專利名稱：新的抗β-淀粉樣多肽抗體的可變區(qū)序列及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗P -淀粉樣多肽的抗體，進(jìn)一步涉及新的抗P -淀粉樣
多肽的特異性scFv抗體，及其可變區(qū)的氨基酸序列和DNA編碼序列。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種以老年人中進(jìn)行性記 憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年 斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失是AD的三大主要病理特征。其中 老年斑的主要成分是P-淀粉樣多肽(beta-amyloid peptide, )聚集 形成的纖維，而A3被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能衰退的主要 致病物質(zhì)[Frost D.Co-incorporation of A beta 40 and A beta42 to form mixed pre畫fibrillar aggregates.Eur J Biochem,2003，270(4):654-663;i。 AJ3主 要包括A卩40和A卩42兩種分子，由39 43個(gè)氨基酸組成。一般認(rèn)為Ap 是由于編碼APP的基因發(fā)生突變或其他原因?qū)е聀-分泌酶活性異常增 高時(shí)，與，分泌酶共同切割產(chǎn)生?，F(xiàn)在也有觀點(diǎn)認(rèn)為AD患者腦內(nèi)高 于正常人濃度的Ap可能是由于Ap的轉(zhuǎn)運(yùn)清除發(fā)生障礙所致。研究證 實(shí)大腦及腦脊液中AP含量的增高與認(rèn)知能力下降密切相關(guān)。AP結(jié)構(gòu) 中的疏水區(qū)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)A(3纖維的形成起著重要的作用，其1 28位氨 基酸為親水的氨基末端，29位之后為疏水的羧基末端。由于疏水氨基 酸主要位于羧基端，所以羧基端的長(zhǎng)度決定其溶解性的高低，并影響 聚集成纖維的速度。AP相互聚集形成的纖維具有毒性，能夠促發(fā)炎癥 級(jí)聯(lián)反應(yīng)、軸突損傷、突觸丟失和細(xì)胞凋亡等病理改變，是導(dǎo)致神經(jīng) 元變性乃至形成癡呆的重要因素[McGeer EG ， McGeer PL ， Inflammatory processes in Alzheimer's disease[J] ， Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2003， 27(5)1741-749]。
隨著全世界人口老齡化程度的不斷提高，這種疾病的發(fā)病率也在 逐漸的上升，給社會(huì)和家庭在物質(zhì)和精神上都帶來(lái)了巨大的影響。如何找到一種可以治療這種疾病的藥物是一個(gè)緊迫的需求。但至今尚無(wú) 特效的治療措施，臨床上主要以對(duì)癥治療和康復(fù)療法為主，如應(yīng)用乙 酰膽堿酯酶抑制劑，以彌補(bǔ)因神經(jīng)細(xì)胞退化而帶來(lái)的乙酰膽堿神經(jīng)介
質(zhì)下降。但這些療法不能從根本上治療AD。而針對(duì)AP多肽在發(fā)病中 的關(guān)鍵作用，研究開發(fā)抗Ap多肽抗體就具有治療AD的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
抗AP抗體治療AD，主要通過(guò)兩種途徑清除體內(nèi)的AP [盛樹力， 主編.老年性癡呆及相關(guān)疾病.北京科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2006:
179-200]。 一是抗體經(jīng)過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)與老年斑中的AP纖維結(jié) 合，小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)Fc受體與抗體的Fc片段結(jié)合，吞噬、清除其中 的AP纖維；二是抗體在外周循環(huán)中與可溶性的AP結(jié)合，增大血腦 屏障內(nèi)外A3的濃度差，促進(jìn)腦內(nèi)的A0外流，從而降低腦內(nèi)的A3 水平，減少Ae在腦內(nèi)的聚集和沉積。目前，已證明抗AP抗體(包 括多抗、單抗、抗體片段等)在體外試驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)對(duì)清除Ae有肯 定的效果，抗AP抗體治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
體外試驗(yàn)研究進(jìn)展主要是觀察抗A3抗體中和或清除AP的作用。 Legleiter等分別用m266和3D6單克隆抗體與AP l-42以l: IO的摩爾比一 起孵育，幾天之后用原子力顯微鏡(AFM)觀察AP纖維形成情況發(fā)現(xiàn) 兩種單抗都能有效抑制AP纖維的形成，其中m266效果更好一些 [Legleiter J，Czilli DL,Gitter B,et al.Effect of different anti-Abeta antibodies on Abeta fibrillogenesis as assessed by atomic force microscopy.J Mol Biol，2004,335(4):997-1006]?？笰3抗體可以提高細(xì)胞對(duì)AP的耐受性、 對(duì)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞及海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用[楊志勇,汪華僑，徐杰等. 阿爾茨海默病人外周血中抗淀粉樣蛋白的特性.解剖學(xué)研 究，2005,27:83-87.Du Y,Wei X，Dodel R，et al.Human anti-P-amyloid antibodies block P -amyloid fibril formation and prevent P -amyloid-induced neurotoxicity.Brain,2003,126(9):1935-9]。為了檢測(cè)抗體 清除斑塊的效應(yīng),Bard等用抗A3單抗(10D5、 3D6)經(jīng)腹腔注射給PDAPP
