乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取柱的制備方法及應(yīng)用，以乙氧酰胺苯甲酯為模板分子，將其溶解于致孔劑中，加入功能單體，于低溫下進行預(yù)聚合；而后加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，再加入分散劑，采用懸浮聚合法制得分子印跡聚合物微球。所得聚合物微球經(jīng)漂洗、過篩和干燥等一系列處理后，濕法填充于固相萃取柱中，經(jīng)乙腈和甲醇依次潤洗后用于食品中殘留乙氧酰胺苯甲酯的選擇性吸附、富集和純化。本發(fā)明所制備的分子印跡聚合物具有制備過程簡單，后處理方便，聚合物表面識別位點破壞少等優(yōu)點。所獲得的分子印跡固相萃取柱較已有的固相萃取柱具有特異性強、制備簡便、后處理簡單、識別性能好、成本低廉、所需儀器和反應(yīng)條件容易實現(xiàn)等特點。
【專利說明】乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體是一種乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法及其在動物性食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留分析時樣品前處理方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]乙氧酰胺苯甲酯(Ethopabate, ETP)是氨丙啉等抗球蟲藥的增效劑,對雞巨型、布氏艾美耳球蟲以及其他小腸球蟲具有較強的作用，多配成復(fù)方制劑，廣泛用于臨床，其抗球蟲作用及機理與磺胺藥和抗菌增效劑相同。2010版《中國獸藥典》(第一部)已收載其原料及制劑，規(guī)定其制劑的休藥期為7d。我國農(nóng)業(yè)部文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)牧發(fā)
[2000]235號)規(guī)定:ETP在禽的肝臟和腎臟中的最高殘留限量為1500μ g/kg，肌肉中的最高殘留限量為SOOyg/kg。
[0003]由于ETP在動物性食品中的殘留對人類健康和環(huán)境生態(tài)具有潛在的危害，建立和完善殘留監(jiān)測計劃，定期對其殘留進行監(jiān)控，是控制其殘留的有效途徑。目前，基于各類生物性抗體的免疫分析方法需要制備結(jié)合抗原和有特異性識別作用的抗體，抗體制備過程較為復(fù)雜，同時分析過程中的穩(wěn)定性和精密度都較低。ETP的儀器檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，薄層色譜法操作簡單，便于掌握且定性準確，但該方法在定量測定時，準確度和靈敏度都較低，因此，常常作為一種定性測定方法來使用。單純的色譜法檢出限較高，不能滿足痕量獸藥殘留和出口貿(mào)易檢測的實際需要，且在分析之前常需要進行樣品的凈化和富集。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的檢測靈敏度雖然很高，但價格相對昂貴，檢測成本較高。同時，許多動物性食品的基質(zhì)較為復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多，前處理步驟比較繁瑣。因此，亟需開發(fā)選擇性強和效果好的樣品前處理方法。
[0004]固相萃取(Solid Phase Extract1n, SPE)是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達到分離和富集目標化合物的目的。固相萃取作為樣品前處理技術(shù)，在實驗室中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。SPE技術(shù)自上世紀70年代后期問世以來，發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于環(huán)境、制藥、臨床醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域。與液液萃取相比，SPE具有回收率高、富集倍數(shù)高、有機溶劑消耗量低、操作簡便快速和成本低等優(yōu)點，易于實現(xiàn)自動化并可與其它分析儀器聯(lián)用。采用該方法進行樣品的前處理主要依賴于分析物與填料表面活性基團的相互作用，樣品凈化的效率和效果主要取決于填料的選擇。傳統(tǒng)的填料主要包括硅藻土、氧化鋁、CS和C18硅烷等，這些填料的選擇性較差，在對目標化合物進行分離和富集的同時，大量的樣品基質(zhì)及干擾物也會被富集，最終導(dǎo)致樣品洗脫液中出現(xiàn)含量不等的雜質(zhì)和樣品基質(zhì)，從而干擾目標化合物分離和分析的效果。
[0005]分子印跡技術(shù)作為一種能夠獲得在空間和結(jié)合位點上與某種分子完全匹配的聚合物制備技術(shù)，它具有構(gòu)效的預(yù)定性、識別的特異性和廣泛的實用性?；谠摷夹g(shù)所制備的分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)可以特異性地識別目標化合物，而且制備方法簡單，穩(wěn)定性好，能夠適用于多種環(huán)境條件，使用壽命長，可經(jīng)再生后多次重復(fù)使用，成本低廉。因此，將MIPs用于待測物質(zhì)的提取和檢測具有較為明顯的優(yōu)勢。
