專利名稱：一種生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法；特別涉及一種利用甲 烷氧化菌發(fā)酵液直接催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙垸的方法。
背景技術(shù)：
甲烷氧化菌中的甲烷單加氧酶(MMO)能氧化丙烯生成l,2-環(huán)氧丙烷，如式(1)。
為此研究者們把丙烯氧化生成環(huán)氧丙烷作為MMO總活性測定的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)。環(huán)氧丙烷
是重要的基礎(chǔ)化工原料，大量用于聚氨酯塑料、不飽和樹脂和表面活性劑的生產(chǎn)。
環(huán)氧丙垸的衍生物還廣泛用于食品、煙草、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)。已生產(chǎn)的下游產(chǎn)
品近百種，是精細(xì)化工產(chǎn)品的重要原料，發(fā)展前景廣闊。
CH3CHCH2 + 02+NADH+H+=CH3CHCH20+H20+NAD+式(1)
目前工業(yè)上主要采用過酸、過氧化物或氯醇法生產(chǎn)環(huán)氧丙烷。氯醇法為目前工 業(yè)應(yīng)用最為廣泛的環(huán)氧丙烷生產(chǎn)工藝，丙烯在液氯作用下發(fā)生氯醇化反應(yīng)，生成中 間產(chǎn)物氯丙醇及副產(chǎn)物二氯丙烷和二氯二異丙醚；中間產(chǎn)物氯丙醇在NaOH或 Ca(OH)2的作用下發(fā)生皂化反應(yīng)生成產(chǎn)物環(huán)氧丙烷及副產(chǎn)物丙二醇。在該工藝中，氯 并沒有進(jìn)入到產(chǎn)品中，而是最終轉(zhuǎn)化為CaCl2隨著廢水排放，整個工藝能耗高，環(huán)境 污染嚴(yán)重。每生產(chǎn)l噸環(huán)氧丙垸將產(chǎn)生2噸CaCl2廢渣、40 80噸廢水、50 150kg二氯 丙垸。這些方法不僅污染環(huán)境而且造成大量的副產(chǎn)品。因此，科學(xué)家和世界各大生 產(chǎn)廠商， 一直在尋找成本低的綠色生產(chǎn)新方法。甲烷氧化菌中的MMO由于可在常溫 常壓下用空氣作氧化劑，直接氧化丙稀， 一步生成環(huán)氧丙烷，反應(yīng)工序少；而且除 了產(chǎn)物環(huán)氧丙烷外，只有水產(chǎn)生，整個反應(yīng)過程無污染。相比于目前化學(xué)工業(yè)中所 使用的方法，MMO生物催化的方法轉(zhuǎn)化率更高，工藝更加環(huán)保，顯示出了巨大的應(yīng) 用潛力。
MMO氧化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷的研究主要包括菌種的分離，培養(yǎng)及反應(yīng)條件的改進(jìn)、 細(xì)胞固定化及生物反應(yīng)器設(shè)計等。已有報道的利用甲垸氧化菌催化氧化制備環(huán)氧丙 烷最大積累濃度為5 mM。
關(guān)于甲垸氧化菌用于催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙垸的研究，所得到的環(huán)氧丙垸的 濃度均不高，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。由于有活性的MMO純酶難于獲得，而且純 化成本很高，利用甲垸氧化菌進(jìn)行工業(yè)生物催化必須以整細(xì)胞形式進(jìn)行。目前催化 丙烯制備環(huán)氧丙垸的體系均采用"生長——催化"兩步法進(jìn)行，即在甲垸氧化菌培
養(yǎng)基中培養(yǎng)或復(fù)性甲烷氧化菌，既而在緩沖溶液中進(jìn)行催化，因此發(fā)酵獲得的細(xì)胞 必須經(jīng)過離心——洗漆——重懸的復(fù)雜過程，耗時耗力，且難以實現(xiàn)連續(xù)生物催化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法。 本發(fā)明所提供的生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法，是在發(fā)酵得到的甲烷 氧化菌液中直接通入丙烯以及氧氣或空氣，催化反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷。
