軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測技術(shù)中的樣品前處理，尤其涉及一種軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近三十年來，海洋環(huán)境污染日趨加重，赤潮頻繁發(fā)生，軟骨藻酸作為一種興奮性脯氨酸衍生物和神經(jīng)毒素，主要由形成赤潮的一種硅藻-多列擬菱形藻產(chǎn)生，其最早是在1987年加拿大因食用紫貽貝而造成的食物中毒事件中被發(fā)現(xiàn)。軟骨藻酸可影響人和動物的消化道、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它對與內(nèi)臟功能有關(guān)的腦干區(qū)域具有興奮作用，對與記憶有關(guān)的腦區(qū)域具有明顯的神經(jīng)毒性作用。中毒者出現(xiàn)胃腸道癥狀，以及一種或多種神經(jīng)性障礙如神志不清、方位不辨、記憶力喪失，嚴(yán)重者心臟病發(fā)作、昏迷甚至死亡，中毒者即使在病愈后仍然喪失記憶長達(dá)十幾個月，因此稱之為記憶喪失性貝類中毒。軟骨藻酸作為一類與赤潮發(fā)生密切相關(guān)的神經(jīng)毒素嚴(yán)重危害漁業(yè)、水產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，并影響水生生物和人類的健康。在加拿大、美國海岸，軟骨藻酸引起的危害事件不斷被報道，目前我國檢出軟骨藻酸的報導(dǎo)十分罕見，但在我國海區(qū)，已經(jīng)檢測到多種能產(chǎn)生軟骨藻酸毒素的擬菱形藻。目前，我國關(guān)于痕量軟骨藻酸的檢測方法并不完善，尤其是針對海水的研宄非常少，因此，迫切需要研宄軟骨藻酸的新型檢測技術(shù)，建立快速、簡捷、靈敏的痕量軟骨藻酸檢測方法，為掌握該類藻毒素的信息和采取有效手段防止危害發(fā)生提供信息。
[0003]海水基質(zhì)復(fù)雜且軟骨藻酸在海水中的濃度過低，檢測前樣品必須通過預(yù)處理對痕量軟骨藻酸進(jìn)行分離富集。因此，改進(jìn)預(yù)處理方法是發(fā)展軟骨藻酸快速檢測法的重要手段。軟骨藻酸的分離富集主要采用固相萃取技術(shù)(solid phase extract1n, SPE)，目前使用較普遍的是C18柱、SAX (陰離子交換)柱、HLB柱等，這些SPE柱中的材料雖然能夠吸附軟骨藻酸，但同時也會吸附海水中的其他雜質(zhì)，對軟骨藻酸的測定造成干擾。因此需要研制新型吸附材料填入SPE柱，使之既能夠強(qiáng)力吸附軟骨藻酸，又不會或較少吸附其他物質(zhì)。分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique, MIT)是通過人工合成手段獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與模板分子完全匹配、具有分子識別功能的聚合物(即分子印跡聚合物，molecularly imprinted polymer，MIP)的一種新型實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。目前MIT已應(yīng)用于仿生傳感器、固相萃取、酶催化模擬等領(lǐng)域，其具有構(gòu)效預(yù)定性、選擇識別性和廣泛實(shí)用性等特點(diǎn)。自從1994年Sellergren將MIP用于戊脒的固相萃取之后，基于MIP的固相萃取(MISPE)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥物、生物、食品、環(huán)境樣品分析，作為檢測藥物、生物大分子、煙堿、除草劑、農(nóng)藥等的前處理技術(shù)。將MIT與SPE兩項技術(shù)聯(lián)用是目前較為新穎的研宄方向，MIP具有較高的選擇性和對目標(biāo)分子的富集能力，將其作為SPE的填充材料，可以彌補(bǔ)現(xiàn)有SPE填料選擇性差的缺點(diǎn)，從而大大提高選擇性和準(zhǔn)確性，降低檢出限，尤其適合于復(fù)雜樣品中痕量目標(biāo)物的萃取，具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的，就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱及其制備方法和應(yīng)用。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱，將模板分子1，3，5-三羧基戊烷、功能單體2-(三氟甲基)丙烯酸、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合成軟骨藻素印跡分子聚合物，填充在聚丙烯外殼的固相萃取小柱內(nèi)。
[0006]一種軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱的制備方法，包括以下步驟:
[0007]2.1在冰浴中將模板分子1，3，5-三羧基戊烷、功能單體2-(三氟甲基)丙烯酸加到致孔劑中，混勻后加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，之后加入引發(fā)劑；然后移出冰浴，通氮?dú)獬?min，密封60°C水浴反應(yīng)24h，得到蓬松的粉末狀軟骨藻素印跡分子聚合物；
[0008]2.2將所得軟骨藻素印跡分子聚合物研磨后60°C烘干，將烘干后的粉末用3層慢速定量濾紙包好，在索氏提取器中用5% (v/v)的甲酸甲醇進(jìn)行提取，提取時間為48h，水浴溫度為80°C，除去模板分子及未反應(yīng)的化合物；
[0009]2.3將索氏提取后的軟骨藻素印跡分子聚合物用堿和酸交替進(jìn)行洗脫，直至紫外分光光度計檢測不出模板分子為止，最后用甲醇將酸洗凈，60°C下烘干，過篩；
[0010]2.4稱取10mg軟骨藻素印跡分子聚合物，濕法裝填入3mL固相萃取小柱內(nèi)。
[0011]所述的模板分子1，3，5-三羧基戊烷、功能單體三氟甲基酸丙烯酸、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯的用量摩爾比為1:8:40。
[0012]所述的致孔劑為乙腈，用量為35mL。
[0013]所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，用量為10mg。
[0014]所述的過篩是用350目標(biāo)準(zhǔn)篩對聚合物進(jìn)行篩選，取小于350目的顆粒。
