專利名稱：表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌。
背景技術(shù)：
甲烷是重要的化工原料和化學(xué)能源，在人類的生產(chǎn)生活中扮演著重要的作用；同 時也是造成溫室效應(yīng)最為重要的氣體之一。有效、合理地利用甲烷，必將對全球能源 利用、環(huán)境保護(hù)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生重大的影響。由于甲烷是最穩(wěn)定的垸烴化合物，C-H 鍵能為104kcalmo1—1，因此，甲垸直接轉(zhuǎn)化其它高附加值化學(xué)品對于化學(xué)科學(xué)和工程 都是一個很大的挑戰(zhàn)。特別的，現(xiàn)有工藝通過氧化甲烷生成甲醇需要非?？量痰姆磻?yīng) 條件，經(jīng)過長期的工藝改進(jìn)和催化劑改良，目前工業(yè)上從甲烷生產(chǎn)甲醇仍需255'C的 溫度和5 15MPa的壓力。此外，這些工藝過程中所用的甲烷一般來自于天然氣，但 在自然界中分布廣、密度低的沼氣等甲垸資源由于其純度較低，不能作為工業(yè)催化的 原料。
自然界中的一類特殊微生物——甲垸氧化菌——可以在常溫常壓的情況下，依靠 體內(nèi)的甲烷單加氧酶無污染的實現(xiàn)甲烷到甲醇的專一性轉(zhuǎn)化。甲烷單加氧酶不僅可以 將甲烷轉(zhuǎn)化成為甲醇，而且還可以催化其它一系列的單加氧反應(yīng)，可以廣泛地應(yīng)用于 生物轉(zhuǎn)化及環(huán)境治理。如果能將甲烷單加氧酶進(jìn)行表達(dá)，開發(fā)出一種細(xì)胞形態(tài)生物催 化劑，那么在常溫常壓下就能將天然氣轉(zhuǎn)化為甲醇。這將大大降低甲醇的生產(chǎn)成本， 是一種高度節(jié)能的、環(huán)境友好的甲醇生產(chǎn)工藝。同時，以可再生資源為原料通過厭氧 甲垸發(fā)酵可以提供廉價的甲烷，是實現(xiàn)循環(huán)工業(yè)的極具潛力的一條途徑。因此甲烷的 資源化利用技術(shù)的研發(fā)具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
甲烷單加氧酶(EC.U4.13.25, Methane Monooxygenase，簡稱MMO)分兩種，一 種是可溶性的甲烷單加氧酶(soluble methane monooxygenase，簡稱sMMO)，另一 種是與細(xì)胞膜結(jié)合的顆粒狀甲垸單加氧酶(particulate methane monooxygenase,簡稱 (pMMO)。盡管sMMO和pMMO都能氧化甲烷生成甲醇，但二者還是存在很多的不 同。sMMO存在于細(xì)胞質(zhì)中，它底物范圍廣，許多的烴類化合物和芳香族化合物都能 被氧化。與sMMO相比，pMMO的底物選擇性相對較窄，只能氧化五碳以內(nèi)的烷烴和 烯烴，不能氧化芳香烴。但是pMMO卻具有很多sMMO不具備的優(yōu)勢。pMMO存在于 細(xì)胞膜上而不是細(xì)胞質(zhì)中。該性質(zhì)有利于底物與酶的接觸和反應(yīng)產(chǎn)物及時排出，意味 著該酶催化的反應(yīng)傳質(zhì)阻力更低，因而有利于在生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用。pMMO存在四級結(jié)
構(gòu)，由三個亞基組成(分別是23kDa的pmoC、 27kDa的pmoA和45kDa的pmoB, Genbank 31650 AF186586 )，pMMO是a3(33丫3的三聚體結(jié)構(gòu)，銅離子位于pmoB中。盡管在pMMO 酶分子研究方面取得了一系列的進(jìn)展，而且Mef /ococcws ca/ww/flf附(Bath)和 Mef/z;;/ay/"t^ R/cAcwjwr/wn OB3b的pmo基因已經(jīng)克隆測序，但pMMO的重組異源表達(dá) 卻進(jìn)展甚微，至今在大腸菌及其他宿主細(xì)胞中沒有表達(dá)成功。但pMMO的異源表達(dá)技 術(shù)仍不成熟，既便有個別成功的例子，但重組菌的活性僅為原始菌的千分之一，不能 得到高活性的表達(dá)。主要原因是pMMO的異源表達(dá)大都以大腸桿菌為宿主，得不到轉(zhuǎn) 化子，推測是pMMO的表達(dá)產(chǎn)物對大腸菌具有毒害作用。
盡管利用野生型甲烷氧化菌能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化甲醇，但是其在大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用還 存在一系列難以克服的技術(shù)問題。首先，甲垸氧化菌的培養(yǎng)比較困難，與其他工業(yè)應(yīng) 用的微生物相比增殖速度極慢，而且能夠得到的細(xì)胞密度低。盡管通過添加特殊底物 (氯甲垸、有機(jī)酸、維生素或甲醇等)能促進(jìn)甲烷氧化菌生長，但其生長速度還是遠(yuǎn)遠(yuǎn) 低于其它菌類。其次，利用野生甲垸氧化菌進(jìn)行甲烷轉(zhuǎn)化甲醇的過程中，甲醇的積累 不易控制。