轉(zhuǎn)基因小鼠，六個(gè)月后處死小鼠，其冰凍腦切片與小膠質(zhì)細(xì)胞一起孵 育24小時(shí)，通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)外源小膠質(zhì)細(xì)胞可以吞噬斑塊中的AP纖 維；而對(duì)照組，斑塊保持完整且未見小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象[Bard F,Cannon C,Barbour R，et al.Peripherally administered antibodies againstamyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease.Nat Med,2000，6(8):916-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道健康人體內(nèi)提取的靜注免疫球蛋白 (IVIQ intravenous immunoglobulin)中含有抗A 抗體[Dodel RC，Du Y,Depboylu C,et al.Intravenous immunoglobulins containing antibodies against fi-amyloid for the treatment of Alzheimer's disease.Joumal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry,2004,75:1472-1474]，這些抗體不 僅能抑制AP聚集成纖維，還能使已經(jīng)形成的A3纖維降解，同時(shí)還可 以提高小膠質(zhì)細(xì)胞向淀粉樣斑塊遷移的能力，并介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬、 降角軍A P [Solomon B.Intravenous immunoglobulin and Alzheimer's disease immunotherapy. Curr Opin Mol Ther，2007,9(1 ):79-85. Istrin G，Bosis E，Solomon B,et al.Intravenous immunoglobulin enhances the clearance of fibrillar amyloid-beta p印tide.J Ne蘭sci Res，2006，84(2):434-43] 。 Fukuchi 等提出，抗AP抗體的scFv片段也可以抑制Ae寡聚體(AP oligomers) 對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用[Fukuchi K,Accavitti-Loper MA,Kim HD，et al.Amelioration of amyloid load by anti-Abeta single-chain antibody in Alzheimer mouse model.Biochem Biophys Res Commun ， 2006 ， 344(1):79-86]。上述體外試驗(yàn)表明，抗A3抗體可以通過(guò)Fc受體介導(dǎo)小 膠質(zhì)細(xì)胞吞噬、降解Ae纖維，也可以通過(guò)其他方式來(lái)抑制A3聚集成 纖維或斑塊。
動(dòng)物試驗(yàn)是抗體進(jìn)入臨床研究的前提,目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用 APP轉(zhuǎn)基因鼠?？贵w經(jīng)外周(如靜脈、腹腔)或經(jīng)顱腔導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)， 然后觀察抗體在體內(nèi)的分布、發(fā)揮作用的部位及作用效果。1999年 Schenk等發(fā)現(xiàn)抗AP抗體可以清除小鼠腦內(nèi)老年斑并可預(yù)防老年斑的 形成[Schenk D,Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid—beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999， 400(8):173-7]。 DeMattos等將抗A P單克隆抗體m266經(jīng)外周靜脈 注入僅能在腦組織中表達(dá)APP的PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示血 漿中Ae濃度增高1000倍，腦組織中AP蓄積明顯減少，說(shuō)明抗體能中 和外周循環(huán)中的AP ，使腦內(nèi)的Ae逐歩擴(kuò)散入血液而被清除[DeMattos RB，Bales KR，C畫mins DJ,et al.Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mousemodel of Alzheimer's disease.Proc Natl Acad Sci U S A， 2001， 98 (15):8850-5]。 