專(zhuān)利名稱(chēng)：：羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物飼料添加劑及其制備方法，尤其涉及一種含有由羅伊氏乳酸桿菌組成的直接飼喂的活菌凍干制劑及其制備方法。技術(shù)背景近年來(lái)養(yǎng)殖業(yè)中存在的問(wèn)題是長(zhǎng)期使用抗生素，結(jié)果往往會(huì)破壞動(dòng)物腸道的正常菌群以及藥物殘留等，這對(duì)人類(lèi)構(gòu)成潛在的威脅，這些問(wèn)題也已經(jīng)危及到人類(lèi)的安全、食物的安全和農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。而以乳酸菌為代表的微生物制劑卻能起到與抗生素恰恰相反的作用，它能夠扶持動(dòng)物腸道內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而抑制有害菌的生長(zhǎng)，最終達(dá)到維持腸道微生態(tài)平衡的作用。乳酸桿菌在自然界中分布廣泛，在動(dòng)物消化道中為主要優(yōu)勢(shì)菌群，如在豬腸道正常菌群中乳酸桿菌有嗜酸乳酸桿菌(""O&C/WMSciokp力i^^)、羅伊氏乳酸桿菌aacfo6aw7JtAsre〃teri)、短乳酸桿菌aa"o6s7/"s、纖維二糖乳酸桿菌(Ls"oZs".^sce^oZ^'o馬)、發(fā)酵乳酸桿菌(Z^"oZ3C辺i/s/"ei7Z7e/論)、唾液乳酸桿菌"a"o&ciW"s幼JiWridAs)。而雞腸道中正菌群的乳酸桿菌則有嗜酸乳酸桿菌(Ja"o&3ciW"sacif/o//w7iAS)、羅伊氏乳酸桿菌UactoZacj77〃sre〃teri)、唾液乳酸桿菌aa"0力3Ci77"S5"3^>/r/〃50，乳酸桿菌亞種"3CZ^力3C/i7"5"5j0p.)、巻曲乳酸桿菌(Z^czafecj7Ji/51crj'5patos)、德氏乳酸桿菌Uacto&aciJJt/soteZ6r〃ech.力，格氏學(xué)L酸桿菌(Zscto/sc_z7_ZiAS卵sser力等。羅伊氏乳酸桿菌Ua"oteciWusre"eri)是普遍存在于人和動(dòng)物腸道的有益乳酸桿菌，它屬于專(zhuān)性異型乳酸發(fā)酵菌，已有研究表明羅伊氏乳酸桿菌可定植于動(dòng)物腸道內(nèi)，代謝可產(chǎn)生乳酸、乙酸等物質(zhì)，有抑制腸道有害菌生長(zhǎng)和繁殖的作用。該菌株已經(jīng)被(FDA)和(AAFC0)列入安全的飼料級(jí)微生物菌種名單之中，我國(guó)衛(wèi)生部公告2003年第3號(hào)公布羅伊氏乳酸桿菌可作為人類(lèi)保健食品的微生物菌種，但是在2006年公布的5種可以添加到飼料中的乳酸桿菌菌種中并沒(méi)有羅伊氏乳酸桿菌。既然羅伊氏乳酸桿菌可作為人類(lèi)的保健食品，申請(qǐng)人認(rèn)為同樣應(yīng)該可以作為詞料添加劑供動(dòng)物食用，以克服抗生素帶來(lái)的危害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域的不足，提供一種羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑，可以直接飼喂動(dòng)物。羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中的保護(hù)劑的重量百分比為脫脂乳12%、蔗糖1%、乳糖4%、甘油1%、淀粉2%，其余為水。所述羅伊氏乳酸桿菌活菌數(shù)》l(Tcfu/g。所述羅伊氏乳酸桿菌來(lái)源于北京油雞盲腸黏膜。上述凍干制劑的制備方法，將羅伊氏乳酸桿菌液體發(fā)酵擴(kuò)繁，將發(fā)酵液離心取菌泥，將菌泥加入到有保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液中，凍干即可，所述磯酸鹽緩沖液的pH為6.56.7.所述發(fā)酵工藝中所用的培養(yǎng)基為改良的MRS液體培養(yǎng)基；接種量為10%;發(fā)酵溫度為37。C;pH為6.46.5;消泡劑為PDA+有機(jī)硅；轉(zhuǎn)速為lOOrpm;發(fā)酵時(shí)間為24h，所述改良的MRS液體培養(yǎng)基的碳源以菊粉替代部分葡萄糖，它們占液體培養(yǎng)基的重量比分別為菊粉3%，葡萄糖1.7%，所述菊粉中單糖重量百分比為10%。上述凍干制劑在動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。所述動(dòng)物為家禽或家畜。所述家禽為雞。本發(fā)明從北京油雞盲腸黏膜上分離得到一株乳酸桿菌，經(jīng)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定為羅伊氏乳酸桿菌，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)證明了該菌株具有較強(qiáng)的抗k88型大腸桿菌能力，其對(duì)大小鼠的急性毒性試驗(yàn)證明了大、小鼠LD5。