的方法，將pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9分別進(jìn)行固相 化，獲得單獨(dú)固相化的 pChBD-SAEI，pChBD-SAEII, pChBD_Ubc9。7. 2、固相化單一酶的催化反應(yīng)將單獨(dú)固相化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII或pChBD-Ubc9與純化好的非固相化的 另2種相應(yīng)的酶混合，進(jìn)行催化反應(yīng)，同時(shí)，加入均為非固相化的上述3種酶進(jìn)行催化作為 陽(yáng)性對(duì)照，其中，進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，各酶濃度分別如下SAEI為500ng，SAEII為lug，Ubc9為 1. 5ug，底物為T(mén)opoI Iug和SUMO lug，其中，TopoI和SUMO由表達(dá)TopoI和SUMOl的菌株 pET28a-Topol和pET28a_SUM01分別經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)溶液進(jìn)行Western Blot檢測(cè)分析，結(jié)果如圖3所示。7. 3、固相化雙酶和固相化三酶的催化反應(yīng)將固定化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9全部混合或兩兩混合，分別獲 得固定化雙酶和固定化三酶，然后參考步驟7. 2中的方法，檢測(cè)其催化反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果顯示，在僅僅只固相化一個(gè)酶的情況下，SUMO化反應(yīng)能夠較為正常的進(jìn) 行，但當(dāng)固相化三者當(dāng)中的兩者或者三者全部固相化的時(shí)候，SUMO化的反應(yīng)已經(jīng)十分微弱， 甚至根本不能被檢測(cè)。根據(jù)上述結(jié)果，實(shí)際的酶催化反應(yīng)遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜，可能存在更多的空間結(jié)構(gòu)位點(diǎn)變化，固相化之后的酶難以在空間結(jié)構(gòu)上相互接近來(lái)完成反應(yīng)。因此，需要對(duì)其固相化過(guò) 程進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，以便于獲得能催化SUMO化反應(yīng)較為正常的進(jìn)行的固相化系統(tǒng)。7. 4、優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶體系制備將酶pChBD-SAEI和pChBD_SAEII同時(shí)進(jìn)行固相化，具體方法與實(shí)施例4中的方 法基本相同，但進(jìn)行雙酶固相化時(shí)，將步驟(6)改為，在Beads內(nèi)同時(shí)加入pChBD_SAEI和 PChBD-SAEII的蛋白粗提物，從而獲得優(yōu)化的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII雙酶固相化催化 體系。采用上述同樣的方法，分別獲得其他的優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶催化體系。7. 5、優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶的催化反應(yīng)將步驟7. 4中獲得的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII的固相化雙酶與純化好的非固 相化的pChBD-Ubc9混合，進(jìn)行催化反應(yīng)，其中，加入的SAEI為500ng，SAEII為lug，Ubc9為 1. Sug，底物為帶有 Flag tag 的 Topl-llug，SUMO lug。同時(shí)，采用同樣的條件，將步驟7. 4中獲得的其他固定化雙酶與對(duì)應(yīng)的純化好的 非固相化的酶混合，并進(jìn)行催化反應(yīng)。采用同樣的條件，使用步驟7. 4中獲得的固相化三酶催化體系進(jìn)行催化。上述催化反應(yīng)結(jié)束后，采用步驟7. 2中的方法，檢測(cè)其催化反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。上述結(jié)果顯示，在同時(shí)固相化SAEI和SAEII，并加入流動(dòng)相的Ubc9的情況下能夠 完成SUMO化的催化反應(yīng)，并且在第二次和第三次的反應(yīng)中仍然能夠完成SUMO化的催化反 應(yīng)，結(jié)果如圖5所示，但是采用其他的固定化雙酶或固定化三酶反應(yīng)體系，則無(wú)法完成SUMO 化的催化反應(yīng)。根據(jù)上述結(jié)果，同時(shí)固相化SAEI和SAEII，并加入流動(dòng)性的Ubc9，可用于SUMO化 固相化酶催化反應(yīng)，在一定程度上擴(kuò)展了 SUMO化固相化酶催化反應(yīng)體系的應(yīng)用。綜上所述，本發(fā)明提供了一種SUMO化固相化酶催化反應(yīng)體系，用于高通量鑒定可 SUMO化蛋白，或用于將可SUMO化蛋白SUMO化，以用于研究可SUMO化蛋白的功能；同時(shí)，本 發(fā)明還提供了一種去SUMO化固相化酶催化反應(yīng)體系，以獲得與天然靶蛋白完全相同的重 組蛋白質(zhì)，從而滿足結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和醫(yī)療用途的蛋白質(zhì)需要。通過(guò)一步化的結(jié)合和簡(jiǎn)單 的洗脫過(guò)程，能夠快速的獲得大量的固相化蛋白，同時(shí)由于固相化酶本身不會(huì)隨著反應(yīng)液 的洗脫而存在于反應(yīng)之后的底物中，更利于后面相應(yīng)的檢測(cè)和反應(yīng)。同時(shí)由于酶的催化反 應(yīng)本身的特性，在反應(yīng)的過(guò)程中并不會(huì)被消耗，利用溫和的反應(yīng)條件可以使固相化酶的重 復(fù)利用成為可能。因此，上述固相化酶催化反應(yīng)體系具有很好的應(yīng)用前景。即使用本發(fā)明 提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便地將可SUMO化的蛋白進(jìn)行SUMO化； 使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便地將SUMO化的蛋白去 SUMO化，同時(shí)，上述固相化系統(tǒng)還可重復(fù)利用。