專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)柔紅霉素的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
蒽環(huán)類抗生素(Anthracyclines)是一類重要的抗腫瘤藥物，它們均由一個基于 7，8，9，10-四氫-5，12-萘醌框架結(jié)構(gòu)的蔥環(huán)酮的發(fā)色團(糖普配基，aglycon)通過糖苷鍵 和一種或幾種不同的糖連接而成，蒽環(huán)類抗生素的結(jié)構(gòu)變化主要有(l)蒽環(huán)上的配基(如 輕基的數(shù)量和位置、甲氧基和羰基的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)等)不同；(2)糖的數(shù)量、種類和排列順 序差異；(3)糖苷鍵的位置和立體化學(xué)結(jié)構(gòu)不同等。絕大多數(shù)蒽環(huán)類抗生素具有很強的骨 髓抑制和心臟毒性不能應(yīng)用于臨床。柔紅霉素、阿霉素型蒽環(huán)類抗生素最具臨床應(yīng)用價值， 包括柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素(Iurbicin)、去甲基柔紅霉素(Idarubicin)、阿克拉霉素 (Aclacinomycin)以及洋紅霉素(Carminomycin)等。其中最有代表性的柔紅霉素和阿霉素 的化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的主要區(qū)別在于阿霉素C-14位上有一個羥基。 柔紅霉素(Da皿orubicin， dau謹ycin， DNR)禾口阿霉素(Doxorubicin, adriamycin，DXR)是重要的蒽環(huán)類抗生素，主要用于多種實體瘤和急性白血病的治療，是臨 床上抗腫瘤的一線藥物。柔紅霉素又名正定霉素、紅比霉素(Rubidomycin)、柔毛霉素、紅衛(wèi) 霉素和變紅霉素(Rubomycin)等，自從1963年Di Marco發(fā)現(xiàn)柔紅霉素以來，人們對以柔紅 霉素為代表的蒽環(huán)類抗生素及其產(chǎn)生菌進行了廣泛深入的研究。 柔紅霉素是一些鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物，例如波賽鏈霉菌(S. peucetius)，天藍 淡紅鏈霉菌(S. coeruleorubidus) ， S. insignis ATCC 31913，灰色鏈霉菌(S. griseus) IMETJA3933、 JA 5142和JA 5570，鏈霉菌(S. sp.)C5等。 柔紅霉素作為老牌的抗生素類藥物，目前國內(nèi)外研究者更多地將注意力集中到 了如何篩選出優(yōu)良的菌種，或不斷改進發(fā)酵和提取工藝，反而依然使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方，
傳統(tǒng)培養(yǎng)基組成配比為玉米淀粉麩皮麩質(zhì)粉碳酸鈣磷酸二氫鉀硫酸銨= 7 : i : o. 5 : o. 8 : o. oi : o. i (w/w/w/w/w/w)，(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院優(yōu)秀博士論文，
柔紅霉素C-14羥化酶基因的克隆、表達和應(yīng)用研究，吳大治，2003年7月)，由于這種傳統(tǒng)
的培養(yǎng)基有麩質(zhì)粉的存在，發(fā)酵過程中泡沫嚴重，即使選用最好的消泡劑也見效甚微，極易 造成逃液，進而造成染菌，給生產(chǎn)帶來嚴重損失。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決柔紅霉素生產(chǎn)中傳統(tǒng)培養(yǎng)基的不足，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種新的發(fā) 酵生產(chǎn)柔紅霉素的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵生產(chǎn)方法。 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人創(chuàng)造性地提出，用血漿蛋白粉代替麩質(zhì)粉，結(jié)果發(fā) 酵過程中幾乎沒有泡沫產(chǎn)生，后處理萃取過程乳化現(xiàn)象消失，產(chǎn)品中難以精制去除的雜質(zhì) 13- 二氫柔紅霉酮也容易去除，精制步驟由4步減少為3步，精制收率提高8%，產(chǎn)量提高1倍。 上述血漿蛋白粉包括豬血漿蛋白粉、低灰份豬血漿蛋白粉、羊血槳蛋白粉、牛血漿 蛋白粉和血紅蛋白粉等。 發(fā)明人在研究培養(yǎng)基配方過程中意外地發(fā)現(xiàn)，添加硅酸鋰也能提高發(fā)酵效價。
上述經(jīng)過改進后的培養(yǎng)基中還可以加入消泡劑，優(yōu)選消泡劑DF104。
經(jīng)過大量實驗研究，本發(fā)明最終制備出如下培養(yǎng)基，其配方為 麩皮玉米淀粉血漿蛋白粉磷酸二氫鉀硫酸銨碳酸鈣硅酸鋰消泡 剤dfio4二i : 7 : (io 0.05) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oo5) : o. 08 (w/w/w/w/ w/w/w/w)。 更優(yōu)選地，麩皮玉米淀粉血漿蛋白粉磷酸二氫鉀硫酸銨碳酸鈣硅酸 鋰消泡劑DFi04二i : 7 : (i o.i) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oi) : o.08(w/
w/w/w/w/w/w/w)按上述配料比用常規(guī)方法即可制備所需的發(fā)酵培養(yǎng)基。 本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素的方法，該方法采用了上述改進后的培養(yǎng)
基，發(fā)酵選用的菌種為波賽鏈霉菌、天藍淡紅鏈霉菌或灰色鏈霉菌，發(fā)酵工藝采用常規(guī)的工
藝。通過實施例1 14可以看出，通過本發(fā)明提供的方法，柔紅霉素的最終發(fā)酵效價最高 可達2. 47g/L，相比于現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)酵效價，具有顯著的進步。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容不限于以下實施例，與以下具體實施方式
等同的技術(shù)手段同樣
包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 實施例1 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 10kg麩皮、63. 20kg玉米淀粉、90kg豬血漿蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 21kg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完 全溶解混勻后，加入0. 72kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L，密封好發(fā)酵罐口 。 121°C -123t:滅菌30min。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量60. 0m3/h，轉(zhuǎn)速80-200rpm，罐 壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于15 % ，培養(yǎng)120h，培 養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在15%以上水平。