Bard等將抗A 3抗體經(jīng)腹腔注射到PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠體 內(nèi)，六個(gè)月后影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)斑塊減少80%以上，抗體能通過(guò)血腦屏障 結(jié)合淀粉樣斑塊，并激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)了先前已存在的淀粉樣斑 塊的清除。Chauhan等直接將抗體注射到第三腦室中，并且在注射后不 同時(shí)間段檢查小鼠的大腦組織，檢測(cè)結(jié)果表明，到第四周時(shí)，治療組 淀粉樣蛋白的密度比對(duì)照組小鼠減少了67%，同時(shí)也證明了抗A3單抗 腦室內(nèi)注射后第四周效果達(dá)到高峰，八周后開始消失[Chauhan NB,Siegel GJ.Intracerebroventricular passive immunization in transgenic mouse models of Alzheimer's disease.Expert Rev Vaccines, 2004, 3(6):717-25. Chauhan NB.Intracerebroventricular passive immunization with anti-oligoAbeta antibody in TgCRND8.J Neurosci Res， 2007， 85(2):451-63]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)AP寡聚體也有較強(qiáng)的毒性，Ma等將抗A P抗體注射到Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其可以清除小鼠腦內(nèi)Ae寡 聚體，對(duì)保護(hù)動(dòng)物腦神經(jīng)損傷有積極意義[Ma QL,Lim GP,Harris-White ME，et al.Antibodies against beta-amyloid reduce Abeta oligomers,glycogen synthase kinase-3beta activation and tau phosphorylation in vivo and in vitro， J Neurosci Res， 2006， 83(3):374-84]。 Levites等發(fā)現(xiàn)，抗AP1畫40 及A3 l-42的單克隆抗體注入APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后，腦內(nèi)淀粉樣斑塊 總量減少50。/。左右[Levites Y,Smithson LA,Price RW,et al.Insights into the mechanisms of action of anti-Abeta antibodies in Alzheimer's disease mouse models.FASEB J，2006,20(14):2576-8. Levites Y，Das P,Price RW，et al.Anti-Abeta42- and anti-Abeta40-specific mAbs attenuate amyloid deposition in an Alzheimer disease mouse model.J Clin Invest, 2006， 116(1):193-201]。除了上述全抗體以外，抗體片段也能在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮 效應(yīng)。研究人員已經(jīng)成功應(yīng)用抗AP單克隆抗體片段，如特異F(ab' )2 片段、scFv片段等，經(jīng)腹腔注射、顱內(nèi)注射或經(jīng)腺病毒介導(dǎo)等不同給 藥途徑導(dǎo)入APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，都明顯減少了腦內(nèi)的老年斑塊 [Tam歸 Y,Hamajima K，Matsui K,et al.The F(ab)'2 fragment of an Abeta-specific monoclonal antibody reduces Abeta deposits in the brain.Neurobiol Dis，2005，20(2):541-9. Fukuchi K,Tahara K，Kim
HD,et al.Anti-Abeta single-chain antibody delivery via adeno-associatedvirus for treatment of Alzheimer's disease.Neurobiol Dis ， 2006 ， 23(3):502-ll]。
抗AP抗體治療AD在體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)中是比較成功的。但 最終要用于人體治療的抗體必須是經(jīng)過(guò)人源化的，以克服鼠單克隆抗 體在人體引起人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的局限性。獲得人源化抗體 一般是采用將鼠源抗體進(jìn)行人源化改造，但這種方法技術(shù)復(fù)雜難度高， 即使改造后也難以得到百分之百的人源化，且有可能在改造過(guò)程中使 原來(lái)抗體的效價(jià)親和力降低[Mike Clark. Antibody humanization: a case of the 'Emperor ，s new clothes Immunol Today, 2000, 21(8): 397-402]。 