專利名稱：用于重組aav5/5病毒載體包裝的重組單純皰疹病毒及其用途的制作方法
用于重組AAV5/5病毒載體包裝的重組單純皰疹病毒及其
用途 本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。具體涉及一種攜帶來自5型腺相關(guān)病毒(AAV5) 的r印基因(r印5)和外殼蛋白基因(c即5)的重組單純皰疹病毒HSVl-r印5c即5，以及用 HSVl-r印5c即5制備AAV5/5病毒的方法。這種重組單純皰疹病毒能提供攜帶AAV5ITR的載 體質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和包裝成rAAV5/5毒粒所需的全部輔助功能，并能用于rAAV5/5的大 量制備。HSVl-r印5c即5是通過對(duì)一套含有HSVl病毒全基因組的粘性質(zhì)粒(Set C粘粒，包 括cos6， cosl4， cos28， cos48， cos56)進(jìn)行基因操作，將r印5c即5片段插入HSV1基因組的 非必需基因中得到。
背景 腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)因在腺病毒制品中發(fā)現(xiàn)而得名。腺 伴隨病毒(adeno-associated virus， AAV)是微小病毒禾斗(parvovirus)成員，其基因組為 4682個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA。 AAV是依賴性病毒，需要其它病毒如腺病毒或單純皰疹病 毒，或輔助因素提供輔助功能才能復(fù)制。在沒有輔助病毒存在時(shí)，AAV感染細(xì)胞后其基因組 將整合到細(xì)胞染色體中成為潛伏狀態(tài)，而不產(chǎn)生子代病毒。 最早分離到的AAV病毒是血清型2型AAV (AAV2) 。 AAV2基因組長(zhǎng)約4. 7kb，基因組 兩端為長(zhǎng)度145bps的"反向末端重復(fù)序列"(ITR)，呈回文-發(fā)卡結(jié)構(gòu)?；蚪M中有兩個(gè)大開 放閱讀框(0RF)，分別編碼r印和c即基因。AAV-2的全長(zhǎng)基因組已克隆至大腸桿菌質(zhì)粒中。 其中含有2個(gè)各145bps長(zhǎng)的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(Inverted terminal r印eat， ITR)。它們 是AAV基因組的復(fù)制起點(diǎn)，并與AAV復(fù)制、整合或包裝等功能有關(guān)。其基因組其余部分可分 為2個(gè)功能區(qū)，r印基因區(qū)和c即基因區(qū)。R印蛋白對(duì)于AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救和包裝 都具有重要作用。其中R印78和R印68與ITR種的末端解鏈位點(diǎn)trs (terminalresolution site)和GAGY重復(fù)基序(r印eat motif)特異性結(jié)合，啟動(dòng)AAV基因組由單鏈向雙鏈的復(fù) 制過程。ITR中trs和GAGC重復(fù)基序是AAV基因組復(fù)制的中心，因此雖然在各種血清型的 AAV病毒中ITR序列都不盡相同，但是都能構(gòu)成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和存在R印結(jié)合位點(diǎn)。在AAV2基 因組圖譜位置19處有p19啟動(dòng)子，分別表達(dá)R印52和R印40。 R印52和R印40沒有結(jié)合DNA 的功能，而有ATP依賴的DNA解旋酶活性。c即基因編碼AAV病毒的衣殼蛋白VP1、 VP2和 VP3。其中，VP3分子量最小，但數(shù)量最多，在成熟的AAV顆粒中VP1、VP2、VP3的比例大致為 1 : 1 : 20。 VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2協(xié)助VP3進(jìn)入細(xì)胞核；VP3是組成 AAV顆粒的主要蛋白。 大多數(shù)用于臨床實(shí)驗(yàn)的AAV載體是基于AAV2的，因?yàn)锳AV2是最早得到感染性克 隆的AAV，在人群中有50 96%的個(gè)體是AAV2抗體陽性的。后來，人們又從核酸水平確定 了其它幾個(gè)感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物的AAV新血清型，即AAV1、 AAV3、 AAV4、 AAV5、 AAV6，近年又從獼 猴的組織中分離了兩個(gè)新的血清型，命名為AAV7和AAV8。在這些血清型AAV中，AAV6與 AAV1有著大于99X的氨基酸水平的同源性。除此之外，所有的血清型之間在外殼蛋白尤其 是VP3的氨基酸序列上存在著較大的差異，而AAV5與其它血清型的差異更是顯著。相應(yīng) 地，AAV5在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)特性也有很大的不同，是所有血清型AAV中具有特色的一種，為基于AAV載體的基因治療提供了一種有價(jià)值的載體。