專利名稱：與黃瓜單性花控制基因m緊密連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，具體是與黃瓜單性花控制基因M 緊密連鎖的分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativusL.)是葫戸禾斗(Cucurbitaceae)舌甘瓜屬(cucumis)
一年蔓生的草本植物，由于其多樣的性型分化，在大量的生理學(xué)和遺傳學(xué)的基礎(chǔ) 上，黃瓜已逐漸成為研究植物性型分化的模式材料。常見的黃瓜品種是雌雄花獨(dú)
立著生的異花同株型(monoecious);不過某些品種也會(huì)出現(xiàn)兩性花 (hermaphrodite)。黃瓜單性花性狀研究始于1921年， 一般認(rèn)為單性花(不完 全花，雌花或雄花)是黃瓜的野生性狀，其對(duì)兩性花(完全花)性狀具有顯性作 用。單性/兩性花性狀由M/m (monoecious)基因控制，其與黃瓜全雌性控制基 因F (female)共同作用，控制黃瓜的主要性型分化。
由單性花(雌花)發(fā)育成的果實(shí)一般為長(zhǎng)條狀，瓜條長(zhǎng)寬比較大，符合大 眾的食用傳統(tǒng)；由兩性花發(fā)育成的果實(shí)為球形，因其不具有消費(fèi)習(xí)慣優(yōu)勢(shì)，故在 長(zhǎng)期育種實(shí)踐中培育的品種較少。但有文獻(xiàn)表明，兩性花黃瓜品種具有明顯高于 單性花株的結(jié)實(shí)率；兩性花株的始座果節(jié)位也明顯低于單性花株。這兩方面的因 素決定了兩性花株的單株總產(chǎn)量要高于單性花株。另外，也有報(bào)道稱兩性花株的 生長(zhǎng)速度快于單性花株。更為重要的是，單基因位點(diǎn)決定性型分化是葫蘆科甜瓜 屬(還包括甜瓜)所特有的表型。該基因位點(diǎn)的克隆和作用方式的闡明將豐富植 物性型決定機(jī)制。不難預(yù)見，如果以該基因作為工具，改造其它植物，特別是在 植物界絕大部分比例的自花授粉植物，將可能產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。
對(duì)黃瓜單性花性型決定M基因分子水平的研究主要開始于2000年以后。有 多篇文獻(xiàn)報(bào)告試圖從基因的表達(dá)差異入手克隆該基因，但均沒有獲得滿意的結(jié) 果。2008年，Liu等和Li等利用不同的植物分離群體分別對(duì)M基因進(jìn)行了分子 標(biāo)記定位，前者用一個(gè)來源近等基因系親本構(gòu)建的96株F2群體將M基因定位在 一個(gè)2.5 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)；后者使用兩個(gè)栽培品種配置的約900株的F2群體將M基因定位在6. 1 cM的區(qū)間內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)在該群體內(nèi)與M基因共分離的標(biāo)記 S—ME8SA7。詳細(xì)結(jié)果可以參看Liu， S.Q等在《Theoretical and A卯lied Genetics》(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2008年第117期927—933頁(yè)發(fā)表的題為《Genetic association of ET肌ENE-INSENSITIVE3-like sequence with the sex-determining M locus in cucumber (Cucumis sativus L.)》(黃瓜性另ll決 定M位點(diǎn)與類乙烯響應(yīng)基因ETHYLENE-INSENSITIVE3序列的遺傳相關(guān)性) 一文， 以及Li， Z等在《TheoreticalandA卯liedGenetics》(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2008 年第117期1253—1260頁(yè)發(fā)表的題為《Development and fine mapping of three co-dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant (Cucumis sativus L.)》(三個(gè)與黃瓜M/m基因連鎖的共顯性SCAR標(biāo)記的開發(fā)及 精細(xì)定位) 一文。但上述標(biāo)記還存在分析群體相對(duì)較小，連鎖距離相對(duì)較遠(yuǎn)等問 題，還不足以克隆M基因位點(diǎn)的候選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供與黃瓜單性花控制基因M緊密 連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的3個(gè)分子標(biāo)記與M基因位點(diǎn)連鎖更加緊密，對(duì)關(guān)于單 性花/兩性花的黃瓜分子標(biāo)記輔助育種體系的建立更有幫助；本發(fā)明的分子標(biāo)記 可以簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于黃瓜育種實(shí)踐。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及的第一種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由序列表 中SEQ ID NO. 1所示的223個(gè)核苷酸和SEQ ID NO. 2所示的221個(gè)核苷酸組成； 其中223個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，221個(gè)核苷酸的片段與兩性花基 因m連鎖。
