專利名稱：：鑒定西花薊馬的巢式pcr方法及特異引物的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領域：
，涉及一種能夠特異鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及特異引物。技術(shù)背景西花薊馬是一種世界性的危險性害蟲，起源于北美洲西部山區(qū)，最早記載于1895年，曾是美國加州最常見的一種薊馬，近年來侵入中國部分地區(qū)，被國內(nèi)有關專家確定為危險性外來入侵害蟲。西花薊馬直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等葉片、花器或果面上留下疤痕及斑點。此外，西花薊馬還能傳播番茄斑點萎蔫病毒等在內(nèi)的多種病毒，且在若蟲取食植物30分鐘后即可獲毒，然后主要由成蟲傳播。目前已知其寄主植物多達500余種，包括重要的菊科、葫蘆科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是溫室種植的花卉、茄果類植物受害最重，因此采取措施防止西花薊馬對植物的危害非常迫切。但由于其卵、若蟲、成蟲都有很強的隱蔽性，對藥劑容易產(chǎn)生抗藥性，而常規(guī)的防治措施難以奏效，所以在防治及檢疫工作中，早期鑒定出西花薊馬并提早防治非常有現(xiàn)實意義。目前為止，薊馬種類的鑒定主要以雌成蟲的形態(tài)特征為主，但是西花薊馬的成蟲體色具多態(tài)性---黑色、褐色和黃色，同時薊馬的若蟲、蛹無法通過形態(tài)鑒定到種，目前也有對未成熟時期的卵、若蟲或蛹進行分類的研究，但仍在研究階段，尚無明確定論。然而在植物檢疫過程當中，發(fā)現(xiàn)標本為若蟲時，通常須繼續(xù)飼養(yǎng)至成蟲才能夠鑒定。這樣，不僅耗時，且蟲體微小，常常在飼養(yǎng)過程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要開發(fā)一種快速、簡單且準確的鑒定技術(shù)。以PCR技術(shù)為基礎分子標記技術(shù)，能很好地解決這些問題。近年來，利用分子標記技術(shù)鑒別昆蟲種類的研究非常多，可利用的標記技術(shù)也非常多，但由于分析樣品的特殊性，對于選擇哪種分子標記技術(shù)卻很重要。在DNA分子標記技術(shù)的應用過程中，若所研究的昆蟲DNA資料未知的情況下，利用RAPD-PCR技術(shù)是最簡便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各種保存方式的標本，也可做特定害蟲的快速鑒定(DeBarroPJ,DriverF.UseofRAPD-PCRtodistinguishtheBbiotypefromotherbiotypesofBemisiatabaci(Gennadius)(Hemiptera:Aleyrodidae).AustrilianJournalofEntomology.1997,36(2):149-152;GarnerKJ，SlavicekJM.IdentificationandcharacterizationofaRAPD-PCRmarkerfordistinguishingAsianandNorthAmericangypsymoths.JournalofInsectMolecuarandBiology,1996,5(2):81-91;HaymerDandMclnnisD.ResolutionofpopulationsoftheMediterraneanfruitfly，Ceratitiscapitata,attheDNAlevelusingrandomprimersforthepolymerasechainreaction.Genome1994,37:244-248)。然而這種鑒定技術(shù)的開發(fā)需要收集完整的鑒定樣品作為對照，否則無法建立完整的分子標記技術(shù)；為彌補樣品不足的缺陷，直接由已知序列設計引物進行PCR檢測目的基因，不失為一有用的方法。根據(jù)文獻18S和28SrDNA在所有生物中具有功能上和進化上的同源性，其整體結(jié)構(gòu)和核酸序列在物種間非常保守，再加上中間包含保守區(qū)和變異區(qū)，適合于不同層次上的分類分析(HillisDMandDixonMT.RibosomalDNA:molecularevolutionandphylogeneticinference.QuarterlyReviewofBiology,1991，66，411-453;Cruickshank肌Molecularmarkersforthephylogeneticsofmitesandticks.SystematicandAppliedAcarology.2002,7:3-14)。