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，AAV5在對(duì) 視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中表現(xiàn)尤為突出，因而，針對(duì)這些細(xì)胞的基因治療，AAV5載體可能 會(huì)比AAV2載體更加有效。 國(guó)際上多采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法獲得重組AAV2病毒，其中包括AAV載體質(zhì)粒(含 有AAV2的2個(gè)ITR)、輔助質(zhì)粒1 (含有AAV2r印cap)和輔助質(zhì)粒2 (含有腺病毒E2a、E40RF6、 VA RNA)[l]。近年來，其它血清型(AAV1、3、4、5、6、7、8)AAV病毒載體因其不同的組織細(xì)胞 嗜性和轉(zhuǎn)染效率而得到廣泛研究和應(yīng)用。它們的包裝多采用"交叉包裝"[2]，即將AAV2的 r印基因和其它血清型的AAV c即基因連接形成嵌合的r印c即基因，用以包裝含有AAV2 來源的ITR而病毒外殼是其它血清型來源的假型AAV(pseudotyped AAV)載體，一般表述為 AAV2/n (n代表外殼的血清型。如AAV2/1，表明是AAV2的ITR與AAV1的外殼)。
吳小兵等曾用"一種病毒感染一個(gè)載體細(xì)胞株"的策略高效制備AAV2載體[3-4]， 并在基因治療研究中得到廣泛應(yīng)用。隨后用同樣的策略成功地建立了 AAV2/1載體包裝系 統(tǒng)[5]。吳小兵等就一系列用于包裝1至6型AAV病毒外殼包裝的AAV2ITR載體的全功能 輔助病毒，申報(bào)了中國(guó)發(fā)明專利(專利申請(qǐng)?zhí)枮?2117965. 4)。這種包裝策略比目前國(guó)際上 常用的三質(zhì)?；螂p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞法生產(chǎn)AAV病毒的優(yōu)勢(shì)在于用"感染方式"替代了"轉(zhuǎn)染 方式"，避免了轉(zhuǎn)染方式對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)AAV載體的不利之處(需要大量提取高質(zhì)量的質(zhì)粒 DNA，以及大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。 為了包裝AAV2/5載體，我們?cè)鴺?gòu)建了 一種重組單純皰疹病毒 HSVl-r2c5-EGFP[6]，其中攜帶了包裝AAV2/5所需的雜合的r印基因(r印2/5)和AAV5cap 基因(c即5)。然而，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)無論是把r印2/5c即5插入在UL2或UL44中，獲得的 HSVl-r2c5包裝AAV2/5效率仍然極低。而用pr印2/5cap5 (攜帶了 AAV2r印和AAV5cap基 因的質(zhì)粒)、pHelper(攜帶了腺病毒的E2A， E40RF6， VA RNA基因的質(zhì)粒)、pAAV2neo(攜帶 了 AAV2兩個(gè)ITR的載體質(zhì)粒)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法獲得AAV2/5病毒的效率并不低。說明是 由于將r印2/5c即5插入HSV1基因組中造成了這種包裝效率的差異，可能是在HSV1病毒基 因組中攜帶雜合的r印2/5c鄰5與AAV2ITR仍不能很好"匹配"。其中的機(jī)理還有待進(jìn)一步 研究， 為了避免AAV5r印c即與AAV2ITR之間可能存在的"不匹配"問題，本發(fā)明建立了 一種攜帶AAV5自身r印c即基因的重組單純皰疹病毒，用于組建含有AAV5ITR的載體包裝 系統(tǒng)及大量制備AAV5/5病毒，為AAV5/5載體研究和應(yīng)用打基礎(chǔ)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了具有包裝rAAV5/5病毒的全功能輔助病毒rHSVl-r印5c即5及 其用途和使用方法。具體地發(fā)明了 HSVl-r印5c即5/ A UL23、 HSVl-r印5c即5/ A UL2、 HSVl-r印5cap5/AUL44三種重組單純皰疹病毒。rHSVl-r印5cap5/A UL23病毒的特征 在于在HSV-1基因組的UL23基因中插入了一個(gè)拷貝的r印5c即5基因(4. 3kb，方向不限 定)。HSVl-r印5c即5 A UL2病毒特征在于在HSV-1基因組的UL2基因中插入了一個(gè)拷貝的 r印5cap5基因(4. 3kb，方向不限定)。HSVl-r印5cap5/A UL44的特征在于在HSV-1基因組 的UL44基因中插入了一個(gè)拷貝的r印5c即5基因(4. 3kb，方向不限定)。