所述與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 7所示上游 引物和SEQ ID N0.8所示的下游引物擴(kuò)增得到。
本發(fā)明涉及的第二種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由序列表 中SEQ ID NO. 3所示的155個(gè)核苷酸和SEQ ID NO. 4所示的157個(gè)核苷酸組成； 其中155個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，157個(gè)核苷酸的片段與兩性花基 因m連鎖。
所述與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由SEQ ID N0.9所示的上 游引物和SEQ ID NO. IO所示的下游引物擴(kuò)增得到。本發(fā)明涉及的第三種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由序列表中 SEQ ID NO. 5所示的110個(gè)核苷酸和SEQ ID NO. 6所示的108個(gè)核苷酸組成；其 中IIO個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，108個(gè)核苷酸的片段與兩性花基因 m連鎖o
所述與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 11所示的上 游引物和SEQ ID N0.12所示的下游引物擴(kuò)增得到。
本發(fā)明利用單性花自交系親本S52和兩性花自交系親本H34雜交獲得Ft代， F:植株再自交獲得較大的F2分離群體。隨后利用標(biāo)記S—ME8SA7篩選該擴(kuò)大的群 體，在該標(biāo)記和M/m基因位點(diǎn)間獲得兩個(gè)交換單株。同時(shí)利用該標(biāo)記篩選黃瓜基 因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)，獲得含有該標(biāo)記片段的BAC克隆B78。該BAC 克隆經(jīng)末端測(cè)序獲得兩末端序列，并利用B78克隆T7末端序列信息篩選BAC文 庫(kù)，獲得了第二個(gè)BAC克隆B07。對(duì)克隆B07進(jìn)行鳥槍法測(cè)序并拼接后獲得該克 隆全長(zhǎng)約80.6 kb序列，并利用該序列開發(fā)出SSR標(biāo)記R70。經(jīng)連鎖分析發(fā)現(xiàn)， R70也同S—ME8SA7 —樣位于M基因位點(diǎn)同側(cè)，但與M位點(diǎn)僅存在1個(gè)交換單株。 在此基礎(chǔ)上，利用BAC克隆B07的一側(cè)不與BAC克隆B78重疊的序列信息篩選 BAC文庫(kù)，獲得第三個(gè)獨(dú)立的BAC克隆B58。仿照B07相同的方法獲得了約100. 8 kb的序列信息，并利用該序列開發(fā)出SSR標(biāo)記R81和R84。經(jīng)連鎖分析，這兩個(gè) 標(biāo)記相對(duì)于S—ME8SA7均M基因位點(diǎn)的異側(cè)，R81與M基因位點(diǎn)存在3個(gè)交換單 株，而R84與M基因位點(diǎn)存在兩個(gè)交換單株。基于以上結(jié)果，在約2700單株分 離群體中，本發(fā)明將M基因位點(diǎn)定位在一個(gè)包含3個(gè)交換單株，約50kb的黃瓜 基因組區(qū)間內(nèi)；上述黃瓜染色體步移的詳細(xì)情況可參看本發(fā)明說明書圖5。
本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的3個(gè)分子標(biāo)記與M基因的連鎖程度
在所有已知的標(biāo)記中最為緊密，由它們構(gòu)建的局部遺傳圖譜密度極高，已將M基 因限定在了一個(gè)〈lcm的遺傳區(qū)間內(nèi)；由于所有3個(gè)標(biāo)記的開發(fā)均與BAC克隆相 關(guān)，由此而獲得的黃瓜M基因局部物理圖譜將有利于M基因的最終克隆。
本發(fā)明中涉及的分子標(biāo)記S—ME8SA7已公開，可參看Li ， Z等在《Theoretical and Applied Genetics》(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2008年第117期1253 1260頁(yè)發(fā) 表的題為《Development and fine mapping of three co_dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant (Cucumis sativus L.)》(三 個(gè)與黃瓜M/m基因連鎖的共顯性SCAR標(biāo)記的開發(fā)及精細(xì)定位) 一文；
5本發(fā)明中涉及的黃瓜基因組BAC文庫(kù)的篩選操作已公開，可參看Guam Y 等在《Progress of Natural Science》(自然科學(xué)進(jìn)展)2008年第18期143 147頁(yè)發(fā)表的題為{Construction of a BAC library from cucumber (Cucumis sativus L) and identification of linkage group specific clones》(黃瓜 BAC文庫(kù)的構(gòu)建及連鎖群特異克隆的鑒定) 一文；
