專利名稱：能誘導干細胞向成骨細胞分化的微小rna及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能誘導干細胞向成骨細胞分化的微小RNA及其應用。
背景技術：
微小RNA (microRNA)是一類長度約為21-24個核苷酸的非編碼RNA，在基因 的表達調(diào)節(jié)中起重要作用。微小RNA與Ago等酶和蛋白形成復合物結(jié)合到耙基因的 mRNA3'非翻譯區(qū)，阻礙mRNA的翻譯或造成mRNA的降解。有證據(jù)提示微小RNA參 與生命過程中一系列的重要進程，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、死亡、個體發(fā)育等生 物學功能。微小RNA可被看作為一類內(nèi)源性的小干擾RNA。小RNA將成為繼化學藥 物和蛋白類藥物之后的第三代藥物。但是化學合成的微小RNA要進入臨床應用存在 如下幾個問題1)微小RNA在體液中的穩(wěn)定性差；2)微小RNA要進入細胞需要 體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑的介導，而目前使用的體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑存在效率差、用量大、毒性較大 的問題；3)化學合成的微小RNA半衰期短、需多次用藥、成本難以承受。用病毒 類載體表達微小RNA可以克服化學合成的微小RNA存在的問題，但病毒載體的安全 性堪憂。
干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，能分化發(fā)育成不同的組織細 胞。干細胞的自我更新和多向分化過程的調(diào)控機制復雜，近期的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA 正是這些復雜的調(diào)控機制中非常重要的組成部分，在發(fā)育中扮演著主要角色，是干 細胞命運的決定因子。盡管有大量證據(jù)顯示千細胞治療為某些傳統(tǒng)方法難以治愈的 疾病提供了新的療法，有良好的應用前景，但臨床上仍然存在質(zhì)疑之聲。除安全 性的考慮之外，缺乏細胞替代的證據(jù)以及由此引起的療效不持久是引起質(zhì)疑的重要 原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類能誘導干細胞向成骨細胞分化的微小RNA及其應用。 本發(fā)明所提供的微小RNA，是下述核糖核酸之一 1)是下述al)的雙鏈RNA或bl)的單鏈RNA:
al)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列l(wèi)，另一條鏈與序列表中序列1反 向互補；
bl)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列1的單鏈RNA分子和核苷酸序
列與序列表中序列1反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
2) 是下述a2)的雙鏈RNA或b2)的單鏈RNA:
a2)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列2，另一條鏈與序列表中序列2反 向互補；
b2)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列2的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列2反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
3) 是下述a3)的雙鏈RNA或b3)的單鏈RNA:
a3)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列3，另一條鏈與序列表中序列3反 向互補；
b3)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列3的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列3反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
4) 是下述a4)的雙鏈RNA或b4)的單鏈RNA:
a4)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列4，另一條鏈與序列表中序列4反 向互補；
b4)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列4的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列4反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
5) 是下述a5)的雙鏈RNA或b5)的單鏈RNA:
a5)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列5，另一條鏈與序列表中序列5反 向互補；
b5)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列5的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列5反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
6) 是下述a6)的雙鏈RNA或b6)的單鏈RNA:
a6)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列6，另一條鏈與序列表中序列6反 向互補；b6)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列6的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列6反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