這三種重組單純皰疹病毒都具有將含有AAV5病毒2個(gè)ITR的AAV載體有效包裝 成重組AAV5/5病毒的功能。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的目的是獲得攜帶r印5c即5基因的重組單純皰疹病毒作為輔助病毒，用 于大量制備重組腺相關(guān)病毒rAAV5/5。所構(gòu)建的輔助病毒的特征是在I型人單純皰疹病毒 的基因組中插入了 r印5c即5基因。 本發(fā)明選擇HSV1UL2基因、HSV1UL44及HSV1UL23基因作為r印5c即5基因的插入 位點(diǎn)。HSV1UL2基因位于cos6所攜帶的HSV1片段中，UL2中的Xbal切點(diǎn)在整個(gè)粘粒中是 單切點(diǎn)；HSV1UL44基因位于cos56所攜帶的HSV1片段中，UL44中的Xbal切點(diǎn)在整個(gè)粘粒 中是單切點(diǎn)。除此之外，選擇了 HSV1UL2基因和HSV1UL44基因作為r印-c即基因的插入位 點(diǎn)還因?yàn)樗鼈兯幋a的蛋白(UL44基因編碼糖蛋白C，UL2基因編碼尿嘧啶DNA糖基化酶) 對(duì)于病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和增殖是非必需的。HSVlUL23基因中有一個(gè)Nsil單切點(diǎn)成為插 入r印5cap5的位點(diǎn)。 研究中我們發(fā)現(xiàn)，將r印cap基因插入U(xiǎn)L44中獲得的HSVl-rc/ A UL44病毒在細(xì)胞 中的增殖能力被減弱，主要因?yàn)椴《镜慕?jīng)培養(yǎng)液播散受阻，而細(xì)胞-細(xì)胞之間的播散不受 影響。而將r印c即基因插入HSV1UL2基因中獲得的HSVl-rc/ A UL2病毒的增殖能力則與野 生型HSV1相似。由此，我們更傾向于將r印c即片段插入由UL2基因中。除了UL2和UL44 以外，UL23成為另一個(gè)可供選擇的插入基因。UL23編碼胸苷激酶基因(TK基因)。
本發(fā)明選擇了 HSV1的UL2基因、UL23基因、UL44作為插入位置。UL2、UL23、UL44 基因分別編碼尿嘧啶DNA糖基化酶、胸苷激酶和糖蛋白C，它們對(duì)于HSV1病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中 的復(fù)制和增殖都是非必需的。 R印5cap5基因是來源于AAV5基因組的r印5cap5基因片段，長(zhǎng)度為 4023bps (NC_006152， 359-4381nt)。 本發(fā)明用于構(gòu)建重組病毒HSV-rc的原始生物材料有
l)setC粘粒，包括cos6， cosl4， cos28， cos48， cos56。 由Dr.Davision AJ惠贈(zèng)提供[7]。 setC粘粒包括名稱分別為cos6， cosl4， cos28， cos48， cos56的重組粘粒一共五個(gè)，每個(gè)粘粒都攜帶一段I型單純皰疹病毒17株 (HSV117strain)的基因組，每個(gè)粘粒中所裝載的每一 HSV-1病毒基因組片段的末端與裝載 于另一粘粒中的HSV-1片段的末端序列是有重疊的，這是5個(gè)HSV-1基因組片段在細(xì)胞中 發(fā)生同源重組的基礎(chǔ)。HSV117strain的全長(zhǎng)152261bps，在基因庫(gene bank)中的序列號(hào) 是NCJ)01806。依據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道，cos6中插入了 HSV1病毒17株(HSVlstrain17)基因組 141221至29733位(首尾相接);cosl4中插入了 HSV1病毒17株(HSVlstrain17)基因組 24599至64405位;cos28中插入了 HSV1病毒17株(HSVlstrain17)基因組54445至90477 位;cos48中插入了 HSV1病毒17株(HSVlstrain17)基因組79442至115152位;cos56中 插入了 HSV1病毒17株(HSVlstrain17)基因組107496至144681位。
2)pAV5trans質(zhì)粒[8]，為攜帶了 r印5cap5基因的質(zhì)粒。
rHSVl-r印5cap5重組病毒的制備方法 setC的5個(gè)粘粒中的每個(gè)HSV1基因組片段都是用Pacl位點(diǎn)插入的，因此用Pacl 酶切可以將其中的HSV1基因組片段完整切出；每個(gè)粘粒中的HSV1基因片段末端與另一個(gè) 粘粒中所攜帶的臨近HSV1基因組片段的末端在序列上有重疊。當(dāng)將setC的5個(gè)粘粒按 等摩爾數(shù)混合，用Pacl酶切獲得5個(gè)首尾相互在序列上有重疊的HSV1基因組片段(它們覆蓋了 HSVl基因組全長(zhǎng))，用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，或用磷酸鈣共沉淀方法共轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞，2. 5 3天后即可觀察到病毒噬斑(plaques)和CPE(細(xì)胞病理變化)現(xiàn)象，產(chǎn)生 的是HSVlstrain17病毒。setC粘粒的這種重組出感染性HSV1病毒的特性是本發(fā)明獲得 rHSVl-r印5cap5病毒的基石出。 本發(fā)明的rHSVl-r印5cap5病毒的特征是在HSVlstrain17病毒基因組中插入了 r印5cap5基因。