本發(fā)明中PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序中所使用的E. coli DH5 ct菌株已在文獻(xiàn)《李欣， 等。電轉(zhuǎn)化法制備高轉(zhuǎn)化效率的E.coli感受態(tài)細(xì)胞研究。食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2007， 26 (6) 48 51》中公開；本發(fā)明中涉及的E. coli DH5 a菌株可通過公開 市售的商業(yè)渠道取得，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址大連經(jīng)濟(jì) 技術(shù)開發(fā)區(qū)東北二街19號(hào)。


圖1是SSR標(biāo)記R70對(duì)黃瓜親本材料S52， H34， F:世代單株及在&群體隨 機(jī)單株的檢測(cè)結(jié)果；
圖2是SSR標(biāo)記R81對(duì)黃瓜親本材料S52， H34， F,世代單株及在&群體隨
機(jī)單株的檢測(cè)結(jié)果；
圖3是SSR標(biāo)記R84對(duì)黃瓜親本材料S52， H34， R世代單株及在&群體隨
機(jī)單株的檢測(cè)結(jié)果；
圖4是本發(fā)明中3個(gè)SSR標(biāo)記與M基因位點(diǎn)的連鎖情況； 圖5是本發(fā)明中黃瓜染色體步移的詳細(xì)情況說明。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按 照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明中涉及的鑒定SSR標(biāo)記位點(diǎn)的R印eatMasker軟件可通過網(wǎng)址 http:〃www. r印eatmasker. org/免費(fèi)下載s
本發(fā)明中涉及的BAC克隆末端和鳥槍全測(cè)序由北京華大基因研究中心提供
技術(shù)服務(wù)，地址北京順義空港科技創(chuàng)業(yè)園B-6;
本發(fā)明涉及的其它常規(guī)測(cè)序(包括PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序)均由上
海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供技術(shù)支持，地址上海市松江區(qū)車墩工業(yè)
6區(qū)香閔路698號(hào)。 實(shí)施例1
步驟一，遺傳分離群體的構(gòu)建與交換單株的鑒定
1. &分離群體的構(gòu)建
歐洲溫室類型自交系H34 (父本)，兩性花品種，正常生長(zhǎng)條件下全株著生 兩性花，植株生長(zhǎng)速度較快，成熟果實(shí)成球型，深綠色；華南類型自交系S52(母 本)，單性花品種，植株生長(zhǎng)早期(較低節(jié)位)著生雄花，隨后雄花雌花交替分 布，生長(zhǎng)后期(較高節(jié)位)完全著生雌花，植株生長(zhǎng)速度較慢，成熟果實(shí)長(zhǎng)條狀， 白色；前述父本及母本材料均可通過公開渠道獲取。二者雜交獲得R子代，單性 花株(強(qiáng)雌株)，果實(shí)長(zhǎng)條狀，墨綠色。自交系S52、 H34、 R子代和單性花株/ 兩性花株判斷標(biāo)準(zhǔn)，可參看Li， Z等在((Theoretical and Applied Genetics》 (理論應(yīng)用遺傳學(xué))2008年第117期1253 1260頁(yè)發(fā)表的題為《Devel叩ment and fine mapping of three co-dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant (Cucumis sativus L.)》(三個(gè)與黃瓜M/m基因連鎖的共顯 性SCAR標(biāo)記的開發(fā)及精細(xì)定位) 一文。本實(shí)施例利用Fi代自交產(chǎn)生F2代群體。 共種植約2700株F2單株，鑒定單性花株/兩性花株，卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證。
2. 交換單株的篩選
① 黃瓜基因組DNA的提取
用CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。方法為取上部幼嫩葉片 在液氮中快速研磨成粉末狀，放于1.5ml的離心管中；加入預(yù)熱的50(^1 CTAB 提取緩沖液，6(TC水浴0.5 h lh;加入等體積氯仿異戊醇，其中氯仿與異戊醇 的體積比為24: 1，混勻后12000r/min 4°C離心10min;將上清液轉(zhuǎn)入新的離 心管，加等體積異丙醇，輕輕混勻，冰浴0. 5h以上；12000r/min 4°C離心10min; 倒去上清液，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇沖洗沉淀兩次，干燥后，加入TE緩沖液 150nl溶解后，加入10pg/ml的RNA酶去除RNA， 37'C水浴30min;在0. 8%瓊脂 糖凝膠電泳，以50ng/Vl的XDNA為標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)所得DNA的濃度；后用TE稀釋終 濃度為30ng/Vl，存于-2(TC備用。
② 標(biāo)記掃描F2分離群體