另一方法就是利用噬菌體表面展示技術(shù)直接從人源抗體基因庫(kù)中篩選 [Hennie RH. Selecting and screening recombinant antibody bibraries. Nature Biotechnol， 2005， 23(9): 1105-1116]，天然抗體庫(kù)中的基因來(lái)自 于未經(jīng)免疫的人B細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞)全套可變區(qū)基因， 具有足夠的容量和廣泛的多樣性，通常含有106-109個(gè)不同抗原結(jié)合特 異性的抗體分子克隆，可以對(duì)百萬(wàn)乃至億萬(wàn)個(gè)分子進(jìn)行選擇，且每一 輪"吸附一洗脫一擴(kuò)增"可以使目的抗體濃度濃縮50-1000倍，使抗原 特異性較強(qiáng)的克隆得到富集，非常容易從抗體庫(kù)中篩選到特異性抗體。 而且從中篩選出來(lái)的抗體已經(jīng)是完全人源的，無(wú)需再進(jìn)行人源化改造。 單鏈抗體(scFv)是利用噬菌體表面展示技術(shù)制備的小分子抗體片段， 它沒(méi)有完整抗體的Fc段，只包含VH和VL片段以及中間的連接膚 (Linker),卻較好地保持了完整抗體的抗原親和活性，是具有完整抗原 結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。
scFv與完整的抗體相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):(l) scFv分子小、免疫原
性低。其相對(duì)分子量只有完整抗體的六分之一，應(yīng)用于人體不易產(chǎn)生 異源反應(yīng)。(2)scFv穿透力強(qiáng)。進(jìn)入機(jī)體后，能夠迅速穿過(guò)血管壁和組 織屏障到達(dá)耙細(xì)胞和靶組織，有利于疾病治療。(3)scFv可在原核系統(tǒng) 中表達(dá)，易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，成本低廉；也可用基因 工程方法構(gòu)建與其他效應(yīng)分子如藥物、細(xì)胞因子等連接的各種融合蛋 白。(4) scFv沒(méi)有Fc段，不需要與非靶細(xì)胞的Fc受體結(jié)合，有利于 作為導(dǎo)向藥物的載體。(5)scFv半衰期短，易從血液清除，腎臟蓄積量 少，鑒于scFv具備的以上優(yōu)點(diǎn)，使其己經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前，scFv的研究和利用基因工程生產(chǎn)及應(yīng)用進(jìn)展迅猛，在生物制劑藥
的臨床試驗(yàn)中已占據(jù)30%以上的份額。但scFv半衰期短也是它的一個(gè) 缺點(diǎn)，scFv的另一缺點(diǎn)是穩(wěn)定性較差易于降解。
全抗體是將可變區(qū)基因連接上人抗體的恒定區(qū)FC段基因重組而 成，全抗體因?yàn)橛泻愣▍^(qū)和FC段，分子量更大、穩(wěn)定性更高和半衰期 更長(zhǎng)；由于全抗體是雙價(jià)結(jié)合抗原，而scFv是單價(jià)結(jié)合抗原，所以理 論上親和力會(huì)比scFv大；再者，全抗體的恒定區(qū)和FC段可以相應(yīng)激 活補(bǔ)體，有利于直接清除抗原，或與具有FC受體的細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生免 疫清除作用，所以理論上更具有應(yīng)用價(jià)值。但是全抗體會(huì)增加穿過(guò)血 腦屏障的難度，但已有研究顯示確有部分抗體可以穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮 作用，而即使留在血循環(huán)中的抗體也可與血液中的AP結(jié)合并清除， 血液中的AP降低后大腦中的A3單體會(huì)不斷滲透到血管中，從而使 大腦中的A3物質(zhì)得以減少，同樣起到減少大腦中A3病變物質(zhì)的作 用[DeMattos RB, Bales KR， Cummins DJ， et al. Peripheral anti-Ap antibody alters CNS and plasma Ap clearance and decreases brain A|3 burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(15): 8850—8855]。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于目前治療AD的狀況，發(fā)現(xiàn)新的抗AP抗體有助于促進(jìn)和改 善對(duì)治療AD的治療。本發(fā)明提供新的人源化抗AP抗體可變區(qū)片段 及其編碼序列。
本發(fā)明提供了一種包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和連接序列的人 源抗A 0特異性scFv抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
本發(fā)明還提供了一種編碼所述的人源抗AP特異性scFv抗體的 DNA，其核苷酸序列由SEQIDNO:l所示的DNA、 SEQIDNO:3所示 的DNA和編碼連接序列的DNA組成。
另一方面，本發(fā)明還提供了編碼抗A P特異性scFv抗體的重鏈可 變區(qū)序列的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；編碼抗AP特 異性scFv抗體的輕鏈可變區(qū)序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
再一方面，本發(fā)明提供了包括所述的DNA的重組載體及其相應(yīng)的 重組宿主細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞優(yōu)選的是大腸桿菌rEw/^7'c/2^co//)。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了于2008年3月12日保藏于中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2399的重組
