專利名稱：一種病毒繁殖促進(jìn)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒繁殖的促進(jìn)劑及其應(yīng)用，屬于生物學(xué) 領(lǐng)域，特別是獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前的傳統(tǒng)禽類疫苗生產(chǎn)中，一^:程序是將所用病毒加 稀釋液稀釋后注入到雞胚中進(jìn)行繁殖，然后收獲尿嚢液進(jìn)行病毒滴度的測 定來判定病毒的增殖量是多少，病毒增殖量增多則疫苗的產(chǎn)量則可大幅增 加。因此如何提高病毒滴度節(jié)約成本增加產(chǎn)量是當(dāng)下的研究熱點(diǎn),但仍未有 有效且簡單的提高病毒滴度方法，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)中提高病毒滴度的方法有用 "兵乓效應(yīng)，，和32。C培養(yǎng)提高重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度，在工業(yè)化培養(yǎng)罐中可以 提高細(xì)胞病毒滴度等方法(KotaniH, Newton PB， Zhang SY, Chiang YL， Otto E, Weaver L， Blaese RM， Anderson WF, McGarrity GJ.Improved meth-ods of retroviral vector transduction and production for gene therapy .Hum Gene Ther, 1994;5 ( 1 ) :19-28.)。在現(xiàn)有的專利中也有一些加 倍病毒增殖的方法，如申請?zhí)枮?2814421.X的丹麥發(fā)明專利，公開的是使 一種脊推動物痘病毒增殖增加的方法，該方法用低溫的培養(yǎng)方式增加病毒 的繁殖量。如申請?zhí)枮?2139104.1的中國發(fā)明專利，公開的是一種提高昆 蟲病毒增殖效率的方法，該方法利用昆蟲病毒增效蛋白與昆蟲病毒包涵體 經(jīng)爆破獲得的病毒粒子混合感染大齡昆蟲幼蟲，使其體內(nèi)高效高水平增殖 病毒。但對于如何提高禽類病毒增殖的方法，至今未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種具有促進(jìn)禽類病毒(如新城疫病 毒、禽流感病毒等)增殖的病毒稀釋液，將其用于禽類病毒疫苗的生產(chǎn)過 程中能有效的提高疫苗制備過程中病毒抗原的產(chǎn)量。
技術(shù)方案
本發(fā)明所述的病毒繁殖促進(jìn)劑是由氫化可的松、白蛋白及幾種氨基酸 和磷酸緩沖鹽水配制而成。
本發(fā)明所述的病毒繁殖促進(jìn)劑用于禽類病毒疫苗(如新城疫疫苗、禽流感疫苗等)生產(chǎn)中作為病毒稀釋液將疫苗生產(chǎn)種子病毒稀釋后接種雞胚 體內(nèi)，促進(jìn)新城疫病毒和禽流感疫病毒的繁殖。
氫化可的松作為激素藥物具有提高細(xì)胞活性，促進(jìn)雞胚細(xì)胞分裂增殖， 抑制雞胚自身對注入的外源物質(zhì)(病毒)產(chǎn)生免疫，可使病毒繁殖加快， 提高雞胚中病毒的含量，因而可提高病毒滴度。氫化可的松應(yīng)用在了禽類 疫苗的生產(chǎn)中來增加病毒滴度，使用本發(fā)明能夠使病毒繁殖量提高兩個(gè)滴 度。不影響疫苗的免疫效果，十分易于應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)中，對胚體和病 毒不產(chǎn)生副作用，安全性高且成本低廉。
1.病毒繁殖促進(jìn)劑的配制(W/V):
氬化可的松 10 ~ 20 ml (規(guī)格為2OmL:100mg,天津藥業(yè)焦作有限公 司等公司生產(chǎn))