利用與已有的與M基因連鎖的分子標(biāo)記(S_ME8SA7)和本發(fā)明中開發(fā)的3 個(gè)分子標(biāo)記(R70， R81， R84)掃描上述獲得的&分離群體，尋找標(biāo)記基因型(通過分析顯隱親本獲得)與性狀表現(xiàn)型(單性花/兩性花)的差別單株，獲得標(biāo)記 與M基因的交換單株。PCR體系基因組DNA30ng，引物0.2 pmol/L, 200 |_imol/L dNTPs， 2mmol/LMgCl2， lxTaq緩沖液，0. 5 U TaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 HL，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5 min; 35cycles， 94°C 30s; 55°C 30s; 72°C 30s; 72。C 5min。上述PCR產(chǎn)物檢測(cè)方 法為標(biāo)記S一ME8SA7使用3%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果；其余(R70， R81， R84) PCR產(chǎn)物使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。
聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液為1XTBE， 50W恒功率，電泳lh。電泳后進(jìn)行 銀染。銀染方法為將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上輕輕搖動(dòng)至指示劑 顏色褪去，其中固定液的組成為冰醋酸、無水乙醇、蒸餾水的體積比為1:10:100; 用超純水洗lmin 3min;將沖洗后的膠板放入染色液中搖動(dòng)半小時(shí)，其中染色 液的組分為2g/L硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影 液的塑料盒中，輕輕搖動(dòng)至條帶清晰，放入自來水中沖洗3min;室溫下干燥， 干燥后拍照，其中顯影液是在1L蒸餾水中加入15gNaOH和3ml甲醛混勻得到的。
③多態(tài)性片段的回收、克隆和測(cè)序
將多態(tài)性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加 入超純水沖洗三遍，然后加入10 ul超純水95。C水浴15min，快速離心取上清液， 用相對(duì)應(yīng)的SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為目標(biāo)條帶DNA 5 ul，引 物O. 5咖ol/L， 200 umol/L dNTPs， 1XT叫Buffer, 1. 5誦ol/L MgCl" 2U Taq DNA聚合酶，總反應(yīng)體系為50ul，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Pro鵬ga公司。目標(biāo) 條帶PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min; 35cycles， 94。C 30s; 50°C 30s; 72°C lmin; 72°C 5min。將PCR產(chǎn)物中加入goldview熒光染料3ul， 4'C下放置10rain讓染 料同DNA結(jié)合，然后加入上樣緩沖液2ul，混勻后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離， 在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入1. 5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收，其中 DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號(hào)為 Cat. No. SKI 132。將回收產(chǎn)物與載體連接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector 系統(tǒng)。用電擊法將連有目標(biāo)片段的T-vector轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞， 將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，涂好的平板倒置于37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng) 過夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測(cè)，進(jìn)行相關(guān)序列的測(cè)定。
步驟二，染色體步移與標(biāo)記開發(fā)1. 黃瓜基因組BAC文庫(kù)的掃描
本發(fā)明中前后共使用3個(gè)PCR標(biāo)記對(duì)黃瓜基因組BAC文庫(kù)進(jìn)行掃描篩選， 分別為利用先前報(bào)道的標(biāo)記S—ME8SA7掃描BAC文庫(kù)獲得含有該片段的克隆B78; 利用B78克隆T7端序列信息設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增片段掃描文庫(kù)獲得另一個(gè)含有該片段 信息的克隆B07;利用B07克隆T7端序列信息設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增片段掃描文庫(kù)獲得 另一個(gè)含有該片段信息的克隆B58。所有PCR反應(yīng)體系均為BAC文庫(kù)質(zhì)粒20ng， 雙向引物各O. 2 (amol/L， 200 pmol/L dNTPs， 2腿ol/L MgCl2， lxTaq緩沖液， 0. 5U TaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10^1，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公 司。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min; 40cycles， 94°C 20s， 65°C 30s， 72°C 30s; 72 °C 5min， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果。