所述方法中，所述甲垸氧化菌液的OD66o為0.5 — 3.0。 所述方法中，所述催化反應(yīng)的溫度為35'C-45T:。 所述方法中，所述催化反應(yīng)得到的環(huán)氧丙烷通過冷凝回收。 所述方法中，所述甲烷氧化菌為甲基桿菌(Me^y/o6a"er W2/"e"Zm0;/)，甲基 單胞菌(A/i^/z_y/owo"cw/ ro6ws) ， A/"/z_y/asoma、甲基j斂菌(Afe/Z^/ow/cro6/wm a/6ww)， 甲基球菌(A/e^y/ococc附ca/ww/fl^y)， 甲基日愛菌(Afe^y/ocflWwm)， 甲基熱菌 (^/l/e/Z^/o^erm^)、 甲基鹽菌 (A/"e^y/o厶a/o6/ws cn'meem7i)， 甲基乂V疊球菌 (Me鄉(xiāng)/o犯ra'"a拜^,7/az-謂)，甲基球形菌 (M"/^/tw/ /wera), 甲基孢囊菌 (Afe^z少/ocj^^s s/ .)， 甲基彎菌(Afef/^/os7'"w51 /Wc/zo5^oWww) ， Afe^^y/oca/wa或
其中甲基球菌(Afe^y/ococcws ca/ww/aft^)、 甲基日爰菌(A/e^y/ocaWww)、 甲基 熱菌(Me鄉(xiāng)/o鈿m^)的最佳培養(yǎng)溫度為42 45°C;其它甲烷氧化菌的最佳培養(yǎng)溫 度為3(TC。
所述方法中，所述催化反應(yīng)過程中或催化反應(yīng)后發(fā)酵液在所述甲烷氧化菌的培 養(yǎng)溫度下，通入甲烷以及氧氣或空氣進(jìn)行培養(yǎng)恢復(fù)所述甲垸氧化菌的催化能力。
所述方法中，所述催化反應(yīng)的時間為10-30小時，優(yōu)選為21小時；所述催化反 應(yīng)后甲烷氧化菌發(fā)酵液通過恢復(fù)催化能力作為下一次催化反應(yīng)的發(fā)酵液；所述恢復(fù) 催化能力為在所述甲垸氧化菌發(fā)酵條件下繼續(xù)發(fā)酵8 — 10小時，優(yōu)選為10小時。
當(dāng)所述甲垸氧化菌的發(fā)酵溫度為35'C以上時，所述甲烷氧化菌的發(fā)酵和催化反 應(yīng)同時進(jìn)行，即在所述催化反應(yīng)的同時間歇或連續(xù)通入甲垸；當(dāng)所述甲烷氧化菌的 發(fā)酵溫度低于35'C時，所述催化反應(yīng)體系與所述甲烷氧化菌的培養(yǎng)體系為在一個反 應(yīng)罐中間歇調(diào)節(jié)溫度至培養(yǎng)溫度并通入甲烷代替丙烯進(jìn)行甲垸氧化菌的催化能力或 通過菌液在兩個體系中不斷循環(huán)流動，在催化反應(yīng)的過程中保持所述甲垸氧化菌的 催化能力。
本發(fā)明利用甲烷氧化菌的發(fā)酵液，不經(jīng)預(yù)處理，即可應(yīng)用于催化氧化反應(yīng)中， 本發(fā)明利用甲烷氧化菌發(fā)酵液進(jìn)行生物催化，在未經(jīng)處理的發(fā)酵液中利用甲垸氧化
菌催化氧化丙烯生成l,2-環(huán)氧丙烷，催化反應(yīng)活性高，轉(zhuǎn)化效率高，選擇性專一。與 緩沖溶液催化體系相比，具有操作簡便，生成、運行成本低，反應(yīng)周期短，產(chǎn)物分 離方便等優(yōu)點，大大減少"培養(yǎng)"與"催化"中間的工序；本發(fā)明利用環(huán)氧丙烷沸 點低的特性，在其沸點(35°C)以上進(jìn)行催化反應(yīng)，使生成的產(chǎn)物可以不斷的釋放 出，然后通過冷凝收集，使產(chǎn)物不斷的分離出來。
同時，本發(fā)明的方法催化后的細(xì)胞可以再經(jīng)"培養(yǎng)"工藝即可恢復(fù)其還原能力， 使得細(xì)胞培養(yǎng)與丙烯催化耦合，可在同一個反應(yīng)體系中進(jìn)行，進(jìn)而提高生物催化的 效率。


圖l為不同發(fā)酵階段^e^y/ow'mAy fr/c/ o^on'ww OB3b發(fā)酵液催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán) 氧丙院的情況
圖2Afe^y/os/m^ Wc/wwor/wm OB3b發(fā)酵液催化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷的總產(chǎn)量與反應(yīng)時 間的關(guān)系
圖3為不同發(fā)酵階段A/e^y/ococc^ ca/ww/fl^s Bath發(fā)酵液催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧 丙垸的情況