在這些菌中都含有甲醇脫氫酶，因此甲醇會進(jìn)一步地被氧化成為甲醛，進(jìn) 一步進(jìn)入的細(xì)胞合成代謝。如果加入特殊的化學(xué)試劑，選擇性地抑制甲醇脫氫酶的活 性，這樣雖然暫時促進(jìn)甲醇的積累，但細(xì)胞的代謝途徑卻被中斷，特別是阻止細(xì)胞的 輔酶再生，嚴(yán)重影響細(xì)胞的代謝活性，進(jìn)而阻止甲垸氧化反應(yīng)。這主要是因為對于甲 垸氧化菌而言，MMO氧化甲垸所需的NADH只能由甲醛進(jìn)入相應(yīng)的代謝途徑后才能 產(chǎn)生，因此如果將細(xì)胞控制在生產(chǎn)甲醇這一步的話，胞內(nèi)原有的NADH被耗竭時，反 應(yīng)就停止了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌。 本發(fā)明所提供的可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌，是將可表達(dá)顆粒狀甲垸單
加氧酶的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選得到的可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組菌株。
所述重組表達(dá)載體為含有單加氧酶的啟動子及其下游連接的顆粒狀甲烷單加氧 酶的編碼基因的可在宿主菌中表達(dá)的載體。
所述單加氧酶基因的啟動子為垸烴單加氧酶基因的啟動子或顆粒狀甲垸單加氧 酶基因的啟動子；所述垸烴單加氧酶基因的啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號 為AJ302087的5'端第2008 — 2150位核苷酸序列，所述顆粒狀甲烷單加氧酶基因的 啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號為U31650 AF186586的5'端第34—499位 核苷酸序列。
所述顆粒狀甲垸單加氧酶的編碼基因的的核苷酸序列為自GENBANK號為 U31650 AF186586的5'端第500 — 3743位核苷酸序列。所述宿主菌為產(chǎn)氣腸桿菌(五"&ro&acter aerage"^y)、惡臭假單胞菌(尸sewctowo"(xs 、施氏假單胞菌(尸sewd畫owfl5 Wwtem')、 銅綠假單胞菌(尸^Mt/o附。"(ZS1 aerwg/wo犯)，甲基扭曲桿菌(她鄉(xiāng)/o6acte"'謂exto wem)、巴氏畢赤酵母Wc/z/a / aWo/^)或酉良酒酵母(Sacc/7(3Tom^yces cerev/s/ae)。所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建出發(fā)載體可為pComl0、酵母表達(dá)載體等，其中pCom10 質(zhì)?？捎糜谏鲜霎a(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、銅綠假單胞菌，甲基扭 曲桿菌等宿主中，而酵母表達(dá)載體可用于上述巴氏畢赤酵母或釀酒酵母中。所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為將顆粒狀甲垸單加氧酶的編碼基因插入到pCom10的 AWe/和/^>^///酶切位點之間或?qū)⑺鰡渭友趺富虻膯幼蛹捌湎掠芜B接的所述顆 粒狀甲垸單加氧酶的編碼基因插入到pCom10的五coi /和歷>^///酶切位點之間得到 的可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的重組載體。本發(fā)明所提供的表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法，是誘導(dǎo)表達(dá)上述的工程菌，得 到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。所述方法中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的方法為發(fā)酵至對數(shù)生長初期的權(quán)利要求l一6中任 意一項所述的工程菌的發(fā)酵液中，加入0.05n/。(v/v)正辛烷，在15-2(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)得到 含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。本發(fā)明通過生物信息學(xué)比對，選擇與顆粒狀甲垸單加氧酶同源性較高(大于30%) 的單加氧酶，并利用其啟動子作為調(diào)控顆粒狀甲烷單加氧酶功能基因; moC45的啟動 子構(gòu)建構(gòu)建單加氧酶啟動子^^moC45表達(dá)體系，同時選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建得 到可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體。