2. 遺傳分子標(biāo)記的開發(fā)
本發(fā)明對(duì)獲得的第二個(gè)BAC克隆B07進(jìn)行了全長(zhǎng)測(cè)序，根據(jù)序列信息，本 發(fā)明尋找到3個(gè)潛在的SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物在兩親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增并使用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)SSR位點(diǎn)在兩親本間可以產(chǎn)生差 異(圖1)，隨后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序并獲得SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2中的序列信 息，該標(biāo)記命名為R70。
本發(fā)明對(duì)獲得的第三個(gè)BAC克隆B58進(jìn)行了全長(zhǎng)測(cè)序，根據(jù)序列信息，本 發(fā)明尋找到5個(gè)潛在的SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物在兩親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增并使用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)SSR位點(diǎn)在兩親本間可以產(chǎn)生差 異(圖2，圖3)，隨后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序并獲得SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4及SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6中的序列信息，這兩個(gè)標(biāo)記分別被命名為R81和R84。
以上3個(gè)新開發(fā)的分子標(biāo)記經(jīng)過分離群體驗(yàn)證，均與M基因位點(diǎn)緊密連鎖 (圖4，圖中X表示交換事件)。由于都是特異性PCR擴(kuò)增，故這些標(biāo)記具有高 穩(wěn)定。利用這些標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳和物理圖譜，將有助于黃瓜單性花基因的 最終克隆。
9序列表
<110>上海交通大學(xué)
〈120〉與黃瓜單性花控制基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記 <160> 12 <210> 1 <211> 223 <212> DNA
<213>黃瓜(Cucumis sativus L ) <400> 1
GACATGATGGAGAGGGAMG TGACACCTATTTTGTCAAAATACTATATATATATATATAT60
ATATATATATMMTTAGAT GATMAGACCCTTTTATAAATAAATATCCCATTTCAAATT120
TTMMTGTTTGGTGGATTA TMTTTGGMTTTTACATTTTGGAATAGTCACCATTTTAT180
AATGTTTTAAMTTGAMTT AGGGTACATGAGATGAGGMGM 223
<210> 2
<211> 221
<212>腿
<213>黃瓜(Cucumis sativus L )
〈400〉 2
GACATGATGGAGAGGG嵐G TGACACCTATTTTGTCAAAATACTATATATATATATATAT60
ATATATATMMTTAGATGA TAAAGACCCTTTTATMATAMTATCCCATTTCAMTTTT120
嵐ATGTTTGGTGGATTATA ATTTGGAATTTTACATTTTGGMTAGTCACCATTTTATM180
TGTTTTAAAATTGAAATTAG GGTACATGAGATGAGGMGAA 221
<210> 3
<211〉 155
<212> DNA
〈213〉黃瓜(Cucumis sativus L )
<400> 3
AGGMAGGAATATTMCCTC CCTACCTTTTTATTTATTTATTATTTCTATTAGCCTMTG60
AGMTGCATCAAMGAAGAA MTTATATATATATATATATATTCTCCTTCAAATTATACT120
TTTGCMACA TTTATCTATA CCTATGTTGT TATGA 155<210〉 4 〈211〉 157 <212> DNA
<213>黃瓜(Cu固is sativus L.) <400> 4
AGG嵐GGAA TATTMCCTC CCTACCTTTT TATTTATTTA TTATTTCTAT TAGCCTMTG 60 AGMTGCATC AAMGMGAA MTTATATAT ATATATATAT ATATTCTCCT TCAAATTATA 120 CTTTTGC嵐CATTTATCTA TACCTATGTT GTTATGA 157