其中插入到HSV1UL23基因中形成的重組病毒命名為rHSVl-r印5cap5/ AUL23 ;插入到HSV1UL2基因中形成的重組病毒命名為rHSVl-r印5c即5/AUL2。插入 到HSV1UL44基因中形成的重組病毒命名為rHSVl-r印5c即5/ A UL44 。在本發(fā)明中，用 rHSVl-r印5cap5代表rHSVl-r印5cap5/A UL23、 rHSVl-r印5cap5/A UL2、 HSVl-r印5cap5/ AUL44三種病毒中任意一種。 本發(fā)明所產(chǎn)生的rHSVl-r印5c即5/AUL23病毒的生產(chǎn)過程是，用PCR方法在 r印5c即5基因片段兩端加Nsil位點(diǎn)；將Nsil-r印5c即5-Nsil片段插入cos28的UL23基 因Nsil位點(diǎn)中，獲得重組粘粒cos28-r印5cap5 ;將cos28-r印5cap5與cos6， cosl4， cos48， cos56等摩爾混合，用Pacl酶切切去粘粒骨架部分后，用脂質(zhì)體方法共轉(zhuǎn)染HSV1敏感細(xì)胞 如BHK-21， 5 9天后出現(xiàn)病毒噬斑和CPE。 5個(gè)HSV-1片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組而產(chǎn)生 重組病毒rHSVl-r印5c即5/ A UL23 。 本發(fā)明所產(chǎn)生的rHSVl-r印5c即5/ A UL2病毒的生產(chǎn)過程是，用Xbal將 r印5cap5基因從pAAV5/5中切出回收，插入cos6的UL2基因Xbal位點(diǎn)中，獲得重組粘粒 cos6-r印5c即5 ;將cos6-r印5c即5與cosl4， cos28， cos48， cos56等摩爾混合，用Pacl酶 切切去粘粒骨架部分后，用脂質(zhì)體方法共轉(zhuǎn)染HSV1敏感細(xì)胞如BHK-21，5 9天后出現(xiàn)病 毒噬斑和CPE。 5個(gè)HSV-1片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組而產(chǎn)生重組病毒rHSVl-r印5cap5/ AUL2。 本發(fā)明所產(chǎn)生的rHSVl-r印5c即5/ A UL44病毒的生產(chǎn)過程是，用Xbal將 r印5cap5基因從pAAV5/5中切出回收，插入cos6的UL44基因Xbal位點(diǎn)中，獲得重組粘粒 cos6-r印5c即5 ;將cos56-r印5c即5與cosl4， cos28， cos48， cos6等摩爾混合，用Pacl酶 切切去粘粒骨架部分后，用脂質(zhì)體方法共轉(zhuǎn)染HSV1敏感細(xì)胞如BHK-21，5 9天后出現(xiàn)病 毒噬斑和CPE。 5個(gè)HSV-1片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組而產(chǎn)生重組病毒rHSVl-r印5cap5/ AUL44。rHSVl-r印5c即5病毒的功能 用rHSVl-r印5cap5病毒感染AAV載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(BHK21，293細(xì)胞或其它 對(duì)HSV1病毒敏感的細(xì)胞)，rHSVl-r印5cap5病毒能在細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)r印5cap5基因； r印5基因編碼4種蛋白(r印78， r印68， r印52， r印40)，它們能將AAV5載體質(zhì)粒上的2個(gè) ITR及其間的序列從質(zhì)粒骨架上"拯救"下來，并大量復(fù)制，產(chǎn)生單鏈的基因組DNA(ss DNA); c即5基因編碼3種c即蛋白(VP1， VP2， VP3)，它們裝配形成AAV5外殼顆粒；最后ssDNA 包裝到AAV5外殼中形成重組AAV5/5病毒。為了避免AAV病毒包裝過程中的轉(zhuǎn)染步驟，可 將pAAV5neo載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，利用質(zhì)粒骨架上的新霉素抗性基因(neo基因)的 特性，加G418 (200 800ug/ml)至細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選，獲得G418抗性細(xì)胞，AAV載體 基因組即能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中；再加入rHSVl-r印5c即5病毒來感染這種G418抗性細(xì)胞， rHSVl-r印5cap5病毒可在細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)r印5cap5基因、拯救和包裝出重組AAV載體病毒。 除了可用于包裝攜帶AAV5ITR的AAV載體之外，rHSVl-r印5cap5病毒還可以用來 包裝scAAV或稱為dsAAV病毒。 以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的用于重組腺伴隨病毒生產(chǎn)的全功能輔助病毒的制備和用