本發(fā)明選擇了具有較多膜蛋白氧化還 原酶的菌作為宿主菌，并利用化學(xué)轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體融合等手段將表達(dá)載 體轉(zhuǎn)入宿主菌中構(gòu)建了可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌，實驗證明這些工程菌具 有穩(wěn)定、高效表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的功能。本發(fā)明的方法利用上述具有顆粒狀甲垸單加氧酶表達(dá)活性的重組菌，徹底避開甲 醇脫氫酶基因的影響，使甲垸氧化停留在甲醇這一步反應(yīng)，克服了野生型甲垸氧化菌 的缺陷，更易培養(yǎng)(能用含葡萄糖等普通碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng))。本發(fā)明還利用具有顆 粒狀甲垸單加氧酶活性的重組菌成功地解決了顆粒狀甲垸單加氧酶的異源表達(dá)問題。所構(gòu)建的基因工程重組菌能將天然氣的烷烴液化成為相應(yīng)的醇類，能將沼氣轉(zhuǎn)化為甲 醇，能將丙烯氧化成1,2 —環(huán)氧丙垸。本發(fā)明的工程菌可以用于環(huán)境中難降解化合物 如石油中烴類化合物的羥化分解，因而可用于環(huán)境的生物治理。


圖1為pCompmo質(zhì)粒構(gòu)建圖 圖2為pCHP質(zhì)粒構(gòu)建3為五.flera取"^ pCompmo SDS-PAGE電泳圖。 圖4為含有pCHP質(zhì)粒重組菌SDS-PAGE電泳圖。
具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實施例l、可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的工程菌的構(gòu)建及其顆粒狀甲烷單加氧酶 的表達(dá)1、可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌的構(gòu)建 1)可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體(pCompmo)的構(gòu)建 選擇pComlO質(zhì)粒(其核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AJ302087 的第l-7675位核苷酸，可按照文獻(xiàn)(Theo H. M. Smits，尸/謹(jǐn)"，2001， 46:16-24) 描述的方法構(gòu)建，清華大學(xué))作為可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體的出發(fā) 載體， 一方面是其為廣譜質(zhì)粒，可以在不同的革蘭氏陰性細(xì)菌復(fù)制；另一方面，該質(zhì) 粒啟動子PalkB為烷烴單加氧酶啟動子(自GENBANK Accession Number為AJ302087 的5'端第2008 — 2150位核苷酸序列)，而烷烴單加氧酶與甲烷單加氧酶在結(jié)構(gòu)與功 能上有許多相似性。可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖l所示，具體方法如 下所述以M^c/zo^o〃'Mm OB3b的基因組DNA為模版，擴(kuò)增pmoC45功能基因 (GENBANK Accession Number為U31650 AF186586的5'端第500 —3743位核苷酸序 列),所用上下游引物分別為5 ， -CATATGAATTCAACAACAGAGACAACAG-3 ，(帶 下劃線的序列為MM的識別序列)和5'-AAGCTTCCAAACGCCGCATTCTATC-3'(帶 下劃線的序列為歷'wdn的識別序列)，分別引入A^I和歷^III酶切位點。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下先94"C，預(yù)變性4分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)；循環(huán)反應(yīng)條件是94。C變性l分鐘，54"C退火1分鐘，72C延伸4分鐘；30個循環(huán)結(jié)束后72"C補(bǔ)充延伸10 分鐘。擴(kuò)增得到了預(yù)期的3.4kb的片段，經(jīng)測序表明，擴(kuò)增得到的片段具有自 GENBANK Accession Number為U31650 AF186586的5，端第500 — 3743位核苷酸序列， 即為pmoC4B功能基因片段。將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶A^M和/Z/^ffll進(jìn)行雙酶切，將酶切得到的帶 有AWd禾卩歷MJIII粘性末端的pmoC^功能基因片段插入pCom 10的A^M和歷wffll酶識