圖4Me^y/ococc^ ca戸w/a^s Bath發(fā)酵液催化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷的總產(chǎn)量與反應(yīng)時間 的關(guān)系
圖5為不同發(fā)酵階段^fe^y/cw/w^ Wc/ o^oWwm Y9發(fā)酵液催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧 丙烷的情況
圖6Me^y/ow'w船^'c/w^o/^w Y9發(fā)酵液催化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷的總產(chǎn)量與反應(yīng)時間 的關(guān)系
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實施例l、利用Me^y/cm'mw Wc/zos; on'wm OB3b (美國典型微生物菌種保藏中心 購買，編號49242)發(fā)酵液催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙垸。 1、甲垸氧化菌發(fā)酵種子液的制備
在70 ml的可密封的玻璃培養(yǎng)瓶中分裝10 ml培養(yǎng)基，用接種環(huán)從斜面或固體平板 上挑取一環(huán)Me^y/oW"^ Wc/zcw; oWwm OB3b菌苔接種與玻璃培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加蓋 密封橡膠塞。在上層空氣中置換入10ml過濾除菌后的甲垸，使瓶中空氣與甲烷的體 積比約為1:5。 30°C， 170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時重新置換入甲烷氣體(使空 氣甲烷=1:5， v/v)，培養(yǎng)5 7天至對數(shù)生長中期。
將上述生長至對數(shù)生長中期的Me^y/oWwws Wc/ os/ oWwm OB3b菌種以10% (v/v) 的接種量接種至300ml螺口搖瓶(裝培養(yǎng)基量50ml)，利用帶有聚四氟乙烯密封墊的 瓶蓋密封，在上層空氣中置換入50ml過濾除菌后的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積 比約為1:5。 30°C， 170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時重新置換入甲垸氣體(使空氣 甲烷=1:5， v/v)，培養(yǎng)3 4天至對數(shù)生長中期。該甲烷氧化菌可以作為接種至發(fā) 酵罐中的種子菌。
2、 甲垸氧化菌的發(fā)酵
發(fā)酵罐培養(yǎng)甲烷氧化菌M fn'cto^oW謂OB3b:培養(yǎng)條件為在5L發(fā)酵罐中加入3L 培養(yǎng)基，滅菌后在無菌條件下按10% (體積比)接種量接種M Wc/www/, OB3b種 子菌。發(fā)酵罐密閉培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30"C，采用lmolL"的NaOH溶液和lmolL"的鹽 酸控制發(fā)酵罐pH，使其變化范圍在6.9 7.1之間，甲垸與空氣分別按140mlmin"和lL min"的流速連續(xù)通入，通過攪拌速度控制罐中溶氧在5%以上。細(xì)胞生長情況通過定 時取樣測定細(xì)胞濁度衡量。
上述培養(yǎng)基組成均為(每升)100ml溶液A， lml溶液B，去離子水定容至1L高 溫(121°C)滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C (固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉)。其中， 溶液A (每升)KNO310g， MgS04'7H20 10 g， CaCl2'2H20 2 g，去離子水定容至 1L;溶液B (每升)Fe國EDTA 0.38 g， NaMo04 0.26 g， FeS04 0.5g， MnCl2.4H20 0.02g， CoCl2-6H20 0.05g， H3B03 0.015g， Na-EDTA 0.25g， ZnS04-7H20 0.4g， NiCl2.6H20 0.01 g， CuS04.5H20 0.025 g，去離子水定容至1L;溶液C (每升):Na2HP04.12H20 71.6g， KH2P0426g，去離子水定容至1L， pH值調(diào)至6.8，單獨高溫(121°C)滅菌。