途作了詳細(xì)說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例lpAAV5neo-EGFP和pAAV5neo質(zhì)粒的構(gòu)建 先用Hindi 11酶切pSV2-neo質(zhì)粒，補(bǔ)平后自連成pSV2_neo A Hindi 11 。用PCR方法 擴(kuò)增質(zhì)粒pSV2-neo A Hindi 11中的neo基因表達(dá)盒。上游弓|物序列為5' -CTGCAAGCTTTGGGC GAAGAACTCCAGCAT-3'，下游引物序列為5' -GCCAAAGCTTACGTGACTGGGTCATGGCTG-3'，兩條引 物均在5'端引入了HindlII酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)1.8kb的產(chǎn)物，連接到T載體上，得到 重組質(zhì)粒pT-neo。從pT-neo質(zhì)粒上用Hindi 11切下來1. 8kb片段插入到質(zhì)粒pAV5CMV_GFP 質(zhì)粒的HindIII位點(diǎn)中，得到載體質(zhì)粒pAAV5neo-GFP。將EGFP基因從pAAV5neo_GFP質(zhì)粒 中切除后載體自連，得到pAAV5neo。
實(shí)施例2cos6-r印5cap5的構(gòu)建 用Xbal酶切pAV5-Trans質(zhì)粒，同收4. 3kb的片段(為r印5c即5);用Xbal酶切 cos6DNA并用堿性磷酸酶對(duì)切點(diǎn)端進(jìn)行去磷酸化；將4. 3kb的r印5c即5基因片段與酶切和 去磷處理的cos6DNA連接；轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)菌，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，挑 選出在Xbal位點(diǎn)插入了4.3kb片段的重組質(zhì)粒(不考慮插入方向，正反都可以)；用PCR方 法進(jìn)一步證實(shí)r印5c即5基因的存在；在cos6的Xbal位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)插入片段兩端進(jìn) 行測(cè)序，證實(shí)r印5cap5的插入并可判斷插入方向。
實(shí)施例3cos28-r印5cap5的構(gòu)建 先用PCR方法對(duì)pAV5-Trans質(zhì)粒的r印5cap5片段兩端加上Nsil，克隆到T載體 中，構(gòu)建成pT-r印5c即5/Nsil ;全長(zhǎng)測(cè)序證明r印5cap5序列正確。 用Nsil單酶切pT-r印5c即5/Nsil DNA，回收4. 3kb的片段(為r印5c即5);用 Nsil單酶切cos28DNA并用堿性磷酸酶對(duì)切點(diǎn)端進(jìn)行去磷酸化；將4. 3kb的r印5cap5基因 片段與酶切和去磷處理的cos28DNA連接；轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取 和酶切鑒定，挑選出在Nsil位點(diǎn)插入了 4. 3kb片段的重組質(zhì)粒(不考慮插入方向，正反都 可以)；用PCR方法進(jìn)一步證實(shí)r印5c即5基因的存在；并在cos28的Nsil位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引 物對(duì)插入片段兩端進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)r印5c即5的插入并可判斷插入方向。
實(shí)施例4cos56-r印5cap5的構(gòu)建 用Xbal酶切pAV5-Trans質(zhì)粒，回收4. 3kb的片段(為r印5c即5);用Xbal酶切 cos56DNA并用堿性磷酸酶對(duì)切點(diǎn)端進(jìn)行去磷酸化；將4. 3kb的r印5c即5基因片段與酶切 和去磷處理的cos56DNA連接；轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定， 挑選出在Xbal位點(diǎn)插入了 4.3kb片段的重組質(zhì)粒(不考慮插入方向，正反方向都可以)； 用PCR方法進(jìn)一步證實(shí)r印5c即5基因的存在；在cos56的Xbal位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)插入 片段兩端進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)r印5c即5的插入并可判斷插入方向。