別位點之間，得到重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切和測序驗證，將驗證表明含有啟動子PalkB與其下游連接的上述PCR得到的/wzoC4S的重組表達(dá)載體命名為 pCompmo。2)可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌的構(gòu)建為了將/7moC45基因在不同宿主中表達(dá)，選擇了富含氧化還原酶的革蘭氏陰性細(xì) 菌作為宿主菌。利用電轉(zhuǎn)化的方法將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCompmo分別轉(zhuǎn)入產(chǎn)氣腸桿菌flerage"M，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10293)、 惡臭假單胞菌(尸^"^mo"w ;n^Wa，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號 10298)、施氏假單胞菌(尸"^/omo"aw加zer/，美國典型微生物菌種保藏中心購買， 編號11607)、銅綠假單胞菌(i^"&mo"w aerag/mwa，中國工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心購買，編號10204)或甲基扭曲桿菌(Me^y/o6acto^m exto^wms，美國典型 微生物菌種保藏中心購買，編號8457)，將得到的重組工程菌株提取質(zhì)粒測序驗證， 將驗證表明含有質(zhì)粒pCompmo的產(chǎn)氣腸桿菌(五"^o6flcteraerage"^)工程菌、惡臭 假單胞菌(尸^Mc/纖(9"as1拜"c/a)工程菌、施氏假單胞菌(尸sewd謹(jǐn)o"as 工 程菌、銅綠假單胞菌(尸化Wowo"^ aerag/"(Wfl )工程菌，甲基扭曲桿菌 (Afer/2_y/o6acten'ww ex,ow〃em ) 工禾呈菌分另U命名為產(chǎn)氣腸桿菌(五",ero6acter aeragewesO pCompmo、惡臭假單胞菌(尸sewfifo,"ay/^/c/a) pCompmo、施氏假單胞 菌(尸sew(io附o;ms pCompmo、 銅綠假單胞菌(aerwg/wosa)pCompmo ， 甲基扭曲桿菌(Me鄉(xiāng)/oZ)acfe",謂e加r《Mem1) pCompmo。 2、顆粒狀甲垸單加氧酶的表達(dá)將產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera6acter aerage"eiO pCompmo、惡臭假單胞菌pCompmo、施氏假單胞菌(尸sei^/謹(jǐn)o"os1pCompmo、銅綠假單胞菌 (i^e^/畫owaw aerwg7> (wa) pCompmo ， 甲基扭曲桿菌(^/6—/。^"6〃'扁e加r，e— pCompmo分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；具體方法如下所述將上述工程菌下述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長初期，然后分別在發(fā)酵液中，加 入0.05。/0(v/v)正辛烷，在18TH秀導(dǎo)培養(yǎng)5小時得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌 液?；A(chǔ)培養(yǎng)基每升溶液中含有甘油lg， NaNH4HP04'4H20 3.5g， K2HP04'3H20 7.5g， KH2P043.7g， MgS047H20 0.246g， MT lt液lml，去離子水定容至1L;其中 MT貯液為每升溶液中含有FeS(V7H20 2.78g，MnCl2'4H20 1.98g， CoS04'7H20 2.81g， CaCl2.2H20 1.47g， CuCl2'2H20 0.17g， ZnS04'7H20 0.29g， lmol.L-1 HC1定容至1L。將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時后得到的培養(yǎng)液，分別離心收集lml培養(yǎng)液的菌體，用 無菌水洗滌后，按照下述方法提取整細(xì)胞蛋白1) 以0.5ml用冰預(yù)冷的50mmol/LTris'Cl(PH 7.4)振蕩沉淀的菌體使之復(fù)懸，用 微量離心機(jī)于零度以12000g離心30秒回收菌體。再次吸出上清液，小心的吸凈管壁 上的液滴，盡可能是沉淀物不帶有殘留液體。2) 在步驟l)得到的沉淀中加入25ul水，振蕩使沉淀復(fù)懸， 一旦菌體分散開來， 立即加入25ul 2倍的SDS凝膠加樣緩沖液(含有100mmol/L Tris'HCl (PH 6.8)， 200mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，質(zhì)量百分含量為4%的SDS (電泳級)，質(zhì)量百分含 量為0.2%的溴酚藍(lán)，質(zhì)量百分含量為20%的甘油的溶液)，繼續(xù)振蕩20秒鐘。3) 將步驟2)得到的樣品在沸水裕中放置5分鐘，采用帶有浸入尖頭或能在冷 卻杯中同時處理多個樣品的超聲處理儀對樣品進(jìn)行剪切。4) 將步驟3)得到的剪切后的樣品于室溫儀12000g離心10分鐘，將上清液移 至另一個管中，棄沉淀物得到蛋白樣品。吸取上述得到的經(jīng)剪切或超聲處理的樣品25u進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分 析。