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120> 一種固相化SUMO化系統(tǒng)及固相化去SUMO化系統(tǒng)<130>P5091017<160>120193]<170>PatentIn version 3.10194]<210>10195]<211>3460196]<212>PRT0197]<213> 人0198]<400>10199]MetValGluLysGluGluAlaGlyGlyGlylieSerGluGluGluAla0200]1510150201]AlaGlnTyrAspArgGlnlieArgLeuTrpGlyLeuGluAlaGlnLys0202]2025300203]ArgLeuArgAlaSerArgValLeuLeuValGlyLeuLysGlyLeuGly0204]3540450205]AlaGlulieAlaLysAsnLeulieLeuAlaGlyValLysGlyLeuThr0206]5055600207]MetLeuAspHisGluGlnValThrProGluAspProGlyAlaGlnPhe0208]657075800209]LeulieArgThrGlySerValGlyArgAsnArgAlaGluAlaSerLeu0210]8590950211]GluArgAlaGlnAsnLeuAsnProMetValAspValLysValAspThr0212]1001051100213]GluAsplieGluLysLysProGluSerPhePheThrGlnPheAspAla0214]1151201250215]ValCysLeuThrCysCysSerArgAspVallieValLysValAspGln0216]1301351400217]lieCysHisLysAsnSerlieLysPhePheThrGlyAspValPheGly0218]1451501551600219]TyrHisGlyTyrThrPheAlaAsnLeuGlyGluHisGluPheValGlu0220]1651701750221]GluLysThrLysValAlaLysValSerGlnGlyValGluAspGlyPro0222]1801851900223]AspThrLysArgAlaLysLeuAspSerSerGluThrThrMetValLys0224]1952002050225]LysLysValValPheCysProValLysGluAlaLeuGluValAspTrp0226]2102152200227]SerSerGlu AlaLysAlaAlaLeuLysArgThrThrSerAspTyr0228]2252302352400229]PheLeuLeuGlnValLeuLeuLysPheArgThrAspLysGlyArgAsp0230]2452502550231]ProSerSerAspThrTyrGluGluAspSerGluLeuLeuLeuGlnlie
260265270
ArgAsnAspValLeuAspSerLeuGlylieSerProAspLeuLeuPro
275280285
GluAspPheValArgTyrCysPheSerGluMetAlaProValCysAla
290295300
ValValGlyGlylieLeuAlaGlnGlulieValLysAlaLeuSerGln
305310315320
ArgAspProProHisAsnAsnPhePhePhePheAspGlyMetLysGly
325330335
AsnGlylieValGluCysLeuGlyProLys
340345
<210>2
<211>640
<212>PRT
<213> 人
<400>2
MetAlaLeuSerArgGlyLeuProArgGluLeuAlaGluAlaValAla
151015
GlyGlyArgValLeuValValGlyAlaGlyGlylieGlyCysGluLeu
202530
LeuLysAsnLeuValLeuThrGlyPheSerHislieAspLeulieAsp
354045
LeuAspThrlieAspValSerAsnLeuAsnArgGlnPheLeuPheGln
505560
LysLysHisValGlyArgSerLysAlaGlnValAlaLysGluSerVal
65707580
LeuGlnPheTyrProLysAlaAsnlieValAlaTyrHisAspSerlie
859095
MetAsnProAspTyrAsnValGluPhePheArgGlnPhelieLeuVal
100105110
MetAsnAlaLeuAspAsnArgAlaAlaArgAsnHisValAsnArgMet
115120125
CysLeuAlaAlaAspValProLeulieGluSerGlyThrAlaGlyTyr
130135140
LeuGlyGlnValThrThrlieLysLysGlyValThrGluCysTyrGlu
145150155160
CysHisProLysProThrGlnArgThrPheProGlyCysThrlieArg
165170175
AsnThrProSerGluProlieHisCyslieValTrpAlaLysTyrLeu
GluThrGluAlaAsnAsnHisLysLysLeuSerGluPheGlylieArg
500505510
AsnGlySerArgLeuGlnAlaAspAspPheLeuGlnAspTyrThrLeu
515520525
LeuIleAsnlieLeuHisSerGluAspLeuGlyLysAspValGluPhe
530535540
GluValValGlyAspAlaProGluLysValGlyProLysGlnAlaGlu
545550555560
AspAlaAlaLysSerlieThrAsnGlySerAspAspGlyAlaGlnPro
565570575
SerThrSerThrAlaGlnGluGlnAspAspValLeulieValAspSer
580585590
AspGluGluAspSerSerAsnAsnAlaAspValSerGluGluGluArg
595600605
SerArgLysArgLysLeuAspGluLysGluAsnLeuSerAlaLysArg
610615620
SerArgIleGluGlnLysGluGluLeuAspAspVallieAlaLeuAsp
625630635640
<210>3
<211>158
<212>PRT
<213> 人
<400>3
MetSerGlylieAlaLeuSerArgLeuAlaGlnGluArgLysAlaTrp
151015
ArgLysAspHisProPheGlyPheValAlaValProThrLysAsnPro
202530
AspGlyThrMetAsnLeuMetAsnTrpGluCysAlalieProGlyLys
354045
LysGlyThrProTrpGluGlyGlyLeuPheLysLeuArgMetLeuPhe
505560