實(shí)施例5rHSVl-r印5cap5/ A UL2的制備 將cos6-r印5cap5與cosl4， cos28， cos48， cos56共5個(gè)粘粒等摩爾混合，用Pacl 酶切去Cos骨架(不必分離去除骨架片段)，用酚、酚/氯仿(1 : l)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2. 5倍無水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說明書共轉(zhuǎn)染80X鋪滿的BHK-21細(xì)胞(約2X106)細(xì)胞，5個(gè)HSV-1片段將在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而產(chǎn)生rHSVl-r印5c即5/AUL2重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2% FBS的1640培養(yǎng)液37t:培養(yǎng)，1 2天換液一次。5 9天后細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，待細(xì)胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清作為原始毒種分裝保存于_70°C 。對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行3次空斑純化，可得到純一的rHSVl-r印5c即5/AUL2病毒。
實(shí)施例6rHSVl-r印5cap5/ A UL23的制備 將cos28-r印5c即5與cos6， cosl4， cos48， cos56共5個(gè)粘粒等摩爾混合，用Pacl酶切去Cos骨架(不必分離去除骨架片段)，用酚、酚/氯仿(1 : l)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2. 5倍無水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說明書共轉(zhuǎn)染80X鋪滿的BHK-21細(xì)胞(約2X106)細(xì)胞，5個(gè)HSV-1片段將在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而產(chǎn)生rHSVl-r印5cap5/AUL23重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2% FBS的1640培養(yǎng)液37t:培養(yǎng)，1 2天換液一次。5 9天后細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，待細(xì)胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清作為原始毒種分裝保存于_70°C 。對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行3次空斑純化，可得到純一的rHSVl-r印5c即5/AUL23病毒。
實(shí)施例7rHSVl-r印5cap5/ A UL44的制備 將cos56-r印5c即5與cosl4， cos28， cos48， cos6共5個(gè)粘粒等摩爾混合，用Pacl酶切去Cos骨架(不必分離去除骨架片段)，用酚、酚/氯仿(1 : l)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2. 5倍無水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說明書共轉(zhuǎn)染80X鋪滿的BHK-21細(xì)胞(約2X106)細(xì)胞，5個(gè)HSV-1片段將在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而產(chǎn)生rHSVl-r印5cap5/AUL44重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2% FBS的1640培養(yǎng)液37t:培養(yǎng)，1 2天換液一次。5 9天后細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，待細(xì)胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清作為原始毒種分裝保存于_70°C 。對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行3次空斑純化，可得到純一的rHSVl-r印5c即5/ A UL44病毒。
實(shí)施例8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒DNA的BHK21細(xì)胞建立
將pAAV2neo-EGFP質(zhì)粒DNA用lipofectamine2000按Invitrogen公司說明書操作方法轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞中，24hr后加G418800ug/ml選擇培養(yǎng)15天，獲得G418抗性細(xì)胞。即為BHK21/pAAV5neo-EGFP細(xì)胞。該細(xì)胞攜帶了 AAV5載體DNA，可以用于包裝重組AAV5/5病毒。對(duì)這些G418抗性細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，挑選出表達(dá)目的基因(綠色熒光蛋白)的細(xì)胞株分別保種。 用rHSVl-r印5c即5病毒感染各個(gè)單克隆細(xì)胞株，48hr后收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次，離心取上清，感染24孔板中新鮮的BHK21細(xì)胞，36hr后觀察綠色熒光細(xì)胞的比率和強(qiáng)度，選出比率和強(qiáng)度高的細(xì)胞株備大量制備AAV5/5載體包裝用。 實(shí)施例9用rHSVl-r印5cap5感染pAAV5neo-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備rAAV5/5-EGFP