然后用蛋白電泳圖像分析軟件計算表達(dá)的蛋白占總蛋白的量。分別以上述工程菌 的野生型菌產(chǎn)氣腸桿菌(五"tera6acteraeragwe^中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 購買，編號10293)、惡臭假單胞菌(尸wz^omoww;^^fa，中國工業(yè)微生物菌種保藏 管理中心購買，編號10298)、施氏假單胞菌(/^w^mo^H加zen'，美國典型微生物 菌種保藏中心購買，編號11607)、銅綠假單胞菌(尸"^fomoww aewg/"o叫中國工 業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10204)或甲基扭曲桿菌(Afe^y/ote"en^m exto^M叫美國典型微生物菌種保藏中心購買，編號8457)進(jìn)行上述同樣的誘導(dǎo)培 養(yǎng)后按照上述提取整細(xì)胞蛋白后進(jìn)行蛋白電泳為對照。結(jié)果表明，上述產(chǎn)氣腸桿菌(五"ferakzcfer flerage朋s) pCompmo、惡臭假單胞菌 (/^eMctowo"fiw/7wafifa) pCompmo、施氏假單胞菌(尸seMtfomo打os Wwteen') pCompmo、 銅綠假單胞菌(f^ewt/omo"oy aerag/"osa) pCompmo，甲基扭曲桿菌(A/e/Z^/o6a"eWww extor^e"力pCompmo均可表達(dá)pMMO蛋白，表達(dá)的pMMO蛋白均包括其pmoB、 pmoA和pmoC亞基，表達(dá)量達(dá)總蛋白的5%以上。用美國GE Healthcare公司的 ImageMaster VDS凝膠成像系統(tǒng)配套軟件分析表明，產(chǎn)氣腸桿菌(五"tero6ac^ pCompmo、惡臭假單胞菌(尸wz^/omowaw/ M^fa) pCompmo、施氏假單胞 菌(尸sewiomowas 5tMZzen') pCompmo、 銅綠假單胞菌(尸seMfitowo"cw aerag/"osa) pCompmo，甲基扭曲桿菌(Me^y/o6fl"eWww exto/^wem) pCompmo的pMMO蛋白表達(dá) 量分別為0.8g/L發(fā)酵液、1.0g/L發(fā)酵液、0.7g/L發(fā)酵液、1.0g/L發(fā)酵液、0.5g/L發(fā)酵 液。其中，產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera6fl"er pCompmo表達(dá)蛋白電泳圖如圖3所 示，圖3中，Ml為24 97kD分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker， M2為16 115kD分子量的標(biāo)準(zhǔn) 蛋白marker， E為用產(chǎn)氣腸桿菌(五Wera6a"w pCompmo整細(xì)胞蛋白上樣 的條帶，Control為用野生菌產(chǎn)氣腸桿菌(五wferak c^^erage"w,中國工業(yè)微生物菌
種保藏管理中心購買，編號10293)整細(xì)胞蛋白上樣的條帶。工程菌產(chǎn)氣腸桿菌(五"tera6acter pCompmo與野生菌產(chǎn)氣腸桿菌相比，在36kD 53kD處、24kD 36kD和24kD處均有明顯條帶，分子量大小約為45kD、 27kD和24kD。而pMMO 的三個亞基大小分別為23kD (pmoC) 、 27kD (pmoA)和45kD (pmoB)。圖3中箭 頭所指三處為pMMO的亞基，從上至下分別為pmoB、 pmoA禾卩pmoC。 SDS-PAGE電 泳說明編碼pmoCAB的mRNA可以在基因工程宿主產(chǎn)氣腸桿菌(^&^ra^cter 中進(jìn)行翻譯。蛋白電泳圖像分析軟件分析表明，從整細(xì)胞蛋白的電泳中 可以發(fā)現(xiàn)工程菌表達(dá)pMMO的量為菌體總蛋白的5。/。以上。實施例2、可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌的構(gòu)建及其顆粒狀甲烷單加氧酶 的表達(dá)1、可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的工程菌的構(gòu)建1) 可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體(pCHP)的構(gòu)建 可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的重組表達(dá)載體(pCHP)的構(gòu)建流程示意圖如圖2所示。以M fr/c/2cw^on'wm OB3b的基因組DNA為模版，擴(kuò)增; mo功能全基因簇 (AF186586 )，所用上下游引物分另U為5，-AGTAGAATTCATTGA GAAGTGAGCAGCCT-3 ，(帶下劃線的序列為的識別序列)和5 ， -ATACA AAGCTTTGAAGATAATGCTGCCGA-3，(帶下劃線的序列的識別序列)， 分別引入&^1和///"^111酶切位點。