然而在實際的分類鑒定實驗中，由于我們得到的標本量少至單頭蟲體，而薊馬體形微小，單頭提取的DNA濃度很低，即使運用上述分子鑒定方法，也經(jīng)常因為模板量太少而使鑒定工作難以順利進行。有研究者以線粒體DNA為分析模板，設計出特異鑒定出西花薊馬的特異引物，但由于線粒體DNA在細胞中含量較低，在實際鑒定實驗中需要3-4頭蟲體才能完成鑒定(周力兵，劉忠善，李春艷，丁元明PCR法鑒定西花薊馬，植物檢疫，2007，21(2):78-81)。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領域中的空白及存在的問題，本發(fā)明提供一種能快速、精確鑒定出西花薊馬的巢式PCR方法以及一對能特異鑒定出西花薊馬的PCR引物。一種鑒定西花薊馬的特異引物F1、F2，其序列為Fl:5,陽GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3'，F(xiàn)2:5'陽GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應分兩步，第一步以rDNA為模板用通用引物擴增出18S至28S區(qū)段，第二步反應以第一步PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物Fl、F2擴增西花薊馬特有的片段。所述通用引物為CS249，CS250,其序列分別為CS249:5，-TCGTAACAAGGTTTCCG-3，。CS250:5'-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3，。所述巢式PCR方法是雙管巢式PCR反應或單管巢式PCR反應。所述巢式PCR方法是單管巢式PCR反應。經(jīng)過同源比對分析西花薊馬與花薊馬之間高度保守的18S和28SrDNA區(qū)間，搜尋到變異區(qū)段，根據(jù)變異區(qū)段的序列信息設計出一對能特異地擴增出西花薊馬的特異引物F1、F2，因此本發(fā)明應用通用引物通過巢式PCR第一步反應將18S部分+ITSl+5.8S+ITS2+28S部分從基因組中大量擴增出來，然后在此基礎上應用特異引物F1、F2進行巢式PCR第二步反應，避免了特異引物F1、F2擴增基因組別的區(qū)段，使鑒定結(jié)果更為準確，提高了所設計引物的專一性。由于本發(fā)明所要鑒定的西花薊馬，非常難于獲得大量的樣本，很多時候少至單頭，所以提出的DNA量極少，rDNA在細胞中含量高，容易獲得，以rDNA作為分析的材料，以通用引物擴增出18S至28S區(qū)段作為次級模板，再利用特異引物特異性擴增西花薊馬，即使只有一只蟲體也能順利鑒定出西花薊馬，而不像利用線粒體DNA作模板時需要3—4頭蟲體才能完成檢測。另外在本發(fā)明中，巢式PCR由常規(guī)的雙管反應演變出了單管反應，單管反應對于實際的鑒定操作的快速、準確性提供了進一步的保證，特別是在海關檢疫或者植物病害診斷中，準確性和高效率常常很重要，單管巢式反應可以避免倒換樣品時造成模板污染和時間浪費。綜上所述，本發(fā)明提供了一種巢式PCR方法和一對特異引物，以薊馬的rDNA為分析模板，能將少至一頭的西花薊馬從與其親緣關系極近的薊馬種類中，高效、準確地鑒定出來，為植物病害診斷、海關檢疫、生物分類研究等工作提供了一種實用的技術(shù)。圖l.雙管巢式PCR第一步反應F01是西花薊馬的若蟲、F02是西花薊馬的成蟲；FI1是花薊馬的若蟲、FI2是花薊馬的成蟲。圖2.雙管巢式PCR第二步反應。F01是西花薊馬的若蟲、F02是西花薊馬的成蟲；FI1是花薊馬的若蟲、FI2是花薊馬的成蟲。圖3.采用與雙管巢式PCR相同的兩套引物對西花薊馬成蟲和若蟲、花薊馬的成蟲和若蟲、黃胸薊馬的成和若蟲、煙薊馬的成蟲和若蟲、塔六點薊馬成蟲進行單管巢式PCR鑒定。C14、H6、Q2為西花薊馬的成蟲，Bll西花薊馬的若蟲，E17、E2花薊馬的成蟲，Q10花薊馬的若蟲，R2、R18黃胸薊馬的成蟲，Rl黃胸薊馬的若蟲，T21、Sl、S2煙薊馬的成蟲，SH3煙薊馬的若蟲，Ol是塔六點薊馬。圖4.設計特異引物的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5.西花薊馬與花薊馬18S-28SrDNA序列比對分析。1至44號區(qū)間為薊馬18SrDNA保守區(qū)域；45至891號區(qū)域為ITS1;892至1067為5.8S區(qū)域；編號1068至1421為ITS2區(qū)域；1422至1485為28S區(qū)域。