^5000mg/kg。采用50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，其發(fā)酵工藝參數(shù)為培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基；接種量10%;發(fā)酵溫度37°C;pH:6.46.5:消泡劑PDA+有機(jī)硅轉(zhuǎn)速100rpm;發(fā)酵時(shí)間24h。發(fā)酵結(jié)束后，離心取菌泥，將菌泥加入到含有保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液中，保護(hù)劑成分為脫脂乳12%、蔗糖1%、乳糖4%、甘油1%、淀粉2%，將保護(hù)劑乳化，然后凍干。并將該菌株的凍干制劑添加到AA肉仔雞飼料中，進(jìn)行42d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，通過(guò)肉仔雞生產(chǎn)性能、盲腸微生物和小腸絨毛結(jié)構(gòu)證明了該菌株在動(dòng)物生產(chǎn)中的實(shí)用性。圖l添加菊粉后羅伊氏乳酸桿菌生長(zhǎng)OD咖，值圖2添加菊粉后羅伊氏乳酸桿菌pH值圖350L發(fā)酵罐不同時(shí)間對(duì)羅伊氏乳酸桿菌生長(zhǎng)0D亂m值和pH值的影響圖4不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳酸桿菌存活率的影響圖5凍干制劑對(duì)肉仔雞日增重的影響圖6凍干制劑對(duì)肉仔雞盲腸黏膜和糞中乳酸菌與大腸桿菌的影響圖7小腸絨毛結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果其中A為對(duì)照組，B為抗生素組，C為凍干制劑組具體實(shí)施方法，實(shí)施例l羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑l-l乳酸桿菌的分離鑒定將活雞剖殺，無(wú)菌操作刮取盲腸黏膜lg，置于盛有9ml無(wú)菌生理鹽水的帶有玻璃珠的三角瓶中，充分震蕩搖勻，然后吸取0.5ml菌液于盛有4.5ml無(wú)菌生理鹽水的試管中，此稀釋度為10—1，重復(fù)以上過(guò)程,依次制成1(T、10"、10—4、10—5、10"的菌液。選擇10—4、10—5、10—6三個(gè)稀釋度，吸取0.lml菌液分別滴于MRS培養(yǎng)基平板上，采用燭缸法37t:培養(yǎng)2448h，挑取形態(tài)不同的菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種做純培養(yǎng)，而后置于4X:冰箱保存?zhèn)溆?。然后挑取純培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢；選取無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性桿菌進(jìn)行接觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化等生化實(shí)驗(yàn)，以及糖醇發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《乳酸細(xì)菌分類(lèi)及實(shí)驗(yàn)方法》對(duì)照，確定菌種。然后送至中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心進(jìn)行鑒定檢驗(yàn)。中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心對(duì)該乳酸桿菌為羅伊氏乳酸桿菌(Zac&fec/Wi/sre^e/y.)的鑒定結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中"+"表示》90%菌株陽(yáng)性，"一"表示》90%菌株陰性，"ND，'表示未測(cè)定。l-2羅伊氏乳酸桿菌的抑菌性能測(cè)定將羅伊氏乳酸桿菌和大腸桿菌分別在各自適宜的培養(yǎng)基內(nèi)繁殖，傳1代。取20h培養(yǎng)物，調(diào)整菌的濃度為107CfU/ml。(l)取MRS液體培養(yǎng)基4ml的試管4支，分別接種乳酸桿菌0.lml，同時(shí)接種大腸桿菌O.lml，置恒溫培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)。