最終發(fā)酵效價2. 01g/L。
實施例2
菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 10kg麩皮、63. 20kg玉米淀粉、90kg豬血漿蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 21kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 90kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌3()111111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 21g/L。
4
實施例3 菌種天藍淡紅鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 02kg麩皮、63. 11kg玉米淀粉、9. 02kg豬血漿蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 11kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 90kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104,加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌30!11111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 35g/L。 實施例4 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 05kg麩皮、63. 01kg玉米淀粉、0. 91kg豬血漿蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 9kg硫酸銨、7. 01kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 90kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104,加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌30!11111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 37g/L。 實施例5 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 02kg麩皮、63. 00kg玉米淀粉、0. 45kg豬血漿蛋白粉、 0. 093kg磷酸二氫鉀、0. 9kg硫酸銨、7. 01kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 90kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104,加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌30!11111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 26g/L。 實施例6 菌種天藍淡紅鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 02kg麩皮、63. 00kg玉米淀粉、8. 12kg豬血漿蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 01kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入9. 02kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104,加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 12rC-123t:滅菌30min。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。
5
最終發(fā)酵效價2. 25g/L。 實施例7 菌種天藍淡紅鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 10kg麩皮、63. 20kg玉米淀粉、45. lkg母豬血漿蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 21kg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入9. lkg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L，密 封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌3()111111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 31g/L。 實施例8 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 02kg麩皮、63. llkg玉米淀粉、4. 5kg母豬血漿蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氫鉀、0. 9kg硫酸銨、7. llkg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完全溶 解混勻后，加入0. 09kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L，密 封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌3()111111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 45g/L。 實施例9 菌種灰色鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9.05kg麩皮、63.01kg玉米淀粉、90kg母豬血漿蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. Olkg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 091kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌30!11111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。最終發(fā)酵效價2. 34g/L。 實施例10 菌種灰色鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9.02kg麩皮、63.00kg玉米淀粉、90kg母豬血漿蛋白粉、 0. 093kg磷酸二氫鉀、0. 9kg硫酸銨、7. Olkg碳酸鈣和400L純化水攪拌溶解，待固體完全 溶解混勻后，加入0. 09kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌30!11111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在