白蛋白 0.69~1.67g (規(guī)格為凍干粉，北京天壇生物制品股份有
限公司等生產(chǎn))
蛋氨酸 0.17 0.75g(白色薄片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，北京信諾科
美科技有限公司等提供)
賴氨酸 0.51 ~ 1.21g (白色或淺褐色粉末，安徽豐原生物化學(xué)股
份有限公司等提供)
精氨酸 0.08 0.3g(白色斜方晶系晶體或白色結(jié)晶性粉末，北京
信諾科美科技有限^^司等提供)
先后溶于pH 7.2的PBS中，并補(bǔ)足到1000ml。完全溶解后用濾器過 濾除菌備用。
3.病毒繁殖促進(jìn)劑的使用和作用
在禽類病毒疫苗研制及生產(chǎn)中，有一些疫苗病毒是利用雞胚進(jìn)行繁殖 的，也就是將經(jīng)過稀釋的種子病毒通過適合的途徑接種到合適日齡的雞胚 體內(nèi)，而本發(fā)明所制備的病毒繁殖促進(jìn)劑在本發(fā)明中是作為病毒稀釋液， 將種子病毒稀釋后接種雞胚內(nèi)促進(jìn)病毒繁殖以生產(chǎn)禽類疫苗。
使用本發(fā)明的病毒繁殖促進(jìn)劑，其中的PBS起到緩沖pH的作用，保 持一定的離子濃度，以維持病毒的活性，因?yàn)樵陔x子濃度過高或過低的情況下，蛋白質(zhì)都會變性，病毒當(dāng)然不例外；白蛋白是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，
可分解產(chǎn)生的氨基酸，供雞胚生長所需，提高雞胚生長率，有利于其中病
毒的繁殖；氫化可的松作為激素藥物可提高細(xì)胞活性，促進(jìn)雞胚細(xì)胞分裂 增殖，抑制雞胚自身對注入的外源物質(zhì)(病毒)產(chǎn)生免疫，從而可使病毒 繁殖加快，提高雞胚的病毒含量，因而可提高病毒1 2個(gè)滴度。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該病毒繁殖促進(jìn)劑是由氫化可的松、白蛋白、氨 基酸和磷酸緩沖鹽水配制而成。在用雞胚繁殖禽類病毒使用本發(fā)明所涉及 的病毒繁殖促進(jìn)劑能夠使病毒滴度提高1 ~ 2個(gè)對數(shù)級，對胚體和病毒不產(chǎn) 生副作用，且不影響疫苗的免疫效果，應(yīng)用在工業(yè)化疫苗的生產(chǎn)中，有效 增加病毒產(chǎn)量。
通過以下實(shí)施例對發(fā)明做進(jìn)一 步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1——病毒繁殖促進(jìn)劑的配制 氫化可的*>15 ml (規(guī)格為20mL: 100mg) 1. 0g 0. 50g 0. 90g 0.20g
以上成分先后溶于pH 7,2的PBS中，并補(bǔ)足到1000ml。完全溶解后 用濾器過濾除菌備用。
實(shí)施例2——病毒繁殖促進(jìn)劑的配制 氫化可的+〉 20 ml (規(guī)j各為20mL: 100mg) 白蛋白 0. 69g
蛋氨酸 Q. 75g
賴氨酸 1. 21g
精氨酸 0.10g
將以上各成分先后溶于pH 7.2的PBS中，并補(bǔ)足到1000ml。完全溶 解后用濾器過濾除菌備用。
白蛋白 蛋氨酸 賴氨酸 精氨酸實(shí)施例3—
氬化可的衫 白蛋白
病毒繁殖促進(jìn)劑的配制
10ml (規(guī)格為2OmL:100mg) 1.67g
蛋氨酸 0.17 賴氨酸 0.51g 精氨酸 0.3g
將以上各成分先后溶于pH 7.2的PBS中，并補(bǔ)足到1000ml。完全溶解 后用濾器過濾除菌備用。
實(shí)施例4——病毒繁殖促進(jìn)劑對新城疫病毒的作用
1. 取已配置好并用濾器過濾除菌的病毒繁殖促進(jìn)劑作為接毒時(shí)的病毒稀 釋液。