3、 甲烷氧化菌的催化反應(yīng)
分別在發(fā)酵至菌液OD66Q值分別為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0的發(fā)酵罐中，按 照250mlmin"的速度通入丙烯，按照l L min"的速度通入空氣，發(fā)酵罐加熱至35'C， 按照300rpm (攪拌半徑為22.5cm)的速度攪拌發(fā)酵催化反應(yīng)，同時冷凝回收反應(yīng)后 溢出的氣體中的環(huán)氧丙垸，冷凝回收后的氣體去除二氧化碳后(剩余的空氣和丙烯) 繼續(xù)通入反應(yīng)罐進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)分別于反應(yīng)5小時、9小時、21小時和30小時用氣相 色譜檢測計算每升發(fā)酵液產(chǎn)生的環(huán)氧丙垸的量。
不同發(fā)酵液濃度(OD66Q值分別為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5或3.0)生成環(huán)氧丙烷 的產(chǎn)量(3L發(fā)酵液反應(yīng)5小時、9小時、21小時或30小時的總產(chǎn)量)結(jié)果如圖l所示， 結(jié)果表明，利用不同的發(fā)酵階段的發(fā)酵液催化丙烯，產(chǎn)物環(huán)氧丙烷的單位時間產(chǎn)量 隨著細(xì)胞濃度的增加而增加。在OD66o處于0.5 3.0范圍內(nèi)，環(huán)氧丙烷的產(chǎn)量(3L發(fā)酵 液反應(yīng)5小時、9小時、21小時或30小時的總產(chǎn)量)與發(fā)酵液的濁度之間呈線性關(guān)系，
即高細(xì)胞濃度可以提高產(chǎn)物產(chǎn)量。
催化反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)氧丙垸產(chǎn)量隨反應(yīng)時間變化而變化如圖2所示，結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)
進(jìn)行21h時，環(huán)氧丙垸產(chǎn)量基本達(dá)到最高。在利用甲垸氧化菌催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧
丙垸的連續(xù)操作體系中，可以通過控制停留時間，得到較高的環(huán)氧丙烷產(chǎn)率。
上述催化反應(yīng)后，將OD66o為3.0的發(fā)酵罐溫度調(diào)至3(TC，繼續(xù)按照步驟2的方法 進(jìn)行發(fā)酵恢復(fù)活性10個小時，然后可繼續(xù)按照上述方法進(jìn)行催化反映生產(chǎn)環(huán)氧丙烷。 經(jīng)過五次催化反應(yīng)21小時一發(fā)酵恢復(fù)活性10小時循環(huán)，通過冷凝收集排出氣體中的 環(huán)氧丙烷，剩余氣體經(jīng)過二氧化碳吸收去除二氧化碳后，通入反應(yīng)體系中繼續(xù)進(jìn)行 反應(yīng)。表明Me /^/ow'"M ^'c/ o印on'wm OB3b依然保持每次催化反應(yīng)的環(huán)氧丙烷的總產(chǎn) 量(3 L發(fā)酵液)為509mg以上。該循環(huán)反應(yīng)也可在兩個密閉罐中進(jìn)行連續(xù)的循環(huán)反 應(yīng)，即發(fā)酵罐和反應(yīng)罐，發(fā)酵罐保持上述步驟2的發(fā)酵體系和溫度，反應(yīng)罐保持上述 催化反應(yīng)體系和溫度，兩罐之間通過管道連接，通過泵動力控制倆罐之間的菌液循 環(huán)和停留時間。反應(yīng)罐通過冷凝收集排出氣體中的環(huán)氧丙垸，剩余氣體經(jīng)過二氧化 碳吸收去除二氧化碳后，通入反應(yīng)體系中繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)酵罐的排除氣體經(jīng)過二 氧化碳吸收去除二氧化碳后，通入發(fā)酵體系中。
實施例2、利用甲基球菌(Me^y/ococc^ ca戸wtow^ Bath (美國典型微生物菌 種保藏中心，編號19069)發(fā)酵液催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷。 1、甲烷氧化菌發(fā)酵種子液的制備