[0006]將分子印跡技術(shù)與SPE相結(jié)合，綜合二者的優(yōu)點，開發(fā)基于MIPs的SPE方法，將簡化樣品的前處理過程，減少檢測過程中的干擾，提高樣品前處理和分析方法的特異性。由MIPs裝填的分子印跡固相萃取柱用于復(fù)雜基質(zhì)中目標化學(xué)物的分離和富集可提高回收率和分離效果，并且具有很好的重現(xiàn)性，樣品基質(zhì)和PH值的變化對其吸附作用也無明顯影響，該方法在化學(xué)物的殘留分析中具有廣闊的發(fā)展前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有固相萃取方法的不足，采用懸浮聚合法制備ETP的MIPs微球，用作固相萃取的萃取介質(zhì)，用于動物性食品樣品中ETP的分離、富集和痕量檢測。該固相萃取柱具有識別性專一、吸附量高、制備過程簡單、成本低廉、反應(yīng)條件易于實現(xiàn)等優(yōu)點。
[0008]為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種ETP分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其步驟如下:
1)將模板分子ETP溶解于致孔劑中，加入功能單體，超聲5mim，混勻，封口，4°C冰箱預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系；
所述的致孔劑為乙腈、氯仿、乙腈-氯仿混合溶液(1:2或1:1, v/v)的任意一種,功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的任意一種或兩種的組合；所述模板分子和功能單體的比例為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為10mmol/L-150mmol/L ；
2)從冰箱中將步驟I)的混合液取出，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，超聲5min，混勻后通入氮氣5min，并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封；
所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600)二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯或四乙氧基硅烷，加入量為模板分子摩爾量的16-25倍。所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈或偶氮二異丁酸二甲酯，加入量為步驟I)所加模板分子摩爾量的0.5-1.5倍；
3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為5mL/mmol-120mL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中，備用；
所述的分散劑為，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液，其中聚乙烯醇水1788溶液配制時，先將聚乙烯醇1788加入蒸餾水中，加熱90°C _95°C使其溶解，形成0.5%_3.5%的聚乙烯醇1788溶液，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)至四口燒瓶中；
4)在氮氣保護下將步驟2)的混合溶液緩慢倒入步驟3)的四口瓶中引發(fā)聚合，通氮氣約5min，而后密封，保持400r/min的速度繼續(xù)攪拌，其中水浴溫度為50°C _70°C，聚合時間為 12h-48h ；
5)聚合反應(yīng)結(jié)束后，將步驟4)所得聚合物微球依次采用超純水、甲醇和乙醇進行多次洗滌，每次洗滌時，將洗滌液與聚合物微球混合后，渦旋混合后離心棄去上清液，其中，超純水洗滌5次，甲醇洗滌3次，乙醇洗滌3次，每次20min，之后，將離心的沉淀物50°C真空干燥；
6)將步驟5)干燥的MIPs取出稱量，放入索氏提取器中，用甲醇-乙酸混合溶液(9:1，v/v)洗脫，期間定時對新流出的提取液進行取樣，并采用高效液相色譜分析提取液中乙氧酰胺苯甲酯的含量，直至提取液中無模板分子時停止索氏提取，然后用乙腈洗脫除去雜質(zhì)分子;
7)將步驟6)的MIPs取出，50°C真空干燥至恒重，分級篩分級，獲得平均粒徑大小為50 μ m-70 μ m 的 MIPs 微球；
8)稱取步驟7)所制備的MIPs100mg-200mg，用濕法裝填固相萃取柱，依次用乙腈和甲醇潤洗，而后裝錫箔袋中備用，即得到乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明所提供的分子印跡固相萃取小柱可用于動物性食品中ETP的分離與富集，其制備過程操作簡單、方便快速，對極端環(huán)境耐受力強，較適合基層單位檢驗或現(xiàn)場處理樣品時使用。同時，還具有制備過程簡單易行、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、分離效率和回收率高、吸附容量大以及生產(chǎn)成本低等特點。