用rHSVl-r印5cap5病毒感染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了 pAAV5neo-EGFP質(zhì)粒DNA的BHK21細(xì)胞，或穩(wěn)定攜帶了 pAAV5neo-EGFP DNA的BHK21 (BHK21/pAAV5neo-EGFP)細(xì)胞，細(xì)胞病變(36-72h)后反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞以釋放細(xì)胞中的rAAV5/5-GFP，低速離心去除細(xì)胞碎片，取上清56°C 30 60min滅活輔助病毒，其中即含有rAAV5/5-EGFP，可用于感染培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
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實(shí)施例10rAAV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞取上述rAAV5/5-EGFP病毒上清1ml分別加入培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞(80%鋪滿)中，24-48h后在熒光顯微鏡下(激發(fā)光波長(zhǎng)490nm)觀察，可見到大量的綠色細(xì)胞。表明產(chǎn)生的rAAV5/5-EGFP病毒具有感染性，并能將外源基因?qū)爰?xì)胞中表達(dá)。
相關(guān)專利文獻(xiàn) 1 、98101753. 3以粘粒為基礎(chǔ)構(gòu)建重組單純皰疹病毒及其用途 2、98120033. 8用于重組腺伴隨病毒生產(chǎn)的全功能輔助病毒的產(chǎn)生及其用途 3、99123723. 4 —種快速高效分離和純化重組腺病毒相關(guān)病毒的方法和用途 4、99119039. 4可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途 5、99119038. 6系列通用型腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建及用途 參考文獻(xiàn) 1、 Xiao X， Li J， Samulski RJ. Production of high-titer recombinantadeno_associated virusvectors in the absence of helper adenovirus.JVirol. 1998Mar ;72(3) :2224-32. 2、 Rabi麗itz JE， Rolling F， Li C， Conrath H， Xiao W， Xiao X， SamulskiRJ.Cross-packaging of a single adeno-associated virus(AAV)type 2vector genomeintomultiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.JVirol. 2002Jan ;76(2) :791-801. 3、伍志堅(jiān)吳小兵侯云德具有AAV包裝功能的重組HSV病毒的產(chǎn)生。科學(xué)通報(bào)，44(5) :506-509. 4、伍志堅(jiān)吳小兵侯云德一組可提供AAV載體復(fù)制和包裝功能的HSV1。中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志16(1) :74-78. 5、 H. Yan et al.Superior neovascularization and muscle regenerationin ischemic skeletalmuscles following VEGF gene transfer by rAAVlpseudotypedvectors Biochemical andBiophysical Research Communications 336(2005)287-298.
6、連忠輝，袁振華，吳小兵，一種包裝AAV2/5的重組單純皰疹病毒的構(gòu)建病毒學(xué)報(bào)，22(4) :267-274 7、 Conningham C， Davision A J， A cosmid-based system for constructingmutants ofherpes simplex virus type 1 [J] ，Virology, 1993，197 :116-124.