在70ml的可密封的玻璃培養(yǎng)瓶中分裝10ml培養(yǎng)基，用接種環(huán)從斜面或固體平板 上挑取一環(huán)菌苔接種，加蓋密封橡膠塞。在上層空氣中置換入10ml過濾除菌后的甲 烷，使瓶中空氣與甲垸的體積比約為1:5。 45°C， 170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時 重新置換入甲烷氣體(空氣甲垸=1:5， v/v)，培養(yǎng)5 7天至對數(shù)生長中期。將 上述菌種以10% (v/v)的接種量接種至300ml螺口搖瓶(裝液量50ml)，利用帶有聚 四氟乙烯密封墊的瓶蓋密封，在上層空氣中置換入50ml過濾除菌后的甲垸，使瓶中 空氣與甲垸的體積比約為1:5。 45°C， 170ipm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時重新置換入 甲垸氣體(空氣甲烷=1:5， v/v)，培養(yǎng)3 4天至對數(shù)生長中期。該甲烷氧化菌 可以作為接種至發(fā)酵罐中的種子菌。
發(fā)酵罐培養(yǎng)甲烷氧化菌甲基球菌(Me^y/ococcusca/ww/a^^ Bath。培養(yǎng)條件為 在5L發(fā)酵罐中加入3L培養(yǎng)基，滅菌后在無菌條件下按10% (體積比)接種量接種^T. Bath種子菌。發(fā)酵罐密閉培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為45。C，采用lmolL"的NaOH溶液和lmolL—1 的鹽酸控制發(fā)酵罐pH，使其變化范圍在6.9 7.1之間，甲烷與空氣分別按140mlmin'1
和l L min"的流速連續(xù)通入，通過攪拌速度控制罐中溶氧在5%以上。細(xì)胞生長情況 通過定時取樣測定細(xì)胞濁度衡量。
上述培養(yǎng)基組成均為(每升)100ml溶液A， lml溶液B，去離子水定容至1L高 溫(12rC)滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C (固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉)。其中， 溶液A (每升)KNO310g， MgS04'7H20 10 g， CaCl2'2H20 2 g，去離子水定容至 1L;溶液B (每升)Fe-EDTA 0.38 g， NaMo04 0.26 g， FeS04 0.5g， MnCl2.4H20 0.02g， CoCl2.6H20 0.05g， H3B03 0.015g， Na-EDTA 0.25g, ZnS04.7H20 0.4g， NiCl2.6H20 0.01 g， CuS04'5H20 0.025 g，去離子水定容至1L;溶液C (每升)Na2HP04'12H20 71.6g, KH2P0426g，去離子水定容至1L， pH值調(diào)至6.8，單獨高溫(121°C)滅菌。
3、甲烷氧化菌的催化反應(yīng)
分別在發(fā)酵至OD66o值分別為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0的的發(fā)酵罐中，按照 250 ml min"的速度通入丙烯，按照l L min"的速度通入空氣，繼續(xù)在45。C，按照 300rpm (攪拌半徑為22.5cm)的速度攪拌發(fā)酵催化反應(yīng)，同時冷凝回收反應(yīng)后溢出 的氣體中的環(huán)氧丙烷，冷凝回收后的氣體去除二氧化碳后(空氣和丙烯)繼續(xù)通入 反應(yīng)罐進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)分別于反應(yīng)5小時、9小時、21小時和30小時用氣相色譜檢測 計算每發(fā)酵液產(chǎn)生的環(huán)氧丙垸的量。
不同菌液濃度生成環(huán)氧丙垸的產(chǎn)量(3L發(fā)酵液反應(yīng)5小時、9小時、21小時或30 小時的總產(chǎn)量)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，利用不同的發(fā)酵階段的發(fā)酵液催化丙烯， 產(chǎn)物環(huán)氧丙垸的產(chǎn)量隨著細(xì)胞濃度的增加而增加。在OD66o處于0.5 3.0范圍內(nèi)，環(huán)氧 丙烷產(chǎn)量(3L發(fā)酵液反應(yīng)5小時、9小時、21小時或30小時的總產(chǎn)量)與發(fā)酵液的濁 度之間呈線性關(guān)系。即高細(xì)胞濃度可以提高產(chǎn)物產(chǎn)量。