[0010]2、本發(fā)明制得的ETP分子印跡固相萃取小柱與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，所需生產(chǎn)成本低，聚合物的后處理簡單，無需研磨和裝柱，不會破壞聚合物的結(jié)構(gòu)，且所得SPE固定相的大孔結(jié)構(gòu)可以保證較快的傳質(zhì)速率和較低的柱壓，制得的萃取小柱對樣品中雜質(zhì)的特異性強、吸附量高、凈化效果好，檢測結(jié)果的精密度高，專一性強，回收率高且穩(wěn)定性好，適合推廣使用。
[0011]3、制備過程中先將ETP與功能單體在致孔劑中4°C環(huán)境下預(yù)聚合，之后再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，并滴加至分散劑中，形成懸浮聚合體系，引發(fā)聚合，獲得了粒度均勻的MIPs微球。傳統(tǒng)的本體聚合法所制備的分子印跡聚合物通常為塊狀，后續(xù)需要研磨、破碎和篩分等復(fù)雜的后處理工藝，所得顆粒為無定型顆粒，產(chǎn)率較低，這樣做不僅費時費力，而且會破壞印跡識別位點和空間結(jié)構(gòu)，使得聚合物的吸附容量、特異性、印跡和識別效率均有不同程度地降低。為了克服上述缺陷，本發(fā)明采用懸浮聚合法所制備的MIPs微球，省去了復(fù)雜的后處理工序，提高了產(chǎn)率，避免了印跡識別位點的人為破壞。由于微球的比表面積較無定形顆粒大，其吸附的速率較快，特異性吸附的容量也較大，這就使得基于微球的分子印跡固相萃取小柱具有更高的分離效率和更好的分離效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明實施例1所制備的ETP分子印跡固相萃取柱在雞肉樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；
圖2為本發(fā)明實施例2所制備的ETP分子印跡固相萃取柱在雞肝臟樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；
圖3為本發(fā)明實施例3所制備的ETP分子印跡固相萃取柱在雞肝臟樣品檢測中回收率的測定結(jié)果圖表；
圖4為本發(fā)明實施例1所制備的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡聚合物微球的掃描電鏡圖； 圖5為本發(fā)明實施例1所制備的空白分子印跡聚合物微球的掃描電鏡圖。

【具體實施方式】
[0013]以下實施例可使本專業(yè)技術(shù)人員全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0014]一種乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其制備步驟為:
1)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，超聲處理5min混勻后，放入4°C冰箱進行預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系；
所述的模板分子為乙氧酰胺苯甲酯，所述的致孔劑為乙腈和氯仿中的任意一種或兩種的組合；所述的功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2_(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的任意一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為10-150mmol/L ；
2)從冰箱中將步驟I)的混合液取出，向制得的預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，超聲處理5min,充分混勻后,通入氮氣5min,并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封,備用；
所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一種，交聯(lián)劑的加入量為模板分子摩爾量的16-25倍；
所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的任意一種，加入量為步驟I)所加模板分子摩爾量的0.5-1.5倍；
3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為5-120mL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中，備用；
所述的分散劑為，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液，其中聚乙烯醇水1788溶液配制時，先將聚乙烯醇1788加入蒸餾水中，加熱90°C _95°C使其溶解，形成0.5%_3.5%的聚乙烯醇1788溶液，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)至四口燒瓶中；