2. 新城疫病毒液的稀釋在超凈臺中將用來接種的新城疫病毒原液用以 上配好的病毒繁殖促進(jìn)劑進(jìn)行1:1000 (V/V)稀釋作為試驗(yàn)組。對照組只用生 理鹽水將新城疫病毒原液也進(jìn)行1:1000 (V/V)稀釋。
3. 雞胚的準(zhǔn)備繁殖病毒所用的雞胚均由購買的無特異性病原(SPF) 種蛋自行孵化，在孵化器中孵育9~10天后，用作接毒。
4. 接毒挑選健康雞胚尿嚢腔內(nèi)接種稀釋好的病毒液0.2ml/枚，實(shí)驗(yàn)組 和對照組各接毒220枚胚。繼續(xù)放孵化器內(nèi)進(jìn)行孵化。
5. 收毒并測定HA效價(jià)在接毒3天后，收獲實(shí)驗(yàn)組和對照組的尿嚢液 進(jìn)行HA效價(jià)的測定，測定結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組HA效價(jià)平均為287,對照組的HA 效價(jià)平均為264。
通過對以上試驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論本項(xiàng)研究成果提高病毒繁殖量的增效劑 能明顯提高新城疫病毒的效價(jià)，該增效劑作為病毒的稀釋液比常規(guī)的生理鹽 水稀釋液提高病毒約2.0 ~ 2.3個(gè)滴度，效果顯著。
實(shí)施例5_病毒繁殖促進(jìn)劑對禽流感病毒的作用
1. 1.取已配置好并用濾器過濾除菌的病毒繁殖促進(jìn)劑作為接毒時(shí)的病毒 稀釋液。
2. 禽流感病毒液的稀釋在超凈臺中將用來接種的禽流感病毒原液用。
權(quán)利要求
1. 一種病毒繁殖促進(jìn)劑，其特征在于是由氫化可的松、白蛋白及氨基酸和磷酸緩沖鹽水配制而成。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種病毒繁殖促進(jìn)劑，其特征在于其中的氨基 酸是蛋氨酸、賴氨酸和精氨酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種病毒繁殖促進(jìn)劑，其特征在于其配方是 20ml:100mg的氫化可的+〉 10~20ml、白蛋白0.69~1.67g、蛋氨酸 0.17~0.75g、賴氨酸 0.51~1.21g、精氨酸 0.08 ~ 0.3g和pH 7.2磷酸緩 沖鹽水補(bǔ)足到1000ml 。
4. 一種病毒繁殖促進(jìn)劑的應(yīng)用，其特征在于本發(fā)明所述的禽類病毒繁 殖促進(jìn)劑用于禽類病毒疫苗生產(chǎn)中作為病毒稀釋液將種子病毒稀釋后接種 雞胚體內(nèi)。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種病毒繁殖促進(jìn)劑的應(yīng)用，其特征在于是該 促進(jìn)劑用于新城疫疫苗生產(chǎn)中，促進(jìn)新城疫病毒的繁殖。
6. 如權(quán)利要求4所述的一種病毒繁殖促進(jìn)劑的應(yīng)用，其特征在于是該 促進(jìn)劑用于禽流感疫苗生產(chǎn)中，促進(jìn)禽流感疫病毒的繁殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種病毒繁殖促進(jìn)劑及其應(yīng)用。該病毒繁殖促進(jìn)劑是由氫化可的松、白蛋白、氨基酸和磷酸緩沖鹽水配制而成。在用雞胚繁殖禽類病毒使用本發(fā)明所涉及的病毒繁殖促進(jìn)劑能夠使病毒滴度提高1～2個(gè)對數(shù)級，對胚體和病毒不產(chǎn)生副作用，且不影響疫苗的免疫效果，應(yīng)用在工業(yè)化疫苗的生產(chǎn)中，以增加病毒產(chǎn)量。
文檔編號C12N7/00GK101463345SQ200810187558
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者李明義, 瀟 胡 申請人:青島易邦生物工程有限公司