催化反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)氧丙烷隨反應(yīng)時間變化而變化如圖4所示，結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行 21h時，環(huán)氧丙烷產(chǎn)量基本達(dá)到最高。在利用甲垸氧化菌催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧丙垸 的連續(xù)操作體系中，可以通過控制停留時間，得到較高的環(huán)氧丙烷產(chǎn)率。
上述催化反應(yīng)后，將OD66o為3.0的發(fā)酵罐，繼續(xù)按照步驟2的方法進(jìn)行發(fā)酵恢復(fù) 活性10小時，然后可繼續(xù)按照上述方法進(jìn)行催化反映生產(chǎn)環(huán)氧丙烷。經(jīng)過五次催化 反應(yīng)21小時一發(fā)酵恢復(fù)活性10小時循環(huán)，表明Me^y/ococcw ca/ww/af船Bath依然保持 每次催化反應(yīng)的環(huán)氧丙烷的總產(chǎn)量為570mg (每3L發(fā)酵液)以上。
將上述催化反應(yīng)體系中同時按140 ml min"的流速通入甲垸，可連續(xù)進(jìn)行催化反 應(yīng)生產(chǎn)環(huán)氧丙烷，反應(yīng)過程中通過管道和泵補(bǔ)充培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)OD66Q在0.5-3之間， 通過冷凝收集排出氣體中的環(huán)氧丙垸，剩余氣體經(jīng)過二氧化碳吸收去除二氧化碳后， 通入反應(yīng)體系中。經(jīng)過21小時的連續(xù)發(fā)酵表明，環(huán)氧丙垸的產(chǎn)率為每小時9.05mg/L發(fā)酵液。
實施例3、利用Me快j;/ow'mw m'c/zos; oWwm Y9 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中 心購買，編號1803)發(fā)酵液催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷。
1、 甲垸氧化菌發(fā)酵種子液的制備
在70 ml的可密封的玻璃培養(yǎng)瓶中分裝10 ml培養(yǎng)基，用接種環(huán)從斜面或固體平板 上挑取一環(huán)^fe^y/oy/"船Wc/wwoWwm Y9菌苔接種與玻璃培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加蓋 密封橡膠塞。在上層空氣中置換入10ml過濾除菌后的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體 積比約為1:5。 30°C， 170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時重新置換入甲烷氣體(使空 氣甲垸=1:5， v/v)，培養(yǎng)5 7天至對數(shù)生長中期。
將上述生長至對數(shù)生長中期的Me^y/ow'"us Wc/w^or/wm Y9菌種以10% (v/v)的 接種量接種至300ml螺口搖瓶(裝培養(yǎng)基量50ml)，利用帶有聚四氟乙烯密封墊的瓶 蓋密封，在上層空氣中置換入50ml過濾除菌后的甲烷，使瓶中空氣與甲烷的體積比 約為1:5。 30°C， 170rpm空氣浴搖床培養(yǎng)，每24小時重新置換入甲烷氣體(使空氣 甲垸=1:5， Wv)，培養(yǎng)3 4天至對數(shù)生長中期。該甲垸氧化菌可以作為接種至發(fā) 酵罐中的種子菌。
2、 甲垸氧化菌的發(fā)酵
發(fā)酵罐培養(yǎng)甲垸氧化菌M. Wc/zo^w^m Y9:培養(yǎng)條件為在5L發(fā)酵罐中加入3L培 養(yǎng)基，滅菌后在無菌條件下按10% (體積比)接種量接種M Wc/zo^oWwm Y9種子菌。 發(fā)酵罐密閉培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30。C，采用lmolL"的NaOH溶液和lmolL"的鹽酸控制 發(fā)酵罐pH，使其變化范圍在6.9 7.1之間，甲垸與空氣分別按140mlmin"和l Lmin—1 的流速連續(xù)通入，通過攪拌速度控制罐中溶氧在5%以上。細(xì)胞生長情況通過定時取 樣測定細(xì)胞濁度衡量。
