專利名稱：：一株丙酮丁醇梭菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株丙酮丁醇梭菌及其應(yīng)用。技術(shù)背景丁醇(Butanol)是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛垸值與汽油相當(dāng)；含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會(huì)腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。丁醇可由發(fā)酵和石油化工合成法生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇(又稱ABE發(fā)酵)曾經(jīng)是僅次于乙醇的全球第二大發(fā)酵工業(yè)?；瘜W(xué)合成法有兩種，以丙烯為原料的羰基合成法，以乙醛為原料的聚合法。20世紀(jì)50年代以后，由于石化合成技術(shù)的成熟導(dǎo)致發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇不再具有經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)，丁醇發(fā)酵逐漸淡出市場(chǎng)。70年代后，隨著石油危機(jī)的出現(xiàn)及國際原油價(jià)格的不斷上漲，世界各國對(duì)能源安全和資源安全的憂慮日增，人們又重新開始關(guān)注丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)。并在隨后的研究過程中積累了大量的相關(guān)資料，詳盡闡明了丙酮丁醇梭菌的代謝途徑，進(jìn)行了丙酮丁醇梭菌的分子生物學(xué)研究，并且開發(fā)了用于丙酮丁醇梭菌的遺傳操作系統(tǒng)，改造了丁醇的生產(chǎn)工藝和回收工藝等，取得了很大的研究進(jìn)展。但仍有以下困擾丁醇生產(chǎn)的難題存在:第一，底物費(fèi)用高昂，發(fā)酵用的基質(zhì)占丁醇生產(chǎn)成本的70%左右；第二，產(chǎn)物濃度低，由于丁醇的毒性，導(dǎo)致發(fā)酵過程中產(chǎn)物濃度很低，總?cè)軇┎坏?%;第三，產(chǎn)物回收費(fèi)用高，由于產(chǎn)物濃度太低，故回收需要大量耗能。傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇是以玉米或糖蜜為基質(zhì)，接入丙酮丁醇菌種進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮，丁醇和乙醇，且比例為3:6:1，丁醇所占溶劑的比例約為60%，丁醇占總?cè)軇┑谋壤桓?。因此提高丁醇在溶劑中的比例具有重要的意義，但現(xiàn)有技術(shù)偏重于發(fā)酵工藝的改進(jìn)，如吸附法固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇的方法(CN87103534A)，該方法將處于對(duì)數(shù)期的丙酮丁醇梭菌吸附固定，然后用固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇溶劑。該項(xiàng)發(fā)明采用傳統(tǒng)的菌種，丁醇在產(chǎn)物中的比例僅為60%左右，不能達(dá)到本發(fā)明菌株在發(fā)酵中達(dá)到的高丁醇的比例。專利高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用(CN95111733.5)，雖然該專利通過多輪化學(xué)誘變，得到了一株丁醇比例較高的菌株，其不足之處在于菌株經(jīng)過多輪誘變之后，其生長特性受到影響，菌株穩(wěn)定性下降，如該菌株不能用傳統(tǒng)的保藏和復(fù)壯方法。另外應(yīng)用化學(xué)誘變劑獲得的菌株可能出現(xiàn)回復(fù)突變，且回復(fù)突變的幾率可高達(dá)l(T2。因此上述方法不能從根本上解決上述問題，因此亟待獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)和高比例丁醇的菌株。本發(fā)明提供了一株野生型的丙酮丁醇梭菌，其突出的優(yōu)勢(shì)在于該菌株與傳統(tǒng)的野生型菌株不同，具有較高的丁醇比例。該菌株發(fā)酵產(chǎn)生丁醇在溶劑中的比例能夠達(dá)到75%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的60%，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株丙酮丁醇梭菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌(C/o^W誦flc柳6^y"c調(diào))SB-1CGMCCW,2287。所述丙酮丁醇梭菌(C/o欲Wwmfl"to^(y/z'cww)SB-1CGMCCWs.2287具有在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丁醇占總?cè)軇┑闹亓勘冗_(dá)68-75%的特性。所述丙酮丁醇梭菌(C/o拚Wwmflceto^(y//cMm)SB-1CGMCC來源于云南騰沖溫泉附近植物根際土壤。電鏡照片顯示(見圖1)，丙酮丁醇梭菌(C/o^^Z/t^flce/oZm/y//cwm)SB-1CGMCCWs.2287營養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)呈兩端圓形短桿狀，單一或雙聯(lián)，有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞有2.6-4.7X0.5~0.7微米，革蘭氏染色呈陽性。所述丙酮丁醇梭菌(C/oWn'Wwmaceto6^y"cwm)SB-1CGMCCJ^.2287，已于2007年12月11日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為.