7) 是下述a7)的雙鏈RNA或b7)的單鏈RNA:
a7)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列7，另一條鏈與序列表中序列7反 向互補；
b7)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列7的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列7反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
8) 是下述a8)的雙鏈RNA或b8)的單鏈RNA:
a8)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列8，另一條鏈與序列表中序列8反 向互補；
b8)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列8的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列8反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA;
9) 是下述a9)的雙鏈RNA或b9)的單鏈RNA:
a9)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列9，另一條鏈與序列表中序列9反 向互補；
b9)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列9的單鏈RNA分子和核苷酸序 列與序列表中序列9反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子； 所述連接序列為TTCAAGAGA。
其中，所述微小RNA也可經(jīng)過2'-脫氧化學修飾。
導入本發(fā)明所述的微小RNA的細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述細胞為人的 成體干細胞。導入微小RNA的人的成體干細胞可以用于骨科疾病治療，或植于骨支 架材料中(scafold materials)進行復合培養(yǎng)，用于骨缺損或股骨頭壞死的治療。
其中，所述人的成體干細胞具體可為骨髓基質(zhì)干細胞、臍帶血千細胞、外周血 干細胞或羊膜干細胞。所述骨科疾病具體可為骨質(zhì)疏松、骨折、骨裂、骨缺損或股 骨頭壞死等。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療骨科疾病的藥物。 本發(fā)明所提供的治療骨科疾病的藥物，其活性成分為所述的微小RNA。
其中，所述骨科疾病具體可為骨質(zhì)疏松、骨折、骨裂、骨缺損或股骨頭壞死。
所述的微小RNA可以與脂質(zhì)體、納米顆粒、PEI、蛋白或多肽類的轉(zhuǎn)染試劑混
合后制成所述的治療骨科疾病的藥物。
所述治療骨科疾病的藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理
或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物
質(zhì)混合或包裹后導入機體。
本發(fā)明所提供的治療骨科疾病的藥物，還可以是其活性成分為含有所述微小
RNA的人的成體干細胞。
本發(fā)明的微小RNA可以在體外導入人的成體干細胞，所述的人的成體干細胞即 可作為治療骨科疾病的藥物。也可以將導入微小RNA的人的成體干細胞種植于骨支 架材料(scafold materials)中進行復合培養(yǎng)后，再用于骨缺損或股骨頭壞死的 治療。所述人的成體干細胞具體可為骨髓基質(zhì)干細胞、臍帶血干細胞、外周血干細 胞或羊膜干細胞。所述骨科疾病為骨質(zhì)疏松、骨折、骨裂、骨缺損或股骨頭壞死。
所述治療骨科疾病的藥物可經(jīng)靜脈注射輸入體內(nèi)或經(jīng)局部注射進入病變的組織。
本發(fā)明的微小RNA可誘導骨髓基質(zhì)干細胞(MSC)及其它成體組織干細胞向成 骨細胞分化。本發(fā)明的化學合成的在體外使用還避免了微小RNA在體液中的穩(wěn)定性 差，體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑效率差、用量大、毒性較大的缺點；且半衰期長、無需多次用 藥。


圖1 miR-20家族。
圖2為熒光顯微鏡觀察微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞。 圖3為微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞的堿性磷酸酶活性。 圖4為微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞的茜紅染色。 圖5為RT-PCR檢測結(jié)果。
具體實施例方式
實施例l、微小RNA誘導干細胞成骨分化 1)微小RNA的制備
微小RNA選自人類miR-20家族的成熟微小RNA的序列，來自miRBase (http:〃microrna. Sanger, ac. uk/sequences/index. sht.ml)， 分另U命名為
miR-17-5p (其核苷酸序列為序列表中的序列l(wèi)) 、 miR-18a (其核苷酸序列為序列 表中的序列2) 、 miR-18b (其核苷酸序列為序列表中的序列3) 、 miR-20a (其核苷 酸序列為序列表中的序列4) 、 miR-20b (其核苷酸序列為序列表中的序列5) 、 miR-93 (其核苷酸序列為序列表中的序列6) 、 miR-106a (其核苷酸序列為序列表中的序 列7) 、 miR-106b (其核苷酸序列為序列表中的序列8)和miR-519d (其核苷酸序列 為序列表中的序列9)。上述的微小RNA為雙鏈RNA，由上海吉瑪(GenePharma)公 司用化學法合成。另設隨機序列為對照l，隨機序列正義鏈的序列為序列表中的序 列IO。圖l顯示miR-20家族的微小RNA。 9個微小RNA均屬于的miR-20家族。它們在5' 端l-8位的堿基序列極其相似，該區(qū)域被稱為種子區(qū)，是與靶基因結(jié)合的保守部位。 同一家族的微小RNA因種子區(qū)的序列相似，往往能與相同的靶基因結(jié)合，顯示出相 近的功能。