取培養(yǎng)物24、48、72、96、120h的培養(yǎng)液倒麥康凱瓊脂平板，檢查大腸桿菌存活情況，記錄活菌數(shù)。(2)取MRS液體培養(yǎng)基4ml的試管4支，分別接種乳酸桿菌0.lml，培養(yǎng)24h后，接種大腸桿菌O.lml，置恒溫培養(yǎng)箱37'C再培養(yǎng)。取大腸桿菌單獨(dú)管作為對(duì)照，取培養(yǎng)物24、48、72、96、120h的培養(yǎng)液倒麥康凱瓊脂平板，檢査大腸桿菌拮抗情況，記錄活菌數(shù)。(3)取MRS液體培養(yǎng)基4ml的試管4支，接種大腸桿菌0.lml，培養(yǎng)24h后，接種乳酸桿菌O.lml，置恒溫培養(yǎng)箱37"再培養(yǎng)。取培養(yǎng)物24、48、72、96、120h的培養(yǎng)液倒麥康凱瓊脂平板，檢查大腸桿菌拮抗情況，記錄活菌數(shù)。該菌株的抑菌性能測(cè)定結(jié)果為在羅伊氏乳酸桿菌與大腸桿菌共同培養(yǎng)和先接種羅伊氏乳酸桿菌24h后接種大腸桿菌的情況下，大腸桿菌活菌數(shù)很低；在大腸桿菌接種24h后接種羅伊氏乳酸桿菌，72h后大腸桿菌全部失活。13羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備1-3-1羅伊氏乳酸桿菌50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)l-3-i-1.羅伊氏乳酸桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化1-3-1-1-1材料菊粉單糖比例為10%。1-3-1-1-2方法改變?cè)信囵B(yǎng)基(MRS)的碳源成分，以菊粉替代部分葡萄糖，使培養(yǎng)基碳源占2%，菊粉中單糖含量為10%。共分為4組1組菊粉1%，葡萄糖1.9%;11組菊粉2%，葡萄糖1.8%;111組菊粉3%，葡萄糖1.7%;IV組菊粉4M，葡萄糖1.6%。采用封口靜置培養(yǎng)條件，測(cè)定菌株生長(zhǎng)OD,Jl和pH值。見(jiàn)表l、圖l、圖2。表l添加菊粉后羅伊氏乳酸桿菌生長(zhǎng)OD咖皿值和pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>162024283236404448522.219±0.1702.481±0.0762.673±0.0932.712±0.0432.711±0.0482.657±0.0542.604±0.0942.604±0.0822.589±0.0602.542±0.1144.3(3±0.084.15±0.093.88±0.123.74±0.103.51±0.043.50±0.053.51±0.163.42±0.043.44土0.083.45±0.101.804±0.2392.300±0.0992.454±0.0862.544±0.0132.500±0.0972.518±0.0602.532±0.0792.442±0.0832.457±0.0232.440±0.1904.64±0.084.35±0.124.19±0.143.87±0.173.68±0.123.65±0.183.60±0.093.71±0.083.64±0.203.62±0.022.402±0.1622.790±0.0832.925±0.0572.937±0.0522.935±0.0662.897±0.0992.900±0,0482.885±0.1052.860±0.1782.871±0.1504.20±0.024.13±0.103.60±0.103.52±0.133.38±0.123.41±0.103.37±0.103.43±0.113.37±0.083.40±0.032.050±0.0922.525±0.0642.761±0.1752.802±0.1462.825±0.1042.739±0.0932.767±0.1032.670±0.1652.581±0.0692.517±0.2184.90±0.124.56±0.244,07±0.043.65士0.073.57±0.083.43±0.013.55±0.093.45±0.093.44±0.083.37±0.02注表中數(shù)據(jù)為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如下在培養(yǎng)基中添加菊粉后，能不同程度的增加菌液的ODei值，其中效果最好的為3%菊粉添加量。1-3-1-2發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)1-3-1-2-1.材料上述改良的MRS液體培養(yǎng)基。1-3-1-2-2方法本試驗(yàn)根據(jù)所用菌種最適溫度為37'C，因此控制發(fā)酵罐溫度為37。C，發(fā)酵培養(yǎng)基采用改良的MRS培養(yǎng)基，接種量為10%，裝液量為50%，轉(zhuǎn)速為100r/min，消泡劑為PDA0.10%+有機(jī)硅0.02%，最初pH6.46.5，自始至終維持罐壓在0.08MPa。