*中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCW.2287。本發(fā)明的丙酮丁醇梭菌(C7oWWWwwaceto6wzy//cwm)SB-1CGMCCWs.2287可用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，具體方法可為所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法是將所述丙酮丁醇梭菌(C/asfrWwwflceto6"0^cwm)SB-1CGMCC接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35-39°C，靜止發(fā)酵得到丁醇溶液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為含淀粉的培養(yǎng)液；所述含淀粉的培養(yǎng)液優(yōu)選為含玉米淀粉的培養(yǎng)液。所述含玉米淀粉的培養(yǎng)液中的玉米淀粉的質(zhì)量百分含量為8%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有質(zhì)量百分含量為0.3%的乙酸鈉或丁酸鈉。所述發(fā)酵的溫度優(yōu)選37X:。所述丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwmaceto6"0^'c"m)SB-1CGMCC初始菌液濃度為109—1()Ucfu/mL。所述接種是將生長至對(duì)數(shù)期的丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwmaceto6w^&"一SB-1CGMCC地2287按照體積百分含量為5-10%的接種量接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述生長至對(duì)數(shù)期的丙酮丁醇梭菌(C/oWrWwmacetoZm/y/Zcwm)SB-1CGMCC按照體積百分含量為5%的接種量接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。以上述丙酮丁醇梭菌(C/a^nV//wwflcetoZm(y//cwm)SB-1CGMCC2287為活性成分的生物菌劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；該菌劑中可根據(jù)需要，添加可接受的輔料。本發(fā)明的丙酮丁醇梭菌(C7oWnWwmaceto^(y//ram)SB-1CGMCCW2.2287，發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，發(fā)酵生產(chǎn)所得的溶劑中丁醇重量比例達(dá)68-75%。圖1為丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/Mmflceto^O^'cwm)SB-1CGMCC的掃描電鏡照片具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例l、丙酮丁醇梭菌(C/o敗Wwmaceto^O^cwm)SB-1的分離、純化及其鑒定1、丙酮丁醇梭菌(C/os/rWwwac"o6M^//ci/m)SB-1的分離及純化七八月份采集云南騰沖溫泉附近植物根際的土樣40份。將土樣分別加入裝有l(wèi)OmLRCM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸鈉3.0g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,丁醇，pH6.8)的厭氧管中，混合后，在10(TC沸水中加熱90S，殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，于37。C溫箱中培養(yǎng)。定期觀察，挑出有氣泡產(chǎn)生的厭氧管，應(yīng)用亨蓋特滾管技術(shù)，分離單菌落。將單菌落挑出擴(kuò)培后，轉(zhuǎn)移玉米粉培養(yǎng)基(質(zhì)量百分含量為7%的玉米粉溶液)，37t:培養(yǎng)，觀察發(fā)酵現(xiàn)象，挑出有醪蓋形成的試管，總共得到產(chǎn)丁醇的菌株105株。對(duì)這些菌株在玉米粉培養(yǎng)基(質(zhì)量百分含量為7%的玉米粉溶液)中，37'C進(jìn)行重新發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵醪進(jìn)行液相色譜分析，比較各菌株的溶劑總產(chǎn)量和丁醇的比例，經(jīng)發(fā)酵篩選，選出一株發(fā)酵速度快，產(chǎn)生的丁醇比例高的菌株命名為SB-1。SB-1的電鏡照片如圖1所示，SB-1營養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)呈兩端圓形短桿狀，單一或雙聯(lián)，有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞有2.6-4.7X0.5~0.7微米。SB-1的生理生化特征鑒定按照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行，結(jié)果見表l。表l.SB-l的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>對(duì)SB-1進(jìn)行了16SrDNA序列擴(kuò)增，測(cè)序表明，SB-1的16SrDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，SB-1的16SrDNA序列ClostridiumacetobutylicumATCC824(U16166.1)的16SribosomalRNA(rrn)gene的同源性為100%，與ClostridiumacetobutylicumVKPMB-4786(AM231184.1)、Clostridiumacetobutylicum6MSU(AM231182.1)、Clostridiumacetobutylicum7MSU(AM231183.1)16SrRNA的同源性均為99%。