2)微小RNA誘導干細胞成骨分化的效率檢測
a) 細胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSCs )從健康的成年志愿者捐獻的骨髓中進行 分離，分離方法如下
Ficoll-Hapague密度梯度離心收集MSC，然后在含有10g/100ml胎牛血清(FBS) 和lg/100ml青霉素和鏈霉素的a—MEM培養(yǎng)基(購自GIBCOL)中，37°C 、 5% C02 培養(yǎng)，通過連續(xù)換液和傳代培養(yǎng)可去除里面混雜的血細胞，5代以后得到純的MSC。
然后將MSCs細胞按5X 107孔的密度接種12孔板，24小時后，按照Invitrogen 公司的Lipofectamine2000的說明書，分別將9個微小RNA (其核苷酸序列為序列 表中的序列l(wèi)-9)及對照l (其核苷酸序列為序列表中的序列10)轉(zhuǎn)染MSCs細胞， 轉(zhuǎn)染后的MSCs細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
圖2顯示一個微小RNA轉(zhuǎn)染的MSC熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
熒光顯微鏡觀察結(jié)果，表明微小RNA轉(zhuǎn)染MSCs細胞的轉(zhuǎn)染效率高達90%以上。
b) 微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞的堿性磷酸酶活性
堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期標志，用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(南京
建成生物工程研究所)對成骨細胞的堿性磷酸酶活性進行測定。 堿性磷酸酶檢測方法如下
1) 9個微小RNA及對照1分別轉(zhuǎn)染人的MSCs細胞，培養(yǎng)6天和9天后去掉上 清，用PBS洗3次，加入100ul細胞裂解液(20 mM Tris-HCl (pH 7. 5) ， 150mM NaCl,
and 1 ml/100ml Triton X-100)，冰上裂解15min。 12000rpm離心10min收集蛋 白；
2) 按照堿性磷酸酶活性檢測試劑盒的說明書進行堿性磷酸酶活性的測定，在 402nm下測定OD值；
3) 按照Bio — Rad標準操作測定每個樣品的蛋白含量；
4) 計算堿性磷酸酶的比活力，堿性磷酸酶的比活力=測定的堿性磷酸酶活力/ 蛋白含量。
堿性磷酸酶比活力的測定結(jié)果如圖3所示，表明微小RNAmiR-17-5p， miR-18a， miR-18b， miR-20a， miR-20b， miR-93， miR-106a， miR-106和miR-519d轉(zhuǎn)染的 MSCs細胞培養(yǎng)6和9天后，其堿性磷酸酶的活力與對照相1比明顯提高，尤其以 miR-20a， miR-20b的效果明顯，與對照1相比，3天時堿性磷酸酶活力升高分別為 80%和90%; 6天時堿性磷酸酶活力升高分別為100%和125%。
上述實驗結(jié)果說明9個微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞，與對照1相比，向成骨細 胞分化的速度加快。
圖3中，"106a"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-106a的MSCs細胞；"106b"代表轉(zhuǎn) 染微小RNA miR-106b的MSCs細胞；"519d"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-519d的MSCs 細胞；"20a"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-20a的MSCs細胞；"20b"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-20b的MSCs細胞;"17-5p"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-17-5p的MSCs細胞;"18a" 代表轉(zhuǎn)染微小RNAmiR-18a的MSCs細胞；"18b"代表轉(zhuǎn)染微小認AmiR-18b的MSCs 細胞；"93"代表轉(zhuǎn)染微小RNAmiR-93的MSCs細胞；"Control"代表未轉(zhuǎn)染微 小RNA的MSCs細胞；"NC"代表轉(zhuǎn)染對照1的MSCs細胞。
c)微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞的細胞礦化
成骨細胞分化的最終指標是鈣結(jié)節(jié)及礦化的形成。可用茜紅染色(ARS)來確 定最終的礦化，具體方法如下
1) 9個微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞，培養(yǎng)12天，去掉上清，用PBS洗3次，加 入200ul 4% (體積百分比)多聚甲醛固定lOmin;
2) 用超純水洗滌3次，然后每孔加入300ul 0. 1%的茜紅染液，染色lOmin;
3) 去掉染液，用超純水洗滌3次，顯微鏡下觀察拍照。 茜紅染色結(jié)果如圖4所示，表明微小RNAmiR-17-5p， miR-18a， miR-18b，
miR-20a， miR-20b， miR-93， miR-106a， miR-106和miR-519d轉(zhuǎn)染的MSCs細胞呈