4)將步驟2)密封備用的預(yù)聚合體系在攪拌和氮氣保護下滴加入步驟3)的四口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為50°C -70°C，聚合時間為12-48h，得到微懸浮乳液，即為印跡聚合物；
5)依次采用超純水、甲醇和乙醇對步驟4)得到的印跡聚合物分別進行洗滌3-5次，將洗滌后的沉淀物在50°C真空干燥，得到分子印跡聚合物；
6)采用體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液對步驟5)得到的分子印跡聚合物進行索氏抽提，期間定時對新流出的提取液進行取樣，并采用高效液相色譜分析提取液中乙氧酰胺苯甲酯的含量，直至提取液中無乙氧酰胺苯甲酯時停止索氏提取，然后，用乙腈對分子印跡聚合物進行洗脫除去雜質(zhì)分子；
7)將步驟6)洗脫后得到的分子印跡聚合物置于50°C的真空干燥箱內(nèi)烘干至恒重，然后，采用分級篩分級，篩選出直徑為50 μ m-70 μ m的顆粒；
8)稱取步驟7)所制備的分子印跡聚合物100mg-200mg,用濕法裝填固相萃取柱,依次用乙腈和甲醇對柱子進行潤洗，然后封于錫箔袋中，即得到乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱。
[0015]根據(jù)上述方法制備的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱在食品殘留乙氧酰胺苯甲酯的選擇性吸附和富集中的應(yīng)用。其具體的使用方法為:首先用乙腈潤洗，乙腈-水溶液(1:1，V/V)平衡，加入濃縮后的樣品提取液，經(jīng)乙腈-水溶液(1:9，v/v)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v)洗脫。所述乙腈的加入量為5mL-10mL，乙腈-水溶液(1:1，v/V)的加入量為5mL-10mL，樣品提取液的加入量為lmL_5mL，乙腈-水溶液(1: 9，v/v)的加入量為5mL-10mL，甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v)的加入量為5mL_10mL。
[0016]實施例1
(一).ETP MIPs 的制備
稱取ImmoL ETP充分溶解于9mL致孔劑乙腈,加入4mmoL 4-乙烯卩比唳,超聲處理5min混勻后，放入4°C冰箱進行預(yù)聚合24h，使模板分子和功能單體充分作用，得到預(yù)聚合體系。然后向預(yù)聚合體系中加入20mmoL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.8mmoL偶氮二異丁腈,超聲處理5min,充分混勻后通入氮氣5min脫氧,并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封后備用。在進行預(yù)聚合的同時，制備分散劑，準確稱量1.5g聚乙烯醇1788加入10mL的超純水中，邊攪拌邊水浴加熱至90°C使其完全溶解，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入250mL的四口瓶中。在氮氣保護和400r/min的攪拌轉(zhuǎn)速條件下，將加有交聯(lián)劑和引發(fā)劑的預(yù)聚合體系緩慢滴加入四口瓶內(nèi)，密封，在60°C的水浴中引發(fā)聚合24h，得到微懸浮乳液，即為聚合物微球。將所得微球依次用超純水洗滌5次，甲醇洗滌3次，乙醇洗滌3次。每次洗滌時，將洗滌液和聚合物微球的固液混合物潤旋混合5min-20min,離心20min后棄去上清液,洗漆完后所得的離心沉淀物在50°C的溫度下真空干燥，所得干燥MIPs放入索氏提取器中用甲醇-乙酸混合溶液(9:1，v/v)洗脫，期間定時對新流出的提取液進行取樣，并采用高效液相色譜測定提取液中ETP的含量，直至提取液中無模板分子時停止索氏提取，然后用乙腈洗脫除去殘留溶劑和其他雜質(zhì)。洗脫后將MIPs取出，50°C真空干燥至恒重，采用分級篩分級，獲得平均粒徑大小為50 μ m_70 μ m 的 ETP 分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymer,MIP)?？瞻追肿佑≯E聚合物(Non-mo I ecu Iar Imprinting Polymer, NIP)的合成方法除不加模板分子外,其他步驟與上述方法相同。
[0017](二).乙氧酰胺苯甲酯MIPs吸附性能的表征
靜態(tài)平衡吸附量的測定:取兩支塑料離心管，在其中一支塑料離心管中加入50mg的MIPs和5mL 0.5mmol/L ETP的乙腈溶液，另一支塑料離心管中加入50mg的NIP和5mL
0.5mmol/L ETP的乙腈溶液，兩支塑料離心管均混勻，并在25°C的溫度下，以200r/min的速度振蕩24h，隨后進行離心，得到上清液，將上清液用乙腈稀釋10倍，取ImL注入高效液相色譜儀測定其平衡濃度，依據(jù)式(I)計算模板分子的吸附量Qw。
[0018]Qw =(CSt ~?；)χ^/? (I)
式中Qw為靜態(tài)平衡吸附量(mmol/g) ;(^為底物起始濃度(mmol/L) ;CS為吸附平衡時底物的濃度(mmol/L) ；V為底物溶液的體積(mL) ；m為MlP或NIP的加入量(mg)。