上述培養(yǎng)基組成均為(每升)100ml溶液A， lml溶液B，去離子水定容至1L高 溫(121°C)滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C (固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉)。其中， 溶液A (每升):KNO310g， MgS047H20 10 g， CaCl2.2H20 2 g，去離子水定容至 1L;溶液B (每升)Fe-EDTA 0.38 g， NaMo04 0.26 g， FeS04 0.5g， MnCl2'4H20 0.02g， CoCl26H20 0.05g， H3B03 0.015g， Na-EDTA 0.25g， ZnS047H20 0.4g， NiCl26H20 0.01 g， CuS(V5H20 0.025 g，去離子水定容至1L;溶液C (每升)Na2HP04'12H20 71.6g， KH2P0426g，去離子水定容至1L, pH值調(diào)至6.8，單獨高溫(121°C)滅菌。
3、 甲烷氧化菌的催化反應(yīng)
分別在發(fā)酵至菌液OD66。值分別為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0的發(fā)酵罐中，按 照250mlmin"的速度通入丙烯，按照l L min"的速度通入空氣，發(fā)酵罐加熱至35。C，
按照300rpm (攪拌半徑為22.5cm)的速度攪拌發(fā)酵催化反應(yīng)，同時冷凝回收反應(yīng)后 溢出的氣體中的環(huán)氧丙烷，冷凝回收后的氣體去除二氧化碳后(空氣和丙烯)繼續(xù) 通入反應(yīng)罐進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)分別于反應(yīng)5小時、9小時、21小時和30小時用氣相色譜 檢測計算每發(fā)酵液產(chǎn)生的環(huán)氧丙垸的量。
不同發(fā)酵液濃度生成環(huán)氧丙烷的產(chǎn)量(每3L發(fā)酵液反應(yīng)5小時、9小時、21小時 或30小時的總產(chǎn)量)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，利用不同的發(fā)酵階段的發(fā)酵液催化 丙烯，產(chǎn)物環(huán)氧丙烷的產(chǎn)量(每3L發(fā)酵液反應(yīng)5小時、9小時、21小時或30小時的總 產(chǎn)量)隨著細(xì)胞濃度的增加而增加。在0066()處于0.5~3.0范圍內(nèi)，環(huán)氧丙烷產(chǎn)量(反 應(yīng)5小時、9小時、21小時或30小時的總產(chǎn)量)與發(fā)酵液的濁度之間呈線性關(guān)系，即 高細(xì)胞濃度可以提高產(chǎn)物產(chǎn)率。
催化反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)氧丙烷隨反應(yīng)時間變化而變化如圖6所示，結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行 21h時，環(huán)氧丙烷產(chǎn)量基本達(dá)到最高。在利用甲垸氧化菌催化氧化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧丙垸 的連續(xù)操作體系中，可以通過控制停留時間，得到較高的環(huán)氧丙垸產(chǎn)率。
上述催化反應(yīng)后，將OD66o為3.0的發(fā)酵罐溫度調(diào)至3(TC，繼續(xù)按照步驟2的方法 進(jìn)行發(fā)酵恢復(fù)活性10個小時，然后可繼續(xù)按照上述方法進(jìn)行催化反映生產(chǎn)環(huán)氧丙烷。 經(jīng)過五次催化反應(yīng)21小時一發(fā)酵恢復(fù)活性10小時循環(huán)，通過冷凝收集排出氣體中的 環(huán)氧丙烷，剩余氣體經(jīng)過二氧化碳吸收去除二氧化碳后，通入反應(yīng)體系中繼續(xù)進(jìn)行 反應(yīng)。表明Me^y/(w/"^ Wc/ oy; w7'Mw Y9依然保持每次催化反應(yīng)的環(huán)氧丙垸的產(chǎn)量為 490mg (每3L發(fā)酵液)以上。該循環(huán)反應(yīng)也可在兩個密閉罐中進(jìn)行連續(xù)的循環(huán)反應(yīng)， 即發(fā)酵罐和反應(yīng)罐，發(fā)酵罐保持上述步驟2的發(fā)酵體系和溫度，反應(yīng)罐保持上述催化 反應(yīng)體系和溫度，倆罐之間通過管道聯(lián)系，通過泵動力控制倆罐之間的菌液循環(huán)和 停留時間。反應(yīng)罐通過冷凝收集排出氣體中的環(huán)氧丙烷，剩余氣體經(jīng)過二氧化碳吸 收去除二氧化碳后，通入反應(yīng)體系中繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)酵罐的排除氣體經(jīng)過二氧化 碳吸收去除二氧化碳后，通入發(fā)酵體系中。