從比對(duì)的結(jié)果可以看出，菌株SB-1為丙酮丁醇梭菌。根據(jù)厭氧生長的特性，產(chǎn)物分析結(jié)果，16SrDNA序列比對(duì)，可以確定篩選出的菌株為丙酮丁醇梭菌(C7oyW^'"macetoZw/y"cww)，命名為丙酮丁醇梭菌(aosfr^/ww丙酮丁醇梭菌(C/a^WwmacetoZ)i^//c"w)SB-1已于2007年12月11日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCW.2287。實(shí)施例2、利用丙酮丁醇梭菌(C/a^WwwacetoZm(y//cMm)SB-1CGMCCW2.2287生產(chǎn)丁醇將丙酮丁醇梭菌(aasfrW/Mwaceto6^y//cwm)SB-1CGMCC用RCM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g，乙酸鈉3.0g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，pH6.8)與37。C溫箱中靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，作為發(fā)酵種子液。將上述獲得的發(fā)酵種子液按照體積百分比為5%的量接種到裝有3L玉米粉培養(yǎng)基(含有質(zhì)量百分含量為8%的玉米粉的培養(yǎng)液)的7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為分別為35"C，37°C，39°C，發(fā)酵方式為靜止發(fā)酵；發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)。將發(fā)酵后的發(fā)酵液用液相色譜檢測(cè)各種有機(jī)溶劑含量，結(jié)果如表2所示。表2.SB-1在不同溫度下的溶劑產(chǎn)量(g丄勺和丁醇比例<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3、利用丙酮丁醇梭菌(C/o欲W"mGceto^(y"cwm)SB-1CGMCC生產(chǎn)丁醇將丙酮丁醇梭菌(C/ayWt//"wac^o^O^cww)SB-1CGMCC用RCM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g,蛋白胨lO.Og，牛肉膏l(xiāng)O.Og,葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸鈉3.0g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，丁醇，pH6.8)與37"溫箱中靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，作為發(fā)酵種子液。將上述獲得的發(fā)酵種子液按照體積百分比為5%的量接種到裝有3L玉米粉培養(yǎng)基(含有質(zhì)量百分含量為7%的玉米粉和質(zhì)量百分含量為0.3%的乙酸鈉或丁酸鈉的培養(yǎng)液)的7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37'C，發(fā)酵方式為靜止發(fā)酵；發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)。將發(fā)酵后的發(fā)酵液用液相色譜檢測(cè)各種有機(jī)溶劑含量，結(jié)果如表3所示。表3.添加不同外源物質(zhì)時(shí)SB-1的溶劑產(chǎn)量(g丄-1)和丁醇比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過以上實(shí)例可以看出野生型丙酮丁醇梭菌(C/o^WwmacetoZm(y"CMm)SB-1CGMCCW2.2287在發(fā)酵過程中，具有較好的溫度適應(yīng)性，在35'C-39"C之間都可以較好的發(fā)酵，丁醇的比例一般在68%~72%之間。經(jīng)過添加外源的的乙酸和丁酸后其丁醇的比例可以達(dá)到75%，且丁醇的產(chǎn)量超過了野生型菌株丁醇的耐受極限13克每升。這表明篩選到的菌株具有較好的遺傳改造及應(yīng)用前景。序列表〈160〉1<210〉1〈211>1411<212〉DNA<213〉丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/wwaceto6M(y//ram)<400〉1tacacatgcaagtcg3gcggggaacttcggttcccagcggCgg3Cgggtg60gggtaacctacctcatagtggggaatagcctttcgaaaggaagattaataccgcataata120ctcgagaatcgcatgattctgatttattcgctatgagatggacccgcggc180gcattagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcttcgatgcgtagccgeicctgaga240gggtgatcggccacattgga3ctga_ga_C3cggtccagactcctacgggaggcagcagtgg300ggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcaacgccgcgtgagtgstg犯ggtct360tcggatcgtaaaactctgtcttatgggacgataatgacggtaccst3ggaggaagccacg420gctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaa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