[0019]經(jīng)對測定結(jié)果進行分析和計算，NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.024mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.081mmol/g。依據(jù)該結(jié)果，計算聚合物微球的分離系數(shù)和印跡因子，依式(2)計算底物在聚合物和溶液兩相中的分離系數(shù)K，NIP的分離系數(shù)為0.25，MIP的分離系數(shù)為
1.86。
[0020]K = ^ ⑵:聚合物結(jié)合底物的濃度(ymol/g) ;CS:溶液中底物的平衡濃度(ymol/mL)。由式(3)計算聚合物微球的印跡因子I為7.44:1 = Κρ?ηψΖ(3)
/ pnip
其中，Kp_:ΜΙΡ的分離系數(shù)；Kpnip:NIP的分離系數(shù)。
[0021]將不同濃度的ETP乙腈溶液作為吸附液，在25°C下準確稱取10份50mg MIPs,測定它們對模板分子的吸附量，以吸附量對模板分子的濃度作圖，繪制吸附等溫曲線，將獲得的數(shù)據(jù)用于式(4)的Scatchard分析,根據(jù)Scatchard曲線的斜率與截距求出聚合物的與Kd。結(jié)果顯示結(jié)果表明MIP存在兩類吸附位點，一類是具有高結(jié)合能和高選擇性的結(jié)合位點，另一類是具有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(其Kdi=0.41 X 10_2 μ mol/L，Qmaxl=2445.52 μ mol/g ；KD2=15.2X 1(Γ2 μ mol/L，Qmax2=6243.87 μ mol/g)。而 NIP 僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(Kd=3.3 X KT1 μ mol/L, Qmax=6104.34 μ mol/g)。
[0022]Scalchard //'--: — = ^lllj^ ^ ⑷
C Kj
式中Kd為結(jié)合位點的平衡解離常數(shù)，C為模板分子的平衡濃度，Qmax為最大表觀吸附量。
[0023](三).分子印跡固相萃取柱的制備
在3mL固相萃取空柱管中放入下層篩板，將其放到固相萃取真空裝置上，打開真空泵，用3mL-5mL乙腈潤洗，備用。稱取ETP MIP 180mg,用3mL異丙醇-甲醇混合溶液(1:1，v/V)作為勻漿液，將MIP調(diào)制成混懸液，緩慢倒入固相萃取空柱管中，邊加邊輕輕敲打柱體，待勻漿液快抽干前放入上層的篩板并壓緊。依次用8mL甲醇和9mL乙腈沖洗柱子，最后對其標記，放入錫箔袋中密封備用。
[0024](四).分子印跡固相萃取柱在雞肉樣品檢測中回收率的測定 I).雞肉中ETP的提取
稱取勻漿后試樣5g于50mL具塞離心管中，加入乙腈20mL，添加ETP標準品，使其在樣品中的濃度達到農(nóng)業(yè)部235號公告中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，渦旋混勻Imin,振蕩15min, 5000r/min離心1min,上清液轉(zhuǎn)入雞心瓶中，然后再加入乙腈20mL,重復(fù)提取一次，合并上清液，隨后加入正己烷15mL，除去脂肪，合并兩次上清液，45°C水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘留物用2mL乙腈-水溶液(l:l，v/v)溶解后備用。
[0025]2).雞肉中ETP的凈化
分子印跡固相萃取柱首先用5mL乙腈潤洗，5mL乙腈-水溶液(1:1, v/v)平衡。加入濃縮后的樣品提取液2mL，經(jīng)5mL乙腈-水溶液(1:9，v/v )淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v)8mL洗脫。洗脫液過0.22 μ m的有機膜后45 °C下氮氣吹干，殘渣用ImL的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。
[0026]3).高效液相色譜法測定回收率
標準溶液的配制:用分析天平準確稱取ETP對照品，用乙腈溶解定容，分別配成濃度為
0.02 μ g/mL、0.1 μ g/mL、0.5 μ g/mL、1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL、10.0 μ g/mL 和 20.0 μ g/mL 的標準工作液。每個濃度點做5個重復(fù)，共重復(fù)5天，繪制校正曲線。
色譜條件:色譜柱 Angilent Zarbax SB C18, 250mmX 4.6mm (1.d.),流動相乙腈-水(35:65, v/v)，檢測波長268nm，進樣量10 μ L，柱溫為室溫，流速lmL/min。經(jīng)測定，其在不同基質(zhì)中的回收率見圖1的表I (每個樣品平行測定3次)所示。
[0027]實施例2
(一).ETP MIPs 的制備
制備的基本過程同實施例1，模板分子ETP的量為ImmoL，所用致孔劑為氯仿，用量為17mL，功能單體為丙烯酰胺5mmol，預(yù)聚合時間為18h，交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯17mmol,引發(fā)劑偶氮二異庚腈0.7mmoL,分散劑為150mL的娃油，引發(fā)聚合溫度55°C,聚合時間為12h，索氏萃取洗脫的時間為19h。
[0028](二).ETP MIPs吸附性能的表征