具體實施方式實施例1雙管巢式PCR步驟l特異引物設計搜索GENBANK中西花薊馬與其親緣關系較近的花薊馬、黃胸薊馬、煙薊馬、塔六點薊馬的18S與28S區(qū)段，用DNAman進行同源比對，根據(jù)其變異區(qū)段序列信息設計一對特異引物Fl、F2(圖4)。步驟2形態(tài)分類并飼養(yǎng)從田間不同寄主上采集薊馬成蟲，帶回室內(nèi)單頭詞養(yǎng)收集各自的后代，一部分進行形態(tài)學鑒定以區(qū)分種類，一部分作為分子鑒定的材料。經(jīng)形態(tài)學鑒定有如下種類西花薊馬foc"We"tofoPergande、花薊馬i^'"/omaTrybom、黃胸莉馬7!/zawarte"57'sMorgan、'煙薊馬Ito6a"'Lindeman禾口i荅六點薊馬Sco/oAnjwtofcz/zos/z//步驟3單頭DNA提取方法利用百泰克科技有限公司DNA提取試劑盒(CA^DP1201)說明書結(jié)合西花薊馬體小，組織量少的情況，將其步驟改成如下所述-1)往1.5ml的離心管內(nèi)加60uL的裂解液，將裝有裂解液的離心管置于-2(TC的冰箱內(nèi)，迅速冷凍5分鐘至裂解液呈堅硬冰塊狀；2)挑取1頭西花薊馬置于冰塊上，用燒鈍的黃槍頭迅速研磨薊馬蟲體，搗碎蟲體成黏糊狀；3)往黏糊狀液體中加入蛋白酶K1.75uL，蓋上管蓋將管放到旋渦震蕩器上震蕩片刻，混勻裂解液，然后于55。C水浴過夜；4)將離心管從水浴鍋中取出室溫冷卻至室溫，然后往里面加入RNA酶(10mg/mL)1.0uL并混勻，再在37'C中水浴30分鐘；5)再將離心管取出冷卻至室溫，加入蛋白沉淀液20ul，置于旋渦震蕩器上震蕩25秒鐘后，放入冰盒中冰浴15分鐘；6)然后將離心管放到離心機中13000轉(zhuǎn)/秒離心5分鐘；7)小心取上清于另一新離心管中，注意不要吸取到沉淀；8)向裝有上清的離心管中加入等體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻30次，靜止5分鐘；9)再12000轉(zhuǎn)/秒離心10分鐘，棄上清；10)往離心管內(nèi)加入lmL70。/。乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000轉(zhuǎn)/秒離心2分鐘，棄上清；611)再加llmL無水乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000轉(zhuǎn)/秒離心2分鐘，棄上清。將離心管室溫自然晾干；12)加入15uLDNA溶解液并65X:水浴1小時溶解DNA;13)-2(TC冰箱內(nèi)長期保存。步驟4第一輪PCR反應采用Moritz等2001年的文章(MoritzQDelkerC,PaulsenM，MoundLAandBurgermeisterW.ModernmethodsforidentificationofThysanoptera.OEPP/EPPOBulletin.2000,30:591-591)中記載的通用引物CS249(5-TCGTAACAAGGTTTCCG-3)和CS250(5'-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3')，以西花薊馬和花薊馬的基因組DNA為模板擴增rDNA的18S至28S區(qū)間，反應體系見表l-l:表1-1基因組DNA2.0(xLdNTPs(2.0mmo,)2單10xPCRBuffer2.5|uLMg2+(25醒ol/(xL)TaqEnzyme(5U/pL)O單MilliQH2011.5nL引物CS249(20pmoles)2.0ul引物CS250(20pmoles)2.0ul總體積定容至25^L反應程序95。C2分鐘；94。Cl分鐘，55'C1分鐘，72°C2分鐘，共25個循環(huán)；72°C5分鐘。10pL上述產(chǎn)物直接跑1%瓊脂糖，并回收直接送測序公司測序，驗證第一輪擴增產(chǎn)物是18S至28S區(qū)段之間的序列。如圖1所示，西花薊馬和花薊馬都在1.4kb處有一條帶，測序結(jié)果驗證所擴產(chǎn)物為rDNA的18s至28s之間的序列(圖5)。步驟5第二輪PCR反應在另一個per反應管中加入表1-2的反應混合液。表1-2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應程序95°C2分鐘；94°Cl分鐘，62°C40秒，72°C40秒，共25個循環(huán)；72°C5分鐘。產(chǎn)物7pL跑1%瓊脂糖電泳。檢測結(jié)果顯示只在西花薊馬的模板中檢測出條帶(圖2).