[0015]所述的濕法是在固相萃取小柱中裝入一塊篩板，將聚合物粉末加入2mL甲醇中配成懸濁液，將懸濁液加入固相萃取小柱中，同時用甲醇潤洗一下，真空抽干，裝入另一塊篩板，壓實(shí)，在柱中加入3mL甲醇，真空抽干后完成裝柱。
[0016]軟骨藻酸分子印跡固相萃取小柱在海水中痕量軟骨藻酸的選擇性分離富集中的應(yīng)用。
[0017]所述的富集是將海水中的軟骨藻酸濃縮500倍。
[0018]本發(fā)明合成的軟骨藻酸分子印跡聚合物是一種蓬松的粉末狀聚合物，它對軟骨藻酸分子的立體結(jié)構(gòu)具有“記憶”功能，可選擇性吸附軟骨藻酸，吸附能力強(qiáng)。本發(fā)明合成的軟骨藻酸分子印跡聚合物作為固相萃取小柱的填料，可應(yīng)用于海水中痕量軟骨藻酸的高選擇性分離富集。本發(fā)明制備的固相萃取小柱與常規(guī)的C18、SAX和HLB固相萃取小柱相比，專一性更好，對痕量軟骨藻酸的檢測效果更佳。
【附圖說明】
[0019]圖1、圖2為軟骨藻酸分子印跡聚合物的電鏡掃描圖片。
[0020]圖3為軟骨藻酸分子印跡聚合物的吸附等溫線。
[0021]圖4、圖5為不同模板分子-功能單體配比下的分子印跡聚合物吸附等溫線。
[0022]圖6為不同引發(fā)劑用量下的分子印跡聚合物吸附等溫線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0024]實(shí)施例1.
[0025]將0.2mmol模板分子1，3，5-三羧基戊烷(1，3，5-PeTA)、Immol功能單體TFMAA加到35mL致孔劑乙腈中，混勻后加入5mmol交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，之后加入1mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)，以上過程在冰浴中進(jìn)行。然后通氮?dú)獬?min，密封60°C水浴反應(yīng)24h，得到蓬松的粉末狀聚合物。上述聚合物稍加研磨后60°C烘干，通過索氏提取和酸堿交替洗脫除去模板分子及未反應(yīng)的化合物，最后用甲醇將聚合物中的酸洗凈，60°C下烘干，過350目篩，稱取10mg分子印跡聚合物，濕法裝填入3mL SPE空柱。
[0026]實(shí)施例2.
[0027]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例2的致孔劑乙腈為10mL。
[0028]實(shí)施例3.
[0029]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例3的致孔劑乙腈為20mL。
[0030]實(shí)施例4.
[0031]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例4的致孔劑乙腈為30mL。
[0032]實(shí)施例5.
[0033]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例5的致孔劑乙腈為40mL。
[0034]實(shí)施例6.
[0035]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例6的模板分子1，3，5-三羧基戊燒(1，3，5-PeTA)為 Immol。
[0036]實(shí)施例7.
[0037]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例7的模板分子1，3，5_三羧基戊烷(I, 3, 5-PeTA)為 0.Smmol η
[0038]實(shí)施例8.
[0039]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例8的模板分子1，3，5-三羧基戊烷(I, 3, 5-PeTA)為 0.25mmol。
[0040]實(shí)施例9.
[0041]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例9的模板分子1，3，5-三羧基戊烷(I, 3，5-PeTA)為 0.167mmol。
[0042]實(shí)施例10.
[0043]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例10的模板分子1，3，5_三羧基戊烷(I, 3，5-PeTA)為 0.125mmol。
[0044]實(shí)施例11.
[0045]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例11的模板分子1，3，5-三羧基戊燒(I, 3，5-PeTA)為 0.1mmol。
[0046]實(shí)施例12.
[0047]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例12的模板分子1，3，5_三羧基戊烷(I, 3, 5-PeTA)為 0.0SmmoI η
[0048]實(shí)施例13.
[0049]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例13的模板分子為己二酸。
[0050]實(shí)施例14.
[0051]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例14的模板分子為鄰苯二甲酸。
[0052]實(shí)施例15.
[0053]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例15的模板分子為4，4’ -OBA。
[0054]實(shí)施例16.
[0055]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例16的引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)為20mg。
[0056]實(shí)施例17.
[0057]與實(shí)施例1的不同之處在于:實(shí)施例17的引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)為40mg。
[0058]聚合物的形態(tài)表征:
[0059]四種模板分子的產(chǎn)物均是分散的顆粒，粒徑主要分布在幾百納米到幾微米之間。1，3，5-三羧基戊烷(1，3，5-PeTA)作為模板分子，模板分子與功能單體摩爾比為1:8時的電鏡掃面圖片如圖1圖2所示。
[0060]吸附性能評價:
[0061]本發(fā)明分子印跡聚合物的吸附變化趨勢比較平緩，在吸附的前8個小時內(nèi)，溶液中軟骨藻酸濃度逐漸降低，直至8h后達(dá)到平衡狀態(tài)，吸附動力學(xué)曲線比較平緩，較為穩(wěn)定。附圖3為分子印跡聚合物的吸附動力學(xué)曲線。
[0062]致孔劑用量的影響:
[0063]本發(fā)明以