615%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 21g/L。 實施例11 菌種灰色鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 02kg麩皮、63. 00kg玉米淀粉、0. 99kg母豬血漿蛋白 粉、0. 093kg磷酸二氫鉀、0. 9kg硫酸銨、7. Olkg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完 全溶解混勻后，加入44g硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L，密 封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌3()111111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61mVh，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 20g/L。 實施例12 菌種灰色鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 10kg麩皮、63. 20kg玉米淀粉、80. 2kg低灰份血漿蛋白 粉、0. 09kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. 21kg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完 全溶解混勻后，加入0. 76kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 121°C-123°0滅菌3()111111。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15X，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 13g/L。 實施例13 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9.02kg麩皮、63. llkg玉米淀粉、8. 74kg低灰份血漿蛋白 粉、0. 09kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. llkg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完 全溶解混勻后，加入7. 6kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 12rC-123t:滅菌30min。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于 15 % ，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 36g/L。 實施例14 菌種波賽鏈霉菌 向1500L發(fā)酵罐中加入9. 05kg麩皮、63. Olkg玉米淀粉、2. 13kg低灰份血漿蛋白 粉、0. 091kg磷酸二氫鉀、0. 91kg硫酸銨、7. Olkg碳酸f丐和400L純化水攪拌溶解，待固體完 全溶解混勻后，加入0. 45kg硅酸鋰，加入0. 73kg消泡劑DF104，加入純水定至總體積800L， 密封好發(fā)酵罐口。 12rC-123t:滅菌30min。移種后，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓縮空氣流量61m3/h，轉(zhuǎn) 速80-200rpm，罐壓0. 04-0. 06MPa，溫度31°C ，標定溶氧100 % ，發(fā)酵過程控制溶氧不低于15%，培養(yǎng)120h，培養(yǎng)過程中，根據(jù)溶解氧的降低，適當提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最終發(fā)酵效價2. 47g/L。
權(quán)利要求
一種發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于，它含有血漿蛋白粉。
2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，它含有如下成分麩皮、玉米淀粉、磷酸二 氫鉀、硫酸銨和碳酸鈣。
3. 如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，它含有硅酸鋰。
4. 如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于，它含有消泡劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量計，麩皮玉米淀粉血漿蛋白粉磷酸二氫鉀硫酸銨碳酸鈣硅酸鋰消泡劑DFi04為i : 7 : (io 0.05) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oo5) : o.os。
6. 如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量計，麩皮玉米淀粉血漿 蛋白粉磷酸二氫鉀硫酸銨碳酸鈣硅酸鋰消泡劑DFi04為i : 7 : (i o. i) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oi) : o.os。
7. —種發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素的方法，其特征在于，發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為權(quán)利要求l-6任 一所述的培養(yǎng)基。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素所用的菌種為波賽鏈霉 菌、天藍淡紅鏈霉菌或灰色鏈霉菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)柔紅霉素的培養(yǎng)基及方法。本發(fā)明的培養(yǎng)基配方中用血漿蛋白粉代替了麩質(zhì)粉，并添加了硅酸鋰，同時優(yōu)化了培養(yǎng)基各組分的比例。采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基并結(jié)合本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝，大大提高了生產(chǎn)柔紅霉素的發(fā)酵效價，降低了生產(chǎn)柔紅霉素的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/545GK101760491SQ200810188538
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者趙志全 申請人:魯南制藥集團股份有限公司