實施例2單管巢式PCR所需試劑、引物、形態(tài)分類步驟等與實施例l相同，以西花薊馬的成蟲和若蟲、花薊馬的成蟲和若蟲，黃胸薊馬的成蟲和若蟲、煙薊馬的成蟲和若蟲、塔六點薊馬成蟲的基因組DNA為模板，PCR反應體系和步驟改為表2-1至表2-2所述。第一輪PCR反應體系如表2-1:表2-l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table反應程序95°C2分鐘；94°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C2分鐘，共10個循環(huán)；72°C5分鐘。第二輪PCR反應向第一輪反應產(chǎn)物中直接加入如表2-2的反應混合液。表2-2dNTPs(2.0mmol/nL)6.25&10xPCRBufferMg2+(25mmol/nL)5攀TaqEnzyme(5U/|iL)1.25|iLMilliQH2028.75^iL引物Fl(20pmoles)5.0ul引物F2(20pmoles)5.0ul總體積定容至57.5fiL反應程序95°C2分鐘；94°C1分鐘，62°C40秒，72°C40秒，共22個循環(huán)；72°C5分鐘。產(chǎn)物7pL跑1%瓊脂糖電泳分析結(jié)果。檢測結(jié)果表示該引物只在西花薊馬的模板中擴展出條帶，與其親緣關系最近的花薊馬，以及其它親緣關系較近的薊馬中都沒有擴增出條帶，說明該方法能靈敏，準確地鑒定出西花薊馬，發(fā)明提供的特異引物具有鑒定西花薊馬的專一性(圖3)。單管巢式反應節(jié)省了中間檢測以及倒換反應管的步驟，使鑒定反應更為準確和快速。附錄-序列表SEQNO.lFl:5'隱GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3'SEQNO.2F2:5'隱GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3，權(quán)利要求1.一種鑒定西花薊馬的特異引物F1、F2，其序列為F15’-GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3’，F(xiàn)25’-GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。2.—種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應分兩步，第一步以rDNA為模板用通用弓嗽擴增出18S至28S區(qū)段，第二步反應以第一步PCR產(chǎn)物為模板，用權(quán)利要求1中的特異引物F1、F2擴增西花薊馬特有的片段。3.權(quán)利要求2所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述通用引物為CS249，CS250，其序列分別為CS249:5，-TCGTAACAAGGTTTCCG-3，，CS250:5，-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3，。4.權(quán)利要求2所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是雙管巢式PCR反應或單管巢式PCR反應。5.權(quán)利要求4所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是單管巢式PCR反應。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領域：
，特別是涉及到一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及其特異引物。一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應分兩步，第一步以rDNA為模板用通用引物擴增出18S至28S區(qū)段，第二步反應以第一步PCR產(chǎn)物為模板，再根據(jù)18S至28S區(qū)間變異區(qū)段序列設計的特異引物F1、F2，進行第二輪反應，擴增西花薊馬特有的片段，兩輪PCR反應提高了鑒定的準確性，改進為單管巢式PCR后，提高了鑒定效率，經(jīng)實驗驗證，本發(fā)明提供的特異引物能在親緣關系很近的模板之間準確地鑒定出西花薊馬。文檔編號C12Q1/68GK101245391SQ200810102530公開日2008年8月20日申請日期2008年3月24日優(yōu)先權(quán)日2008年3月24日發(fā)明者吳青君,張友軍,張治軍,徐寶云申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所