現(xiàn)紅色，而對照l和未轉(zhuǎn)染微小RNA的MSCs細胞不未染上紅色。上述實驗結(jié)果說 明微小RNAmiR-17、 miR-18a、 miR-18b、 miR-20a、 miR-20b、 miR-93、 miR-106a、 raiR-106和miR-519d能加快MSCs細胞向成骨細胞分化。 d) RT-PCR檢測
用1 ml TRIzol(GIBCOL)裂解步驟a)的微小RNA轉(zhuǎn)染的MSCs細胞，并按TRIzol 產(chǎn)品說明的操作規(guī)程提取總RNA。用DNase I 37卩消化總RNA 30分鐘后，按照DNase I產(chǎn)品說明提純總RNA，然后對總RNA進行定量和質(zhì)量鑒定。逆轉(zhuǎn)錄反應用Promega 公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系，將lug的總RNA與0. 5ug的Oligo dT混合，加熱5 分鐘，迅速冷卻至0t:，按產(chǎn)品說明加入緩沖液，42"C孵育1小時，逆轉(zhuǎn)錄反應后 的cDNA，作為PCR反應的模板進行擴增反應。PCR反應的引物序列如下
BMP2-P1: 5' GTATCGCAGGCACTCAGGT3';
BMP2-P2: 5' CACTTCCACCACGAATCCATC3'。
GAPDH-P3: 5' TCCATGACAACTTTGGTATCG3';
GAPDH-P4: 5' TGTAGCCAAATTCGTTGTCA3'。
PCR擴增結(jié)果如圖4所示，表明細胞成骨分化的關鍵基因BMP2的表達上調(diào)，說 明微小RNA是通過BMP2信號通路來誘導MSCs細胞成骨分化的。
圖4中，"Control"代表未轉(zhuǎn)染微小RNA的MSCs細胞；"NC"代表轉(zhuǎn)染對 照1的的MSCs細胞，"20a"代表轉(zhuǎn)染微小RNA miR-20a的MSCs細胞。
實施例2、治療骨科疾病的細胞的制備
采集患者自身的骨髓，F(xiàn)icoll-Hapague密度梯度離心收集MSC，然后在含有 10g/100ml胎牛血清(FBS)和lg/100ml青霉素和鏈霉素的a—MEM培養(yǎng)基(購自 GIBC0L)中，37°C、 5。/。C02培養(yǎng)，通過連續(xù)換液和傳代培養(yǎng)可去除里面混雜的血細 胞，5代以后得到純的MSC。然后將MSCs細胞按5X107孔的密度接種12孔板，24 小時后，按照Invitrogen公司的Lipofectaraine2000的說明書，分別將9個微小 RNA (其核苷酸序列為序列表中的序列1-9)及對照1 (其核苷酸序列為序列表中的 序列10)轉(zhuǎn)染MSCs細胞，轉(zhuǎn)染后的MSCs細胞繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，可用于治療骨科疾 病，也可以將導入微小RNA的細胞注入骨組織工程支架材料中(scafold materials)，在體外培養(yǎng)6天，成為能治療骨科疾病的材料。
序列表
<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 12</formula>
<210〉 3
〈211〉 22
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 3
uaaggugcau cuagugcagu ua 22
<210〉 4
<211> 23
〈212> RNA 〈213〉人工序列
<220〉 〈223〉
<400> 4
uaaagugcuu auagugcagg uag 23
〈210〉 5
〈211〉 23
〈212〉 RNA <213〉人工序列
<220〉 <223>
<400> 5
caaagugcuc肌agugcagg uag
〈210〉 6
〈211〉 23
<212〉 RNA <213〉人工序列
<220> <223>
<400> 6
caaagugcug uucgugcagg uag
<210〉 7
<211〉 23
〈212〉 腿 <213>人工序列
<220〉 <223>
〈400〉 7
aaaagugcuu acagugcagg uag
<210> 8
<211> 21
<212〉 RNA <213>人工序列
<220>
〈223> <400〉 8
uaaagugcug acagugcaga u 21
〈210〉 9
<211〉 23
〈212〉 腿 〈213>人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 9
caaagugccu cccuuuagag ugu 2權利要求
1、一種微小RNA，是下述核糖核酸之一1)是下述a1)的雙鏈RNA或b1)的單鏈RNAa1)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列1，另一條鏈與序列表中序列1反向互補；b1)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列1的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列1反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；2)是下述a2)的雙鏈RNA或b2)的單鏈RNAa2)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列2，另一條鏈與序列表中序列2反向互補；b2)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列2的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列2反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；3)是下述a3)的雙鏈RNA或b3)的單鏈RNAa3)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列3，另一條鏈與序列表中序列3反向互補；b3)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列3的