分別在發(fā)酵的第7，11,15，19，21，23，25，27,29,31h取適量菌液測(cè)定其OD,值和pH值，記錄羅伊氏乳酸桿菌生長(zhǎng)情況。見(jiàn)表2、圖3。表250L發(fā)酵罐不同時(shí)間對(duì)羅伊氏乳酸桿菌生長(zhǎng)ODeo^值和PH值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明在發(fā)酵的20h后，羅伊氏乳酸桿菌開(kāi)始平穩(wěn)生長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期，在23h時(shí)OD,^值達(dá)到最高值，為2.502，本發(fā)明在其OD,，值達(dá)到最高之后收取發(fā)酵液，因此確定24h為發(fā)酵結(jié)束時(shí)間。1-3-2乳酸桿凍干制劑的工藝研究1-3-2-1凍干保護(hù)劑的優(yōu)選乳酸菌在凍干過(guò)程中不可避免地會(huì)造成部分細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化，這對(duì)生產(chǎn)非常不利。若在凍干前加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑則可以減輕或防止冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損害，使得乳酸菌盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性。然而，乳酸菌具有種屬特異性，即使在相同的外部條件下，同種菌的不同菌株在凍干過(guò)程中也可能表現(xiàn)出不同的特性。因此，根據(jù)菌種的特性選擇適宜的保護(hù)劑在凍干過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。1-3-2-1-1材料脫脂乳、蔗糖、甘油、乳糖等作為凍干保護(hù)劑。l-3-2-1-2凍干制劑的制備方法羅伊氏乳酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)20h后，收取發(fā)酵液6000rpm離心10min取菌泥，加入不同組合的保護(hù)劑，制成與離心前發(fā)酵液濃度相同的菌懸液。將菌懸液倒入凍干機(jī)的物料干燥盤(pán)中，置于超低溫冰箱中急速冷凍，以保證形成小的冰晶和凍結(jié)完全，預(yù)凍同時(shí)打丌冷凍干燥機(jī)，當(dāng)機(jī)器達(dá)到第二級(jí)制冷時(shí)，將物料干燥盤(pán)放入凍干機(jī)中，抽真空開(kāi)始進(jìn)行凍干。確定最佳保護(hù)劑。見(jiàn)表3、圖4。表3不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳酸桿菌存活率的影響存活率組別保護(hù)劑配方(%)I~~—10%脫脂奶粉+1%甘油95.98210%脫脂奶粉+1%蔗糖+1%甘油82.57318%脫脂奶粉46.13418%脫脂奶粉+1%蔗糖+1%甘油+2%淀粉96.64518%脫脂奶粉+2°/。淀粉；70.74618%脫脂奶粉+1%蔗糖+2%淀粉70.90712%脫脂奶粉+1%蔗糖+1%甘油+4%乳糖+2%淀粉97.26818%脫脂奶粉+10%乳糖67.82918%脫脂奶粉+10%乳糖+0.3%酵母浸粉44.791018%脫脂奶粉+10%乳糖+5%蛋白胨48.811118%脫脂奶粉+3%麥芽糖+2%葡萄糖74.221218%脫脂奶粉+1%蔗糖+1%甘油+3%膨化玉米72.391312%脫脂奶粉+1%海藻酸鈉93.581412%脫脂奶粉+0.5%海藻酸鈉56.061512%脫脂奶粉+0.5%海藻酸鈉+3%乳糖67.1612%脫脂奶粉+1%海藻酸鈉+5%乳糖90.92計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為葡萄糖17.0g，菊粉30.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，三水合乙酸鈉5.0g,擰檬酸二氨2.0g，吐溫(Tween)801.OmL，K2〖1P042.Og，MgS047H200.58g，MnSO,H200.19g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH為6.5，12rC滅菌15min。結(jié)果表明當(dāng)保護(hù)劑組合為12%脫脂奶粉、1%蔗糖、4%乳糖、1%甘油、2%淀粉時(shí)，羅伊氏乳酸桿菌的存活率達(dá)到97.26%,因此，確定此為最佳凍干保護(hù)劑。