8、 Ziying Yan， Roman Zak， G. W.Gant Luxton， Teresa C. Ritchie, UrsulaBantel—Schaal， andjohn F. Engelhardt， Ubiquitination of both Adeno—AssociatedVirus Type 2and 5CapsidProteins Affects the Transduction Efficiency ofRecombinant Vectors. Journal of Virology,76(5) :2043—2053，2002.名詞及縮寫詞解釋1、AAV :adeno-associated virus,腺相關(guān)病毒。2、ITR :inverted terminal repeat,倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)。3、AAV2病毒2型AAV病毒(adeno-associated virus serotype 2)。4、AAV5病毒5型AAV病毒(adeno-associated virus serotype 5)。5、AAV2/5病毒由5型AAV病毒的外殼包裹攜帶AAV2病毒2個(gè)ITR及其間的其
9它序列組成。 6、 AAV5/5病毒由5型AAV病毒的外殼包裹攜帶AAV5病毒2個(gè)ITR及其間的其它序列組成。 7、 pAAV2neo質(zhì)粒是一種攜帶了 AAV2病毒ITR的質(zhì)粒DNA。所述的AAV載體質(zhì)粒一般由AAV2ITR、啟動(dòng)子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2ITR以及E. coli質(zhì)粒骨架組
成。質(zhì)粒骨架上攜帶了neo基因的表達(dá)單位。
8、AAV5載體質(zhì)粒 9、 pAAV5neo質(zhì)粒是指攜帶了 AAV5病毒ITR的質(zhì)粒DNA。所述的AAV5載體質(zhì)粒一般依次由AAV5ITR、啟動(dòng)子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV5ITR以及E. coli質(zhì)粒骨架等元件組成。在質(zhì)粒骨架上攜帶了neo基因表達(dá)單位。 10、 r印5c即5基因攜帶了 AAV5基因組的編碼r印和c即基因的片段，長(zhǎng)度為
4023bps(NC_006152359-4381)。 11 、 HSV1 :1型單純皰疹病毒。 12、rHSVl-r印5cap5 :在基因組中插入了 r印5cap5基因的重組HSV1病毒。插入位
置可以是HSV1UL2、UL23、UL44中的任意一個(gè)。 13、 HSV1UL2 :HSV1病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因。 14、 HSV1UL23 :HSV1病毒胸苷激酶基因。 15、HSV1UL44 :HSV1病毒糖蛋白C。 16、 cos :粘性質(zhì)粒(cosmid)。
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種攜帶了5型腺相關(guān)病毒(AAV5)的rep和cap基因(約4.3kb)的重組單純皰疹病毒(rHSV1-rep5cap5)和其在重組腺伴隨病毒rAAV5/5生產(chǎn)中的用途。本發(fā)明提出的能提供rAAV5/5復(fù)制和包裝所需的全部功能的輔助病毒rHSV1-rep5cap5，其特征在于，在HSV-1病毒的基因組中插入了來自AAV5病毒的全長(zhǎng)rep5cap5基因，插入位置是HSV1病毒體外復(fù)制和產(chǎn)毒所非必需的基因區(qū)域。
2. 依據(jù)權(quán)利要求1，本發(fā)明所述的rHSVl-r印5cap5，其特征在于r印5cap5基因插入 在HSV-1UL2基因(編碼尿嘧啶DNA糖基化酶)中，獲得的重組病毒稱為rHSVl-r印5c即5/ AUL2。
3. 依據(jù)權(quán)利要求l，本發(fā)明所述的rHSVl-r印5cap5，其特征在于r印5cap5基因插入在 HSV-1UL23基因(編碼胸甘激酶)中，獲得的重組病毒稱為rHSVl-r印5c即5/AUL23。
4. 依據(jù)權(quán)利要求l，本發(fā)明所述的rHSVl-r印5cap5，其特征在于r印5cap5基因插入在 HSV-1UL44基因(編碼糖蛋白C)中，獲得的重組病毒稱為rHSVl-r印5c即5/AUL44。
5. 依據(jù)權(quán)利要求1，本發(fā)明所述的rHSVl-r印5cap5病毒(包括rHSVl-r印5c即5/ A UL2、 rHSVl-r印5c即5/ A UL23、 rHSVl-r印5c即5/ A UL44)用于rAAV5/5病毒的生產(chǎn)。
6. 依據(jù)權(quán)利要求l，本發(fā)明所述的rHSVl-r印5c即5病毒用于生產(chǎn)rAAV5/5病毒的方法 是用rHSVl-r印5c即5病毒感染攜帶了 AAV5 ITR及其間插入序列的AAV5載體細(xì)胞，包裝產(chǎn) 生rAAV5/5病毒。
7. 依據(jù)權(quán)利要求4，所述的插入序列包括了啟動(dòng)子、目的基因、polyA加尾信號(hào)等。
8. 依據(jù)權(quán)利要求4，所述的載體細(xì)胞是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了含AAV5 ITR載體質(zhì)粒的細(xì)胞。
9. 依據(jù)權(quán)利要求4，所述的載體細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含AAV5 ITR載體質(zhì)粒的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明能夠提供腺病毒相關(guān)病毒載體AAV5/5包裝所需輔助功能的重組單純皰疹病毒HSV1-rep5cap5。其結(jié)構(gòu)特征是在1型單純皰疹病毒(HSV1)基因組中插入了rep5cap5基因片段。HSV1-rep5cap5能在細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，并可用于AAV5/5載體的大規(guī)模制備。
文檔編號(hào)C12N15/41GK101768574SQ200810188029
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者董小巖 申請(qǐng)人:北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司