大腸桿菌。
本申請(qǐng)?zhí)峁┑挠幸嫘Ч谟谔峁┝艘环N新的抗A0抗體，且所獲 得的抗AP抗體是scFv。


圖l:陽(yáng)性噬菌體克隆的ELISA檢測(cè)結(jié)果。
圖2:陽(yáng)性噬菌粒PCR結(jié)果，其中M為標(biāo)記物；l-7為ELISA效 價(jià)較高的7個(gè)噬菌體克隆。
圖3:陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)全菌蛋白電泳結(jié)果，其中M為標(biāo)記物；
2、 4、 6、 8、 9、 11、 13為誘導(dǎo)的AIO、 D8、 F2、 B9、 E6、 F4、 G2 噬笛體克隆；1、 3、 5、 7、-10、 12、 14為相應(yīng)的噬箇體克隆但未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)。
圖4: A10克隆可溶性表達(dá)的scFv抗體在各組分中的分布，其中1 為未誘導(dǎo)的培養(yǎng)上清；2為IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)上清；3為未誘導(dǎo)的胞周 質(zhì)；4為IPTG誘導(dǎo)的胞周質(zhì)；5為未誘導(dǎo)的全菌蛋白；6為IPTG誘導(dǎo) 的全菌蛋白。
圖5:誘導(dǎo)株與未誘導(dǎo)株各組分中可溶性scFv的ELISA結(jié)果。 圖6:抗AP抗體抗體的基因可變區(qū)序列及相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白，根據(jù)本申請(qǐng)公開的內(nèi)容結(jié)合本領(lǐng)域技 術(shù)常識(shí)，本申請(qǐng)公開的DNA序列和氨基酸序列可以按照本領(lǐng)域常用的 其他方法合成，例如通過(guò)化學(xué)合成的方法得到本申請(qǐng)公開的序列。而 且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本申請(qǐng)獲得的新的DNA序列構(gòu)建到任何合 適的載體、宿主細(xì)胞中。下述內(nèi)容僅僅是對(duì)本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍的 示例性說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所公開的內(nèi)容對(duì)本申請(qǐng)的發(fā)明 作出多種改變和修飾，而其也應(yīng)當(dāng)屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍之中。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:單克隆噬菌體抗體的篩選
利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行多輪富集篩 選，以純化的阿爾茨海默病A3為抗原進(jìn)行了四輪"吸附一洗脫一擴(kuò) 增"的富集篩選，顯示每輪篩選回收率呈遞增趨勢(shì)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)篩選后， 具有AP特異性的噬菌體得到了高度富集(表l)。方法如下
(1) 噬菌體抗體庫(kù)的擴(kuò)增取100)il原庫(kù)菌液，接種到100ml 2 X YT-AG(含100嗎/ ml氨芐青霉素，1%葡萄糖的2X YT)培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。加1012pfo (噬菌斑形成單位)輔助噬菌體 M13K07于培養(yǎng)液，37°C水浴30min， 4°C離心后棄上清。用100ml2 X YT-AK(含lOOpg / ml氨芐青霉素，50pg / ml卡那霉素的2X YT)重 懸沉淀，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。4。C離心，上清即為擴(kuò)增后的噬菌體抗體庫(kù)。 加100mlPEG/NaCl于上清中，冰浴lh后離心棄上清，用PBS重懸 沉淀，4'C保存。
(2) 抗體庫(kù)的富集篩選以純化的A3 1-42 (400ng /孔)包被酶標(biāo) 板8個(gè)孔，4。C放置過(guò)夜。次日用2。/。MPBS(含2。/。脫脂奶粉的PBS)37 'C封閉2h，棄上清，洗孔后，每孔加入100pl擴(kuò)增后的噬菌體抗體上 清，37。C孵育2h。棄上清，洗孔(第一輪篩選時(shí)洗3次，第二輪洗5 次，第三輪以后洗10次以上)，每孔加100pl 100mmol/L甘氨酸-鹽酸
(pH2.2)洗脫特異性噬菌體抗體，室溫孵育10min后，立即加入lmol/L Tris(pH7.4)中和特異洗脫下來(lái)的噬菌體抗體。將洗脫液加入2ml新鮮制 備的對(duì)數(shù)期TG1菌液中，37°C水浴30min后，取少量菌液測(cè)噬菌體 抗體滴度，余全部涂TYE—AG平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日從TYE 板上刮下菌落，所得到的菌落被擴(kuò)增并用于制備下一輪篩選用噬菌體。 共進(jìn)行四輪篩選。計(jì)算每輪投入和產(chǎn)出量。
表l各輪富集篩選中噬菌體抗體的回收率
篩選次數(shù)投入量(pfli)產(chǎn)出量(pfii)回收率(％)
13.68X101'1.28X1063.31 X10-4
21.02X10111.62 X1061.59X10-3
103 1.98X 1011 4.32X107 2.18X 10—2
4 3.20X10'1 2.45 X108 7.65 X 10—2