LysAspAspTyrProSerSerProProLysCysLysPheGluProPro
65707580
LeuPheHisProAsnValTyrProSerGlyThrValCysLeuSerlie
859095
LeuGluGluAspLysAspTrpArgProAlalieThrlieLysGlnlie
100105110
LeuLeuGlylieGlnGluLeuLeuAsnGluProAsnlieGlnAspPro
115120125
ProArgAsnPheAspGlySerGluValGluAlaSerGlyAsnSerAsp
115120125
ValGluSerArgSerSerGlySerArgSerSerAspValProTyrGly
130135140
LeuArgGluAsnTyrSerSerAspThrArgLysHisLysPheAspThr
145150155160
SerThrTrpAlaLeuProAsnLysArgArgArglieGluSerGluGly
165170175
ValGlyThrProSerThrSerProlieSerSerLeuAlaSerGlnLys
180185190
SerAsnCysAspSerAspAsnSerlieThrPheSerArgAspProPhe
195200205
GlyTrpAsnLysTrpLysThrSerAlalieGlySerAsnSerGluAsn
210215220
AsnThrSerAspGlnLysAsnSerTyrAspArgArgGlnTyrGlyThr
225230235240
AlaPhelieArgLysLysLysValAlaLysGlnAsnlieAsnAsnThr
245250255
LysLeuValSerArgAlaGlnSerGluGluValThrTyrLeuArgGln
260265270
IlePheAsnGlyGluTyrLysValProLyslieLeuLysGluGluArg
275280285
GluArgGlnLeuLysLeuMetAspMetAspLysGluLysAspThrGly
290295300
LeuLysLysSerlielieAspLeuThrGluLyslieLysThrlieLeu
305310315320
IleGluAsnAsnLysAsnArgLeuGlnThrArgAsnGluAsnAspAsp
325330335
AspLeuValPheValLysGluLysLyslieSerSerLeuGluArgLys
340345350
HisLysAspTyrLeuAsnGlnLysLeuLysPheAspArgSerlieLeu
355360365
GluPheGluLysAspPheLysArgTyrAsnGlulieLeuAsnGluArg
370375380
LysLyslieGlnGluAspLeuLysLysLysLysGluGlnLeuAlaLys
385390395400
LysLysLeuValProGluLeuAsnGluLysAspAspAspGlnValGln
405410415
LysAlaLeuAlaSerArgGluAsnThrGlnLeuMetAsnArgAspAsn
20
420425430
IleGlulieThrValArgAspPheLysThrLeuAlaProArgArgTrp
435440445
LeuAsnAspThrlielieGluPhePheMetLysTyrlieGluLysSer
450455460
ThrProAsnThrValAlaPheAsnSerPhePheTyrThrAsnLeuSer
465470475480
GluArgGlyTyrGlnGlyValArgArgTrpMetLysArgLysLysThr
485490495
GlnIleAspLysLeuAspLysliePheThrProlieAsnLeuAsnGln
500505510
SerHisTrpAlaLeuGlylielieAspLeuLysLysLysThrlieGly
515520525
TyrValAspSerLeuSerAsnGlyProAsnAlaMetSerPheAlalie
530535540
LeuThrAspLeuGlnLysTyrValMetGluGluSerLysHisThrlie
545550555560
GlyGluAspPheAspLeulieHisLeuAspCysProGlnGlnProAsn
565570575
GlyTyrAspCysGlylieTyrValCysMetAsnThrLeuTyrGlySer
580585590
AlaAspAlaProLeuAspPheAspTyrLysAspAlalieArgMetArg
595600605
ArgPhelieAlaHisLeulieLeuThrAspAlaLeuLys
610615620
2權(quán)利要求
一種固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述固相化SUMO化系統(tǒng)為固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的SUMO化系統(tǒng)；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系統(tǒng)；其中，所述SUMO化系統(tǒng)包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9。
2.如權(quán)利要求1所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI的序 列選自(a)SEQ ID NO 1 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEII的序 列選自(i)SEQ ID NO 2 ；或( )在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的序 列選自(I)SEQID NO 3 ；或(II)在(I)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 轉(zhuǎn)移酶Ubc9活性的由(I)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI，SUMO 激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的固相化為通過(guò)親和標(biāo)簽的連接將所述SUMO激活酶 SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9吸附在與親和標(biāo)簽有親和結(jié)合作用的介質(zhì)上。