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下先94'C，預(yù)變性4分鐘后 進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)；循環(huán)反應(yīng)條件是94。C變性l分鐘，56t:退火l分鐘，72°C 延伸4分鐘；30個循環(huán)結(jié)束后72。C補(bǔ)充延伸10分鐘。得到了預(yù)期的4.4kb的片段，經(jīng)測 序表明，擴(kuò)增得到的片段具有自GENBANKAccessionNumber為U31650AF186586的 5'端第34bp—4474bp位核苷酸序列，即為; mo全基因簇，其中自GENBANK Accession Number為U31650 AF186586的5'端第34—499位核苷酸序列為啟動子序列。將純化后 的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶五coi I和歷"JIII進(jìn)行雙酶切，將酶切得到的帶有AWd和 歷"dll粘性末端的; moC^功能基因片段與插入pComlO的Ecoi I和歷m/in酶識別位 點之間，得到重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切和測序驗證，將驗證表明含 有上述PCR得到的片段的重組表達(dá)載體命名為pCHP。2) 可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的工程菌的構(gòu)建為了將;wK)C45基因在不同宿主中表達(dá)，選擇了富含氧化還原酶的革蘭氏陰性細(xì) 菌作為宿主菌。利用電轉(zhuǎn)化的方法將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCHP分別轉(zhuǎn)入產(chǎn)氣腸桿菌 (五"bokzcbflm ge"M中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10293)、惡
臭假單胞菌(尸Mwdomo"w /n^V/a,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號 10298)、施氏假單胞菌(尸^^omo"aH&teen'，美國典型微生物菌種保藏中心購買，. 編號11607)、銅綠假單胞菌(尸^^owo"w"en^'"o叫中國工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心購買，編號10204)和甲基扭曲桿菌(M^/^/o6acten'Mm ejcto^wew,美國典型 微生物菌種保藏中心購買，編號8457)中，將得到的重組工程菌株提取質(zhì)粒測序驗證， 將驗證表明含有質(zhì)粒pCHP的產(chǎn)氣腸桿菌(五wfera6acter 、惡臭假單胞菌(尸扁do腳腿戸,/fifa)、施氏假單胞菌(尸扁domo謹(jǐn)血zen')、銅綠假單胞菌 (尸5ewfifewzo"oy aen^7'"ara)， 甲基牛丑曲桿菌(A/"/zy/o6acfen'MW exto wera)分另U命 名為產(chǎn)氣腸桿菌(五她ra6a"er aerage廳)pCHP、惡臭假單胞菌(/^e油膽"os戸 油) pCHP、施氏假單胞菌(尸wwcfowo"w pCHP、銅綠假單胞菌(尸wMtfomomwGer，'"osfl) pCHP ， 甲基扭曲桿菌(M"/z—6a"m'調(diào)extor，era) pCHP 。 2、顆粒狀甲垸單加氧酶的表達(dá)將產(chǎn)氣腸桿菌(五wfera6a"er aeragewes) pCHP、 惡臭假單胞菌(尸sewicwzo"iM ;w^fe) pCHP、施氏假單胞菌(i^ew&wo"w ) pCHP 、銅綠假單胞菌(尸set^/omo"iW aerwg/wosa) pCHP，甲基扭曲桿菌(A/e^y/o6a"en'wm exto we"s) pCHP 分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；具體方法如下所述將上述工程菌下述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長初期，然后分別在發(fā)酵液中，加 入0.05°/一~)正辛烷，在2(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌 液?；A(chǔ)培養(yǎng)基每升溶液中含有甘油lg (或lg葡萄糖)，NaNH4HP044H20 3.5g， K2HPCV3H20 7.5g， KH2P04 3.7g， MgS04'7H20 0.246g， MT貝i液lml，去離子水定 容至1L;固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉；其中MT貯液為每升溶液中含有FeSCV7H20 2.78g， MnCl2'4H20 1.98g， CoS04'7H20 2.81g， CaCl2-2H20 1.47g， CuCl2.2H20 0.17g， ZnS04'7H20 0.29g， lmol'L" HC1定容至1L。