注回收率(％)=產(chǎn)出噬菌體量/投入噬菌體景X 100% 實(shí)施例2:對(duì)單克隆噬菌體抗體進(jìn)行檢測(cè)
從第四輪篩選后過(guò)夜培養(yǎng)的TYE-AG平板上隨機(jī)挑取80個(gè)單細(xì)菌 克隆，培養(yǎng)制備噬菌體抗體。檢測(cè)用ELISA法抗原A3包被酶標(biāo)板 (0.4pg/ L)，封閉后向每孔加lOOpl單克隆噬菌體抗體上清液，37。C溫 育2h。洗滌后加入1:5000的HRP標(biāo)記鼠抗M13抗體，37"C溫育lh。 陽(yáng)性對(duì)照為一抗(鼠抗人A3)， 二抗(羊抗鼠lgG);陰性對(duì)照僅加入2% MPBS。以O(shè)PD為底物，2M硫酸終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀OD490nm檢測(cè)。 以O(shè)D值大于陰性對(duì)照的2倍，判斷為陽(yáng)性。單克隆噬菌體抗體與A P抗原結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)ELISA檢測(cè)，共得到7個(gè)陽(yáng)性克隆(AIO、 D8、 F2、 B9、 E6、 F4、 G2)。 7個(gè)陽(yáng)性克隆ELISA結(jié)果的A值均高于 陰性對(duì)照2倍以上。取其中ELISA效價(jià)較高的2個(gè)克隆A10和F2反 復(fù)鑒定。結(jié)果顯示，這2個(gè)克隆均可特異性識(shí)別A3純化抗原，不與 陰性對(duì)照無(wú)關(guān)抗原結(jié)合，且ELISA檢測(cè)A值高于陰性對(duì)照5倍以上(圖 1)。
(2) PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌液PCR擴(kuò)增第四輪篩選后獲得的陽(yáng) 性克隆菌，引物為通用引物L(fēng)MB3和Fdseq。引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂 糖凝膠電泳分析。結(jié)果7個(gè)陽(yáng)性菌經(jīng)質(zhì)粒提取后行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝 膠電泳，可見7個(gè)克隆片段為1050bp左右，符合預(yù)期scFv抗體片段 PCR產(chǎn)物的理論值(圖2)。
實(shí)施例3:可溶性抗AP scFv片段的表達(dá)和鑒定 (1)陽(yáng)性噬菌粒在大腸桿菌HB2151中誘導(dǎo)表達(dá)，將展示有特異 結(jié)合AP的抗體的噬菌體感染對(duì)數(shù)期大腸桿菌HB2151， 37t:水浴靜置 30min 。接種于SOBAG-N平板上，3(TC培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。從多個(gè) 不同克隆來(lái)源的平板上各挑l個(gè)克隆，分別接種于5ml2XYT-AG培 養(yǎng)基中，30。C振搖過(guò)夜。將5 ml過(guò)夜菌加到50 ml新鮮2X YT-AG培 養(yǎng)基中，于30 。C振搖l h。離心，棄上清，沉淀重懸于50 ml新鮮2XYT-AI(I:IPTQlmM)培養(yǎng)基中，30 。C誘導(dǎo)表達(dá)20h。離心，上清 過(guò)濾除菌-20'C儲(chǔ)存。將一管沉淀用0.5ml冰冷的1 XTES重懸，然后加 入0.75ml冰冷的1/5XTES進(jìn)行渦旋，冰浴30 min。離心，上清即周 質(zhì)提取物，-2(TC儲(chǔ)存。將另一管沉淀用0.5mlPBS懸浮，煮沸5min， 離心，上清即全菌提取物，-20"儲(chǔ)存。取各克隆的全菌蛋白進(jìn)行 12%SDS-PAGE電泳，可見A10和F2克隆在相對(duì)分子質(zhì)量約33,000Da 處呈現(xiàn)目的條帶，這一條帶與預(yù)計(jì)的可溶性scFv的分子量相符，其他 5個(gè)克隆未見相應(yīng)位置的目的條帶(圖3)。
(2) Western Blot:將表達(dá)產(chǎn)物樣品處理后經(jīng)12%SDS-PAGE電 泳分離后，于冰浴、170mA下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，然后將硝酸纖維素膜浸入TBS
(含5%脫脂奶粉)中，4。C封閉過(guò)夜。再與1:2000的HRP標(biāo)記鼠抗 c-myc標(biāo)簽抗體37°。溫育2h。洗滌后加入1:5000的HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體37。C溫育1 h。 DAB顯色，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的相應(yīng)產(chǎn)物作對(duì) 照。檢測(cè)可溶性抗AP scFv的表達(dá)。將A10克隆誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液上 清、胞周質(zhì)提取物和全菌蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，可見在相對(duì)分子 質(zhì)量約33，000Da處呈現(xiàn)陽(yáng)性條帶，以全菌蛋白反應(yīng)更強(qiáng)，這一條帶與 預(yù)計(jì)的可溶性scFv的分子量相符，而未誘導(dǎo)的A10克隆未檢測(cè)到陽(yáng)性 條帶(圖4)。