卜3-2-2羅伊氏乳酸桿菌凍千制劑的制備羅伊氏乳酸桿菌采用50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐工作參數(shù)分別為發(fā)酵罐溫度為37°C,培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基，接種量10%，裝液量為50%，轉(zhuǎn)速為100r/min，消泡劑為PDA0.10%+有機(jī)硅0.02%，最初pH6.46.5，自始至終維持罐壓在0.08MPa。發(fā)酵培養(yǎng)20h后，收取發(fā)酵液6000rpm離心10min取菌泥，將菌泥加入到含有保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液中(pH=6.6),保護(hù)劑的組成為12%脫脂乳、1%蔗糖、4%乳糖、1%甘油、2%淀粉，制成與離心前發(fā)酵液濃度相同的菌懸液。將菌懸液倒入凍干機(jī)的物料干燥盤(pán)中，置于超低溫冰箱中急速冷凍，以保證形成小的冰晶和凍結(jié)完全，預(yù)凍同時(shí)打開(kāi)冷凍干燥機(jī)，當(dāng)機(jī)器達(dá)到第二級(jí)制冷時(shí)，將物料干燥盤(pán)放入凍干機(jī)中，抽真空開(kāi)始進(jìn)行凍干。凍干后即得羅伊氏乳酸桿菌凍干產(chǎn)品，測(cè)定后活菌數(shù)為5.2Xl0'。cfu/g。1-3-3羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的安全性能測(cè)定將羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑送至國(guó)家指定檢測(cè)中心進(jìn)行了大、小鼠急性毒性L(fǎng)Ds。實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了大、小鼠LD5。均大于5000mg/kg，證明了該羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑屬安全性飼料添加劑。實(shí)施例2羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑在肉仔雞生產(chǎn)中的應(yīng)用效果l.將凍干制劑按不同添加比例關(guān)系添加到AA肉仔雞伺料中，試驗(yàn)分為空白組、抗生素組和0.3%凍干制劑組，分別在21日齡末和42日齡末測(cè)定肉仔雞平均日增重。在21日齡末和42曰齡末，與空白組和抗生素組相比，添加羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑組能夠提高肉仔雞平均日增重。表4、圖5。表4添加制劑組對(duì)肉仔雞曰增重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果顯示與空白組和抗生組相比，試驗(yàn)組添加羅伊氏凍干制劑能提高肉仔雞日增重，但差異不顯著(p>0.05)。2.飼養(yǎng)42d結(jié)束后分別從空白組、抗生素組和添加凍干制劑組隨機(jī)抽取2只雞進(jìn)行屠宰，頸靜脈采血后，放血處死濕法拔毛。取兩側(cè)盲腸，用細(xì)線(xiàn)扎口，屠宰試驗(yàn)結(jié)束后立即于超凈工作臺(tái)中刮取盲腸黏膜和糞便各lg，加入無(wú)菌生理鹽水99ml，加入玻璃珠震蕩搖勻，此為10—2,依次進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥?0—:'、10—4、10—5、10—fi、10—7的菌懸液。分別選擇10—5、10,10—7三個(gè)稀釋度吸取0.涂布接種于MRS培養(yǎng)基平皿上(各稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù))，燭缸法37。C培養(yǎng)24小時(shí)后，選取乳白色，稍偏黃，表面光滑，凸起，邊緣整齊不透明，質(zhì)地軟，直徑0.62.7mm的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并進(jìn)一步作生化鑒定同時(shí)選擇l(T5、10—6、10—7三個(gè)稀釋度吸取0.lml涂布接種于普通肉湯培養(yǎng)基平皿上(各稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù))，置37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，選取灰色，表面光滑、濕潤(rùn)、凸起，邊緣整齊不透明，質(zhì)地軟、粘、直徑1.03.Omm的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并進(jìn)一步作生化鑒定。