表征方法同實施例1，結(jié)果表明，NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.026mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.077mmol/g, NIP的分離系數(shù)為0.16，MIP的分離系數(shù)為0.97，印跡因子I為6.06。在MIP上存在兩類吸附位點，一類是高選擇性的結(jié)合位點，另一類是低選擇性的結(jié)合位點(其 Km=0.47 X I(T2 μ mol/L, Qmaxl=2577.46 μ mol/g ；KD2=16.3 X 1(Γ2 μ mol/L,Qmax2=5011.35 μ mol/g)。而NIP僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(KD=6.4X 10—1 μ mol/L, Qmax=6344.55 μ mol/g)。
[0029](三).分子印跡固相萃取柱的制備
稱取160mg的MIP裝入3mL的固相萃取柱空柱管中，根據(jù)實施例1中的裝柱方法制備分子印跡固相萃取柱，裝好后依次用7mL甲醇和8mL乙腈潤洗。最后對柱子標記，放入錫箔袋中密封待用。
[0030](四).分子印跡固相萃取柱在雞肝臟樣品檢測中回收率的測定
0.雞肝臟中ETP的提取
稱取勻漿后試樣5g于50mL具塞離心管中，加入乙腈25mL，添加ETP標準品，使其在樣品中的濃度達到農(nóng)業(yè)部235號公告中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，渦旋混勻Imin,振蕩20min, 7000r/min離心1min,上清液轉(zhuǎn)入雞心瓶中，然后再加入乙腈25mL,重復(fù)提取一次，合并上清液，隨后加入正己烷20mL，除去脂肪，合并兩次上清液，45°C水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘留物用3mL乙腈-水溶液(l:l，v/v)溶解后備用。
[0031]2).雞肝臟中ETP的凈化
分子印跡固相萃取柱首先用6mL乙腈潤洗，6mL乙腈-水溶液(1:1, v/v)平衡。加入濃縮后的樣品提取液3mL，經(jīng)7mL乙腈-水溶液(1: 9，v/v)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v)9mL洗脫。洗脫液過0.22 μ m的有機膜后45 °C下氮氣吹干，殘渣用ImL的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。
[0032]3).高效液相色譜法測定回收率
采用高效液相色譜法對其回收率進行了測定和計算(每個樣品平行測定3次)，色譜條件同實施例1 (見圖2的表2)。
[0033]實施例3
(一).ETP MIPs 的制備
制備的基本過程同實施例1，模板分子ETP的量為ImmoL，所用致孔劑為乙腈-氯仿混合溶液(1:1，v/v),用量為22mL,功能單體為甲基丙烯酸6mmol,預(yù)聚合時間為12h,交聯(lián)劑季戊四醇三丙烯酸酯24mmol，引發(fā)劑偶氮二異戊腈1.2mmoL，分散劑為200mL的甘油，引發(fā)聚合溫度50°C，聚合時間為36h，索氏萃取洗脫的時間為36h。
[0034](二).ETP MIPs吸附性能的表征
表征方法同實施例1，結(jié)果表明，NIP的靜態(tài)平衡吸附量為0.031mmol/g, MIP的靜態(tài)吸附量為0.083mmol/g, NIP的分離系數(shù)為0.14，MIP的分離系數(shù)為1.23，印跡因子I為8.79。在MIP上存在兩類吸附位點，一類是高選擇性的結(jié)合位點，另一類是低選擇性的結(jié)合位點(其 Km=0.38 X I(T2 μ mol/L, Qmaxl=2468.32 μ mol/g ；KD2=13.2 X 1(Γ2 μ mol/L,Qmax2=5322.44 μ mol/g)。而NIP僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(KD=4.3 X KT1 μ mol/L, Qmax=7022.15 μ mol/g)。
[0035](三).分子印跡固相萃取柱的制備
稱取150mg的MIP裝入3mL的固相萃取柱空柱管中，根據(jù)實施例1中的裝柱方法制備分子印跡固相萃取柱，裝好后依次用4mL甲醇和7mL乙腈潤洗。最后對柱子標記，密封備用。
[0036](四).分子印跡固相萃取柱在雞肝臟樣品檢測中回收率的測定
樣品的處理方法同實施例2，樣品經(jīng)過勻質(zhì)后，添加ETP標準品，使其在樣品中的濃度達到農(nóng)業(yè)部235號公告中所規(guī)定的最大殘留限量的0.5倍、I倍和2倍，而后進行提取，采用ETP分子印跡固相萃取柱進行樣品的凈化，應(yīng)用高效液相色譜法對其回收率進行了測定和計算(每個樣品平行測定3次)，色譜條件同實施例1 (見圖3的表3)。
【權(quán)利要求】