(3) ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物抗體活性步驟同單克隆噬菌體抗體的 ELISA檢測(cè)。 一抗為表達(dá)產(chǎn)物可溶性抗體，二抗為1:2000的HRP標(biāo)記 鼠抗c-myc標(biāo)簽抗體，三抗用1:5000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體， 陰性對(duì)照僅加入2% MPBS。效價(jià)較高的A10和F2克隆的各組分表達(dá) 抗體ELISA結(jié)果顯示，抗體可與人AP結(jié)合，不與陰性對(duì)照無(wú)關(guān)抗原 結(jié)合，誘導(dǎo)株的A值高于未誘導(dǎo)株的2倍以上，其中在上清中和全菌 蛋白中分別高于5倍以上(圖5)，表明抗體具有生物學(xué)活性。因此， 初步認(rèn)定A10和F2克隆菌分泌的產(chǎn)物即為抗人A P特異性scFv抗體。
實(shí)施例4:DNA序列測(cè)定
提取陽(yáng)性克隆的噬菌粒，利用ScFv DNA測(cè)序引物，交由上海生 工測(cè)序部經(jīng)雙脫氧末端終止法對(duì)scFv DNA中的VH和VL DNA分別 進(jìn)行序列測(cè)定。人源抗A 3特異性scFv抗體基因的序列分析獲得A10和F2克隆的輕鏈、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，并運(yùn)用Blast軟件對(duì)所 獲得的序列與GeneBank中的免疫球蛋白可變區(qū)基因進(jìn)行綜合比對(duì)分 析。分析結(jié)果表明所獲得的A10和F2克隆的可變區(qū)基因符合scFv 抗體基因，推導(dǎo)得到的氨基酸序列具有典型的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)，蛋白 序列根據(jù)Ig blast和Kabat編碼確定出CDR的起始和終止部位。下劃 線部分為高變區(qū)(HVR)，又叫互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其氨基酸組成和 排列順序高度可變。VH和VL的3個(gè)CDR共同組成免疫球蛋白的抗 原結(jié)合部位，負(fù)責(zé)識(shí)別及結(jié)合抗原，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)。其余部分為 骨架區(qū)(FR)，其氨基酸組成和排列順序相對(duì)不易變化。(圖6)， 2個(gè) 克隆的基因序列一致，表明2個(gè)克隆菌可能來(lái)源于同一株原始噬菌粒。 其中將抗AP抗體基因的重鏈可變區(qū)序列命名為SEQ IDNO.:l,其 編碼的蛋白質(zhì)序列命名為SEQ IDNO.:2;將抗AP抗體基因的輕鏈可 變區(qū)序列命名為SEQ ID NO.:3,其編碼的蛋白質(zhì)序列命名為SEQ ID NO.:4。其中，重鏈可變區(qū)的CDR1的序列為SEQIDNO.:5， CDR2的 序列為SEQ ID NO.:6， CDR3的序列為SEQ ID NO.:7;輕鏈可變區(qū)的 CDR1的序列為SEQIDNO.:8， CDR2的序列為SEQ ID NO.:9， CDR3 的序列為SEQ IDNO.:IO。
實(shí)施例5:工程菌株的長(zhǎng)期保存。
1)含陽(yáng)性噬菌粒的TG1菌株利用噬菌體展示技術(shù)篩選出的陽(yáng)
性噬菌體感染TG1菌得來(lái)。復(fù)蘇后可在2XYT-AG(A: Amp, 100嗎/ ml; G: ly。Glu)中與噬菌體融合表達(dá)出抗A e的scFv抗體。
2)含陽(yáng)性噬菌粒的HB2151菌株利用噬菌體展示技術(shù)篩選出的 陽(yáng)性噬菌體感染HB2151菌得來(lái)。復(fù)蘇后可在2XYT-AI(A:Amp, lOOjig /ml; I : IPTQ1 mM)中可溶性表達(dá)出抗AP的scFv抗體，該菌株于 2008年3月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2399。序列表
<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所
〈i2o>新的抗e -淀粉樣多肽抗體的可變區(qū)序列及其編碼序列
<160> 10
<170〉 Patentln version 3.4
<210> 1
〈211〉 369
<212> 腿
<213> 人
<400> 1
g鄉(xiāng)tgcagctggtgcagtctggggctgaggtga卿ggcctgggtcgtcggtg朋cgtc60
tcctgcaaggcttctggaggcaccctcagcaactatggtctcagctgggtgcgccaggcc120
cctggac犯ggtcttgagtggatgggaggcatcatcccttcctttggccccgcaaactac180
gcacagatattccagggcagagtcaccatcaccgcggacgaatcgacga^cacagcctac240
atggaattgaggagcctgacatctgacg3cacggccgtgtattactgtgcgag卿gggg300
ggggtaggagtggcaacaacatattggctcgacccctggggccaggggaccacggtcacc360
gtctcctcc369
〈400〉 2
Glu Val Gln 1
Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
5
10 15
Ser Val Asn Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25
30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gin lie Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65
70
75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr T卬Leu Asp Pro 100 105 110
s人
14Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<400> 4
His Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser lie Ala Ser Thr 20 25 30
Tyr Val His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45
lie Tyr Glu Asp Asn Arg Arg His Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser 85 90 95
Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110
<400〉 3 cattttatgctgactcagccccactctgtgtcggagtctccgggg肌gacggtaaccatc60
tcctgcacccgcagcagtggcagcattgccagcacctEitgtgcactggtaccagcagcgc120
ccgggcticttCCCCC3CC3Ctgtgatctatgaggataaccg犯gacactctagagtccct180
gatcgcttctctggctccatcgacagctcctccaactctgcctccctcaccatctctgga240
ctgaageictg鄉(xiāng)acgagggtgactactactgtcagtcttatgatagcacc犯tgcgtgg300
gtgttcggcgg鄉(xiāng)gacc犯ggtcaccgtcctaggt336
<400〉 5
Asn Tyr Gly Leu Ser 1 5
<210> <211> <212> <213>
6 A
3 N 、
3 3 D 7
> z\ z\ >
2 2 2 2
V < < <
XPro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gin lie Phe Gin 5 10 15
Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr Trp Leu Asp Pro Trp Gly 5 10 15
Ser Gly Ser lie Ala Ser Thr Tyr Val His 5 10
Arg Arg His Ser 5
Asp Ser Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly 5 10
〈210〉 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Gly lie lie
Gly
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Glu Gly Gly 1
Gin Gly
<400〉 8
Thr Arg Ser 1
<210> 9
<211> 7
<212〉 PRT
〈213〉 人
<400> 9
Glu Asp Asn 1
<210> 10
<21D 14
<212〉 PRT
<213> 人
<400〉 10
Gin Ser Tyr 1
3 R、
i
權(quán)利要求
1.一種包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和連接序列的人源抗Aβ特異性scFv抗體，其特征在于其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
2. —種編碼如權(quán)利要求1所述的抗AP特異性scFv抗體的重鏈可 變區(qū)序列的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3. —種編碼如權(quán)利要求1所述的抗A P特異性scFv抗體的輕鏈可 變區(qū)序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4. 一種編碼如權(quán)利要求1所述的人源抗AP特異性scFv抗體的 DNA，其核苷酸序列由權(quán)利要求2所述的DNA、權(quán)利要求3所述的 DNA和編碼連接序列的DNA組成。
5. —種包括如權(quán)利要求4所述的DNA的重組載體。
6. —種包括如權(quán)利要求5所述的重組載體的重組宿主細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌rS"/^7'W/"
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞，所述的大腸桿菌于2008 年3月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏號(hào)為CGMCC No.2399。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的抗β-淀粉樣多肽抗體的可變區(qū)序列及其編碼序列。本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行多輪篩選富集具有Aβ特異性的噬菌體，通過(guò)對(duì)其培養(yǎng)制備噬菌體抗體，并且鑒定獲得陽(yáng)性克隆。然后在大腸桿菌中表達(dá)獲得可溶性的抗Aβ scFv片段，通過(guò)測(cè)序獲得其相應(yīng)的編碼序列。因此，本發(fā)明提供了新的抗Aβ scFv片段及其編碼序列。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101538329SQ20081010229
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2008年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者平 梁 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所