<210> 5 <211> 108 <212> DNA
<213>黃瓜(Cuc咖is sativus L ) <400> 5
ATGCTCAGGT TCATGGATTG GGAMGATCG GCTCAGACM AGTCAGGAGT CATATATATA 60 TATATATGTC TCCACTCGM TTCTGGGGCC AGCTCCCTCA AAAAAATA 108
<210> 6 <211> 110 <212> DNA
<213>黃瓜(Cuc咖is sativus L ) <柳〉6
ATGCTCAGGT TCATGGATTG GGAMGATCG GCTCAGACM AGTCAGGAGT CATATATATA 60 TATATATATG TCTCCACTCG MTTCTGGGG CCAGCTCCCT CAAAAAMTA 110
<210> 7 <211> 22 <212>腿 <213〉人工序列 <400> 7
GACATGATGG AGAGGGMAG TG 22
11<210> 8 〈211> 23 <212>靈 <213>人工序列 〈400〉 8
TTCTTCCTCA TCTCATGTAC CTA 23
<210> 9 <211> 21 <212> ■ <213>人工序列 <400> 9
AGGAAAGGAA TATTMCCTC C 21
<210> 10 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 〈400〉 10
TCATAACMC ATAGGTATAG AT 22
<210〉 11 <211> 20 <212>靈 <213>人工序列 <400> 11
ATGCTCAGGT TCATGGATTG 20
<210〉 12 <211> 20 <212>廳 <213>人工序列 〈400> 12
TATTTTTTTG AGGGAGCTGG 20 。
權(quán)利要求
1、一種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由序列表中SEQ ID NO.1所示的223個(gè)核苷酸和SEQ ID NO.2所示的221個(gè)核苷酸組成；其中223個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，221個(gè)核苷酸的片段與兩性花基因m連鎖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征是，由SEQ ID NO. 7所示上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物擴(kuò)增得到。
3、 一種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由序列表 中SEQ ID NO. 3所示的155個(gè)核苷酸和SEQ ID NO. 4所示的157個(gè)核苷酸組成； 其中155個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，157個(gè)核苷酸的片段與兩性花基 因m連鎖。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征是，由SEQ ID NO. 9所示的上游引物和SEQ ID NO. 10所示的下游引物擴(kuò)增得 到。
5、 一種與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由序列表 中SEQ ID NO. 5所示的110個(gè)核苷酸和SEQ ID NO. 6所示的108個(gè)核苷酸組成； 其中IIO個(gè)核苷酸的片段與單性花基因M連鎖，108個(gè)核苷酸的片段與兩性花基 因m連鎖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的與黃瓜單性花基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征是，由SEQ ID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO. 12所示的下游引物擴(kuò)增得 到。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的與黃瓜單性花控制基因M緊密連鎖的分子標(biāo)記，第一種分子標(biāo)記由序列表中SEQ ID No.1所示的223個(gè)核苷酸和SEQ ID No.2所示的221個(gè)核苷酸組成；第二種分子標(biāo)記由序列表中SEQ ID No.3所示的155個(gè)核苷酸和SEQ ID No.4所示的157個(gè)核苷酸組成；第三種分子標(biāo)記由序列表中SEQ ID No.5所示的110個(gè)核苷酸和SEQ ID No.6所示的108個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明的3個(gè)分子標(biāo)記與M基因位點(diǎn)連鎖更加緊密，對(duì)關(guān)于單性花/兩性花的黃瓜分子標(biāo)記輔助育種體系的建立更有幫助；本發(fā)明的分子標(biāo)記可以簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于黃瓜育種實(shí)踐。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101550450SQ20091005118
公開日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者何歡樂, 征 李, 潘俊松, 潤(rùn) 蔡, 陶倩怡 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)