將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時后得到的培養(yǎng)液，分別離心收集細(xì)胞，用無菌水洗滌后， 對整細(xì)胞蛋白(按照實施例1的步驟2所述的提取整細(xì)胞蛋白的方法提取得到)然后 分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗。然后用蛋白電泳圖像分析軟件計算表達(dá)的蛋白占 總蛋白的量。分別以上述工程菌的野生型菌產(chǎn)氣腸桿菌(五"敏o&c^aeragewey,中 國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10293)、惡臭假單胞菌(尸wwAmo"氾 ; ^V/a，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10298)、施氏假單胞菌 (尸wz^omomss加zm'，美國典型微生物菌種保藏中心購買，編號11607)、銅綠假單 胞菌(/^et^omoMasaewg&osfl，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買，編號10204) 或甲基扭曲桿菌(7kfe^y/Wa"en'wm exto^wera,美國典型微生物菌種保藏中心購買， 編號8457)進(jìn)行上述同樣的誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行蛋白電泳為對照。
結(jié)果表明，上述產(chǎn)氣腸桿菌(￡"tera6acter "eroge"m) pCHP、惡臭假單胞菌 (i^ewctomw2GW/ w"da) pCHP、施氏假單胞菌(尸se^/omo"(Xs pCHP、銅鄉(xiāng)錄4叚單胞菌(尸^wAmoMasflen^/"ow) pCHP在上述兩種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，均可表達(dá) pMMO蛋白，表達(dá)的pMMO蛋白均包括其pmoB、 pmoA和pmoC亞基，表達(dá)量達(dá) 總蛋白的5 %以上。用美國GE Healthcare公司的ImageMaster VDS凝膠成像系統(tǒng)配 套軟件分析表明，產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera6fl"er aeragew^) pCHP、惡臭假單胞菌 (i^ewt/omo"(zy; m^/a) pCHP、施氏假單胞菌(尸sewctomomw pCHP、銅綠假單胞菌(/^ewcfomo"as aewg/"asfl)pCHP的用添加葡萄糖的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)時pMMO 蛋白表達(dá)量為分別0.4g/L發(fā)酵液、0.3g/L發(fā)酵液、0.4g/L發(fā)酵液、0.5g/L發(fā)酵液、0.4g/L 發(fā)酵液；用添加甘油的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)時pMMO蛋白表達(dá)量為分別為0.7g/L發(fā)酵液、 0.8g/L發(fā)酵液、0.7g/L發(fā)酵液、0.6g/L發(fā)酵液、0.7g/L發(fā)酵液。部分菌株蛋白電泳如圖4所示，其中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker，分子量如圖所 示；泳道l-3分別為陰性對照產(chǎn)氣腸桿菌(五Mfera^"waerage"M,中國工業(yè)微生物菌 種保藏管理中心購買，編號10293)、惡臭假單胞菌(尸w^fomo"w戶^/a,中國工業(yè) 微生物菌種保藏管理中心購買，編號1029S)、施氏假單胞菌(尸M^/oww7a^加zerh 美國典型微生物菌種保藏中心購買，編號11607)在甘油培養(yǎng)基中的培養(yǎng)后蛋白電泳 情況；泳道l'-3'分別為重組菌產(chǎn)氣腸桿菌(五wtera6acter aeragen^) pCHP、施氏假 單胞菌(尸化wt/omomxs Wwtee〃') pCHP禾口惡臭假單胞菌(尸wmc/owo"w ; w^ifl) pCHP 在甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的蛋白電泳情況；泳道4-5分別為陰性對照產(chǎn)氣腸桿菌 (五"fero6a"er fleragwM)禾口施氏假單胞菌(尸化^/owomw 在添力口葡萄糖的 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)后蛋白電泳情況；泳道4'-5'分別為重組菌產(chǎn)氣腸桿菌(五ntera^cto" aerage"M) pCHP和施氏假單胞菌(/^wcfemo"as pCHP在葡萄糖培養(yǎng)基中 的情況。工程菌與野生型菌株相比，在24kDa附近明顯多一條帶，而這條帶大小與 pmoC相同(蛋白電泳采用整細(xì)胞全蛋白上樣，pmoA、 pmoB可能由于其它蛋白條帶 的影響在電泳圖中條帶差別不明顯)，可以說明pMMO在三株重組菌中都得到轉(zhuǎn)譯， 形成了三個亞基pmoC、 pmoA和pmoB。蛋白電泳圖像分析軟件，從整細(xì)胞蛋白的電 泳中可以發(fā)現(xiàn)工程菌表達(dá)pMMO的量為菌體總蛋白的5。/。以上。