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列3反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；4)是下述a4)的雙鏈RNA或b4)的單鏈RNAa4)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列4，另一條鏈與序列表中序列4反向互補；b4)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列4的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列4反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；5)是下述a5)的雙鏈RNA或b5)的單鏈RNAa5)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列5，另一條鏈與序列表中序列5反向互補；b5)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列5的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列5反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；6)是下述a6)的雙鏈RNA或b6)的單鏈RNAa6)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列6，另一條鏈與序列表中序列6反向互補；b6)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列6的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列6反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；7)是下述a7)的雙鏈RNA或b7)的單鏈RNAa7)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列7，另一條鏈與序列表中序列7反向互補；b7)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列7的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列7反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；8)是下述a8)的雙鏈RNA或b8)的單鏈RNAa8)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列8，另一條鏈與序列表中序列8反向互補；b8)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列8的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列8反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA；9)是下述a9)的雙鏈RNA或b9)的單鏈RNAa9)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列9，另一條鏈與序列表中序列9反向互補；b9)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列9的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列9反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA。
2、 根據(jù)權利要求1所述的微小RNA,其特征在于所述微小RNA經(jīng)過2'-脫氧 化學修飾。
3、 導入權利要求1或2所述微小RNA的細胞，所述細胞為人的成體干細胞。
4、 根據(jù)權利要求3所述的細胞，其特征在于所述人的成體干細胞為骨髓基質(zhì) 干細胞、臍帶血千細胞、外周血干細胞或羊膜干細胞。
5、 一種治療骨科疾病的藥物，其活性成分為權利要求1所述的微小RNA。
6、 根據(jù)權利要求5所述的藥物，其特征在于所述骨科疾病為骨質(zhì)疏松、骨折、 骨裂、骨缺損或股骨頭壞死。
7、 一種治療骨科疾病的藥物，其活性成分為導入權利要求1或2所述微小RNA的人的成體干細胞。
8、 根據(jù)權利要求7所述的藥物，其特征在于所述人的成體干細胞為骨髓基質(zhì)干細胞、臍帶血干細胞、外周血干細胞或羊膜干細胞。
9、 根據(jù)權利要求7所述的藥物，其特征在于所述骨科疾病為骨質(zhì)疏松、骨折、骨裂、骨缺損或股骨頭壞死。
10、 植入權利要求3或4所述細胞的骨組織工程支架材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能誘導干細胞向成骨細胞分化的微小RNA及其應用。本發(fā)明公開的微小RNA，是下述核糖核酸之一是下述a1)的雙鏈RNA或b1)的單鏈RNAa1)其一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列1-9，另一條鏈與序列表中序列1-9反向互補；b1)通過連接序列將核苷酸序列為序列表中序列1-9的單鏈RNA分子和核苷酸序列與序列表中序列1-9反向互補的單鏈RNA分子連接起來獲得的重組單鏈RNA分子；所述連接序列為TTCAAGAGA。本發(fā)明的微小RNA可制備治療骨科疾病的藥物，該藥物可治療骨質(zhì)疏松、骨折、骨裂，股骨頭壞死等骨科疾病。
文檔編號C12N5/10GK101392251SQ20081022551
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月3日 優(yōu)先權日2008年11月3日
發(fā)明者孔祥復, 張錦芳, 張雅鷗, 李國喜, 祥 胡, 謝偉東 申請人:清華大學深圳研究生院;深圳市北科生物科技有限公司