6.如權(quán)利要求5所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述親和標(biāo)簽選自但不僅限 于以下標(biāo)簽Chitin binding domain (ChBD), AviTag, Glutathione-S-Transferase (GST), His6hexapeptide, calmodulin binding protein (CBP), protein C tag, hemagglutinin (HA) tag, a FLAG tag 禾口 Myc tag。
7.如權(quán)利要求5所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI，SUMO 激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的固相化為通過(guò)ChBD序列的連接將所述SUMO激活酶 SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9吸附在二乙氨乙基纖維素上。
8.如權(quán)利要求7所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述ChBD序列選自(1)SEQID NO 4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
9.如權(quán)利要求7所述的固相化SUMO化系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟A)分別制備蛋白pChBD-SAEI，pChBD-SAEII 和 pChBD-SUMO 轉(zhuǎn)移酶 Ubc9 ；B)將步驟A中制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD_SUM0轉(zhuǎn)移酶Ubc9分 別與二乙氨乙基纖維素充分混合，或?qū)⒉襟EA中制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9分別兩兩混合，再與二乙氨乙基纖維素充分混合，或?qū)⒉襟EA中制 備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9與二乙氨乙基纖維素共同充 分混合，以獲得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟B后還包括高鹽洗脫以去除雜蛋白 的步驟。
11.如權(quán)利要求1或5所述的固相化SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為用于 高通量鑒定可SUMO化蛋白，或用于將可SUMO化蛋白SUMO化以用于研究所述蛋白的功能。
12.—種固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的 SUMO水解酶。
13.如權(quán)利要求12所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶的序列 選自(1)SEQ ID NO :5 ；或 SEQ ID NO :6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
14.如權(quán)利要求12所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化 為通過(guò)親和標(biāo)簽的連接將所述SUMO水解酶吸附在與親和標(biāo)簽有親和結(jié)合作用的介質(zhì)上。
15.如權(quán)利要求14所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述親和標(biāo)簽選自但不 僅限于以下標(biāo)簽Chitin binding domain(ChBD), AviTag, Glutathione-S-Transferase (GST), His6hexapeptide, calmodulin binding protein (CBP) , protein C tag, hemagglutinin (HA) tag, a FLAG tag 禾口 Myc tag。
16.如權(quán)利要求14所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化 為通過(guò)ChBD序列的連接將所述SUMO水解酶吸附在二乙氨乙基纖維素上。
17.如權(quán)利要求16所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述ChBD序列選自(1)SEQID NO 4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
18.如權(quán)利要求16所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟A)制備蛋白pChBD-SUMO水解酶；B)將步驟A中制備好的pChBD-SUMO水解酶與二乙氨乙基纖維素充分混合，以獲得固相 化去SUMO化系統(tǒng)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，在步驟B后還包括高鹽洗脫以去除雜蛋白 的步驟。
20.如權(quán)利要求12或14所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為 在體外將SUMO化蛋白去SUMO化，以獲得與天然靶蛋白序列完全相同的重組蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種固相化SUMO化系統(tǒng)及一種固相化去SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9的SUMO化系統(tǒng)；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系統(tǒng)；其中，SUMO化系統(tǒng)包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9。固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的水解酶Ulp1。使用本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便地將可SUMO化的蛋白進(jìn)行SUMO化；使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應(yīng)條件下簡(jiǎn)便地將SUMO化的蛋白去SUMO化，同時(shí)，上述固相化系統(tǒng)還可重復(fù)利用。
文檔編號(hào)C12N11/12GK101886068SQ20091005100
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者楊淑偉, 程夏楷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院