表5日糧中添加凍干制劑對(duì)肉雞盲腸黏膜和糞中乳酸菌與大腸桿菌的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注a.同列肩標(biāo)無(wú)相同大寫(xiě)字母者差異極顯著(P<0.01)，同列肩標(biāo)無(wú)相同小寫(xiě)字母者差異顯著(P<0.05),同列不標(biāo)任何字母表示差異不顯著(P〉0.05);b.表中數(shù)據(jù)為每克盲腸黏液或糞中乳酸菌與大腸桿菌含量的對(duì)數(shù)值。結(jié)果表明，日糧中添加羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑能使盲腸黏膜上乳酸菌數(shù)量顯著增加(p<0.05)。表5、圖6。3.取抗生素組和添加凍干制劑組肉仔雞的十二指腸1咖3左右，用緩沖液沖洗千凈后，放置2.5%戊二醛溶液中，送至中國(guó)農(nóng)大電鏡實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理觀察。通過(guò)電鏡觀察，抗生素小腸絨毛顯得比較凌亂，而添加凍干制劑組的小腸絨毛比較整齊。見(jiàn)圖7。權(quán)利要求1.羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中的保護(hù)劑的重量百分比為脫脂乳12％、蔗糖1％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，其余為水。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑，所述羅伊氏乳酸桿菌活菌數(shù)》10'°cfu/g。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑，所述羅伊氏乳酸桿菌來(lái)源于北京油雞盲腸黏膜。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備方法，將羅伊氏乳酸桿菌液體發(fā)酵擴(kuò)繁，將發(fā)酵液6000rpm離心10min取菌泥，將菌泥加入到有保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液中，凍干即可，所述磷酸鹽緩沖液的pH為6.56.7。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述發(fā)酵工藝參數(shù)為培養(yǎng)基為改良的MRS液體培養(yǎng)基；接種量為10%;發(fā)酵溫度為37。C;pH為6.46.5;消泡劑為PDA+有機(jī)硅；轉(zhuǎn)速為100rpm;發(fā)酵時(shí)間為24h,所述改良的MRS液體培養(yǎng)基的碳源以菊粉替代部分葡萄糖，它們占液體培養(yǎng)基的重量比分別為菊粉3%，葡萄糖1.7%，所述菊粉中單糖含量百分比為10%。6、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑在動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述動(dòng)物為家禽或家畜。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述家禽為雞。全文摘要本發(fā)明涉及“羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑及其制備方法”，屬微生物飼料制劑添加劑。羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中的保護(hù)劑的重量百分比為蔗糖1％、脫脂乳12％、乳糖4％、甘油1％、淀粉2％，其余為水。本發(fā)明涉及的羅伊氏乳酸桿菌分離于北京油雞盲腸黏膜，經(jīng)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)鑒定為羅伊氏乳酸桿菌，本發(fā)明先將該菌株進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大，然后進(jìn)行冷凍干燥，其冷凍干燥制劑的活菌數(shù)達(dá)到10¹⁰cfu/g，可以直接飼喂動(dòng)物，最后通過(guò)動(dòng)物安全性實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明了該菌株具有較高的安全性和功能性。文檔編號(hào)C12N1/20GK101273757SQ20081010305公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者單達(dá)聰,季海峰,張董燕,王四新,王雅民,黃建國(guó)申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院