1.乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于，制備步驟為: 1)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，超聲處理5min混勻后，放入4°C冰箱進行預(yù)聚合24h，得到預(yù)聚合體系； 所述的模板分子為乙氧酰胺苯甲酯，所述的致孔劑為乙腈和氯仿中的任意一種或兩種的組合；所述的功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、烯丙基胺、亞甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2_(雙甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的任意一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為10mmol/L-150mmol/L ; 2)向步驟I)制得的預(yù)聚合體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，超聲處理5min，充分混勻后，通入氮氣5min，并在氮氣氣氛或真空狀態(tài)下密封，備用； 所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇雙丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、馬來松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇單酯、六亞甲基二異氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一種，交聯(lián)劑的加入量為模板分子摩爾量的16-25倍； 所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異戊腈、偶氮二環(huán)己基甲腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的任意一種，加入量為步驟I)所加模板分子摩爾量的0.5-1.5倍； 3)按照分散劑與步驟I)所加功能單體比值為5mL/mmol-120mL/mmol的比例取一定量的分散劑置于四口燒瓶中，備用； 所述的分散劑為甘油、硅油或聚乙烯醇水溶液，其中聚乙烯醇水溶液配制時，先將聚乙烯醇加入蒸餾水中，在攪拌條件下加熱至9 (TC?9 5 °C使其溶解，制得質(zhì)量濃度為0.5%-3.5%的聚乙烯醇溶液，冷卻至室溫，即完成制備； 4)將步驟2)密封備用的預(yù)聚合體系在攪拌和氮氣保護下滴加入步驟3)的四口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為50°C -70°C，聚合時間為12h-48h，得到微懸浮乳液，即為印跡聚合物； 5)依次采用超純水、甲醇和乙醇對步驟4)得到的印跡聚合物分別進行洗滌3-5次，將洗滌后的沉淀物在50°C真空干燥，得到分子印跡聚合物； 6)采用體積比為9:1的甲醇-乙酸混合溶液對步驟5)得到的分子印跡聚合物進行索氏抽提，期間定時對新流出的提取液進行取樣，并采用高效液相色譜分析提取液中乙氧酰胺苯甲酯的含量，直至提取液中無乙氧酰胺苯甲酯時停止索氏提取，然后，用乙腈對分子印跡聚合物進行洗脫除去殘留溶劑和其他雜質(zhì)； 7)將步驟6)洗脫后得到的分子印跡聚合物置于50°C的真空干燥箱內(nèi)烘干至恒重，然后，采用分級篩分級，篩選出直徑為50 μ m-70 μ m的顆粒； 8)稱取步驟7)所制備的分子印跡聚合物100mg-200mg,用濕法裝填固相萃取柱,依次用乙腈和甲醇對柱子進行潤洗，然后封于錫箔袋中，即得到乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中乙腈和氯仿的組合物作為致孔劑時，乙腈和氯仿的體積比為1:1-2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中聚乙烯醇溶液的質(zhì)量濃度為1.5%-2.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟3)和步驟4)中攪拌的速度為400r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的引發(fā)溫度為50°C _60°C，聚合時間為12h-36h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟5)中每次洗滌的具體方法是:對超純水、甲醇或乙醇加入印跡聚合物后得到的固液混合物進行渦旋混合5min-20min后，離心分離,取固體沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乙氧酰胺苯甲酯分子印跡固相萃取小柱的制備方法，其特征在于:所述步驟5)中每次洗漆時離心的時間為15min-25min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的分子印跡固相萃取小柱在食品中殘留乙氧酰胺苯甲酯的選擇性吸附和富集中的應(yīng)用。
【文檔編號】B01J20/285GK104174390SQ201410410817
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】侯玉澤, 李兆周, 張成博, 李道敏, 曹力, 高紅麗, 陳秀金, 李智麗, 李松彪, 呂璞, 張臘梅, 王芳, 雍雪萍, 俞嘉偉, 唐淑閣, 王爽 申請人:河南科技大學(xué)