權(quán)利要求
1、一種生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法，是在發(fā)酵得到的甲烷氧化菌液中直接通入丙烯以及氧氣或空氣，催化反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甲垸氧化菌液的OD66()為 0.5~3.0。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述催化反應(yīng)的溫度為35-45'C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述催化反應(yīng)得到的環(huán)氧丙 烷通過冷凝回收。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化菌為甲基桿菌 (Methylobacter)， 甲基單胞菌(Methylomonas probus)，Methylosoma, 甲基微菌(Methylomicrobium album)， 甲基球菌(Methylococcus capsuls) 甲基 暖菌(Methylocaldum)， 甲基熱菌(Methylothermus)、 甲基鹽菌(Methylohalobius)， 甲基八疊球菌 (Methylosarcina Quisquiliarum)， 甲基球形菌 (Methylosphaera), 甲基孢囊菌(Methylocystis sp.)， 甲基彎菌(Methylosinus trichosporium), Methylocapsa 或 Methlocella palustris.
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述催化反應(yīng)的時間為10-30小 時；所述催化反應(yīng)后甲烷氧化菌發(fā)酵液通過恢復(fù)催化能力作為下一次催化反應(yīng)的發(fā) 酵液；所述恢復(fù)催化能力為在所述甲烷氧化菌發(fā)酵條件下繼續(xù)發(fā)酵8—10小時。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于當(dāng)所述甲垸氧化菌的發(fā)酵溫度為 35'C以上時，所述甲垸氧化菌的發(fā)酵和催化反應(yīng)同時進(jìn)行，即在所述催化反應(yīng)的同 時間歇或連續(xù)通入甲烷；當(dāng)所述甲烷氧化菌的發(fā)酵溫度低于35'C時，所述催化反應(yīng) 體系與所述甲烷氧化菌的培養(yǎng)體系為在一個反應(yīng)罐中間歇調(diào)節(jié)溫度至培養(yǎng)溫度并通 入甲烷代替丙烯進(jìn)行甲垸氧化菌的催化能力或通過菌液在兩個體系中不斷循環(huán)流 動，在催化反應(yīng)的過程中保持所述甲烷氧化菌的催化能力。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化氧化丙烯制備環(huán)氧丙烷的方法。該方法，是在發(fā)酵得到的甲烷氧化菌液中直接通入丙烯以及氧氣或空氣，催化反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷。本發(fā)明利用甲烷氧化菌的發(fā)酵液，不經(jīng)預(yù)處理，即可應(yīng)用于催化氧化反應(yīng)中，催化反應(yīng)活性高，轉(zhuǎn)化效率高，選擇性專一，與緩沖溶液催化體系相比，具有操作簡便，細(xì)胞催化活性控制容易，生產(chǎn)效率高，運行成本低，反應(yīng)周期短，產(chǎn)物分離方便等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/26GK101392277SQ200810225729
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者昊 吳, 程 楊, 皓 江, 濤 蘇, 邢新會, 冰 韓 申請人:清華大學(xué)