權(quán)利要求
1、表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌，是將表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選得到的表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組菌株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述重組表達(dá)載體為含有單加 氧酶的啟動子及其下游連接的顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因的可在宿主菌中表達(dá) 的載體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述單加氧酶基因的啟動子為烷烴單加氧酶基因的啟動子或顆粒狀甲烷單加氧酶基因的啟動子；所述烷烴單加氧酶 基因的啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號為AJ302087的5'端第2008—2150 位核苷酸序列，所述顆粒狀甲烷單加氧酶基因的啟動子的核苷酸序列為自GENBANK 號為U31650 AF186586的5'端第34—499位核苷酸序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述顆粒狀甲烷單加氧酶的編 碼基因的核苷酸序列為自GENBANK號為U31650 AF186586的5'端第500bp— 3743bp位核苷酸序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的工程菌，其特征在于所述工程宿主菌 為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas ptida)、施 氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)， 甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extroquens)、 巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)或 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將顆粒狀 甲垸單加氧酶的編碼基因插入到pComlO的NdeI和HindIII酶切位點之間或?qū)⑺鰡?加氧酶基因的啟動子及其下游連接的所述述顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因插入到 pComlO的EcoRI和HindIII酶切位點之間得到的可表達(dá)顆粒狀甲垸單加氧酶的重組 載體，所述pComlO的核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AJ302087的 第1-7675位核苷酸。
7、 一種表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法，是誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求l一6中任意一項所述的工程菌，得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)表達(dá)的方法為發(fā)酵至對 數(shù)生長期的權(quán)利要求1_6中任意一項所述的工程菌的發(fā)酵液中，加入體積百分含量 為0.05%的正辛烷，在15-2(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵 菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌。該方法，是誘導(dǎo)表達(dá)具有顆粒狀甲烷單加氧酶表達(dá)活性的工程菌，得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。該工程菌，是將可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選得到的可表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶的重組菌株。所述重組表達(dá)載體為含有單加氧酶的啟動子及其下游連接的顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因的可在宿主菌中表達(dá)的載體。本發(fā)明的工程菌可高效表達(dá)顆粒狀甲烷單加氧酶，可用于沼氣轉(zhuǎn)化為甲醇，將丙烯氧化成1，2-環(huán)氧丙烷等的催化反應(yīng)。
文檔編號C12N1/19GK101392233SQ200810225730
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者昊 吳, 程 楊, 皓 江, 濤 蘇, 邢新會, 冰 韓 申請人:清華大學(xué)