專利名稱：：抗體可變區(qū)的糖基化的制作方法抗體可變區(qū)的糖基化本發(fā)明涉及純化抗體分子制劑，其特征是其中重鏈可變區(qū)(VH)中至少一個抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。更具體說，所提供的純化抗體分子能特異性識別P-A4肽/A(34并在重鏈可變區(qū)(VH)中包含糖基化。本發(fā)明具體涉及包含在重鏈可變區(qū)中有糖基化天冬酰胺(Asn)的一個或兩個糖基化抗原結合位點的抗體混合物、即重鏈可變區(qū)(VH)中含有糖基化Asn的抗體同種型的混合物。也公開了包含特定糖基化抗體同種型的組合物或抗體制劑。而且提供了這些抗體的藥學和診斷性用途。所述抗體同種型可用于(例如)藥學干預淀粉樣蛋白形成或淀粉樣蛋白斑形成和/或其診斷性用途。所有癡呆病例中約70%源于阿爾茨海默病，阿爾茨海默病與對認知至關重要的腦區(qū)和神經環(huán)路的選擇性損傷有關。阿爾茨海默病的特征是神經纖維纏結，特別是在海馬錐體神經元和眾多包含大多數淀粉沉積致密核心和緩和暈圈(defusedhalos)的淀粉樣蛋白斑中發(fā)生的神經纖維纏結。胞外神經炎性斑包含大量優(yōu)勢纖維肽，稱為，淀粉樣蛋白"、"A-P"、"A卩4"、"p-A4，，或"A(3，，；參見Selkoe(1994)、Ann.Rev.CellBiol.10，373-403，Koo(1999)'PNAS96巻，9989-99卯，US4,666,829或Glenner(1984)，BBRC12，1131。這種P淀粉樣蛋白衍生自"阿耳茨海默前體蛋白/p-淀粉樣蛋白前體蛋白"(APP)。APP是膜內在糖蛋白(參見Sisodia(1992)，PNAS，89巻，6075頁)和并被一種質膜蛋白酶a-分泌酶在A(3序列內蛋白酶內切(參見Sisodia(1992)、如上述引文)。而且，其它分泌酶活性，具體說是p-分泌酶和，分泌酶活性引起淀粉樣蛋白-卩(A卩)的胞外釋放、A(3包含氨基酸39(A卩39)、氨基酸40(A卩40)、氨基酸42(A卩42)或氨基酸43(A(343);參見Sinha(1999)，PNAS96,11094-1053;Price(1998)，Science282，1078-1083;WO00/72880或Hardy(1997)，TINS20，154。值得注意的是，A卩具有數種天然產生的形式，其中人形式指上述提及的A卩39、AP40、A|341、A^42和Ap43。最主要的形式A|342具有如下氨基酸序歹U(從N-末端開始)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3)。在A卩41、A|340、A(339中，分別丟失了C-末端氨基酸A、IA和VIA。在Ap43形式中，上述序列(SEQIDNO:3)的C末端還包含一個蘇氨酸殘基。A卩40原纖維成核所需時間明顯長于AJ342纖維成核；參見上述Koo引文和Harper(1997)，Ann.Rev.Biochem,66，385-407。如Wagner(1999)，J.Clin.Invest.104，1239-1332所述，更常見A^42與神經炎性斑相關，認為它在體外更易形成纖維。Jarrett(1993)，Cell93，1055-1058提示A|342在有序非結晶性A(3肽的成核依賴性多聚化中用作"晶種"。修飾的APP加工和/或產生包含蛋白樣沉積物的細胞外斑不僅從阿爾茨海默病病理學中獲知，也從患有其它神經病和/或神經變性疾病的對象中獲知。這些疾病特別包括唐氏綜合征、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、帕金森病、ALS(肌萎縮側索硬化)、庫賈氏病、HIV-相關癡呆和運動神經病。迄今，僅描述過有限的淀粉樣蛋白相關疾病的醫(yī)療干預方案。例如，已討論過膽堿脂酶抑制劑如加蘭他敏、卡巴拉汀(rivastigmine)或多奈哌齊僅對于輕度到中度阿爾茨海默病患者有益。然而，此類藥物的膽堿能作用引起的不良事件也有報道。雖然此類膽堿能增強性治療確能對某些癥狀產生益處，但大多數治療病人未能產生滿意的治療響應。據估計僅在約5%治療病人中發(fā)生顯著的認知提高，很少有證據表明該治療能夠顯著改變此進行性疾病的進程。因此，臨床上急切需要更有效的治療手段，尤其需要那些能夠阻止或延遲疾病進展的治療手段。同樣，近來常用NMDA-受體拮抗劑，如美金剛胺。然而，由于其藥理學活性引起的不良事件也有報道。此外，此類利用NMDA-受體拮抗劑的治療僅僅被認為是對癥治療方法而非改善疾病的方法。同樣也提出了利用免疫調節(jié)的方法治療淀粉樣蛋白相關疾病。WO99/27944公開了包含A(3肽的某部分和運載體分子的偶聯物，其中所述運載體分子應增強免疫應答。WO00/72880提及另一主動免疫方法，其中也使用AP片段誘導免疫應答。WO99/27944或WO01/62801中也提出了使用常規(guī)抗-A(3抗體的被動免疫方法，WO02/46237、WO02/088306和WO02/088307描述了抗Ap某部分的特異性人源化抗體。WO00/77178描述了與水解中P-淀粉樣蛋白采用的過渡狀態(tài)結合的抗體。WO03/070760公開了識別Ap肽上兩個不連續(xù)氨基酸序列的抗體分子。WO03/016466描述了一種人源化抗-AI3抗體，該抗體被修飾以避免其重鏈發(fā)生糖基化，因為Wallick(1988)J.Exp.Med.168，1099-1109已假定抗體可變區(qū)中的糖基化。本發(fā)明的根本技術問題在于提供有效的手段和方法以醫(yī)學控制淀粉樣蛋白疾病，尤其是在需要(相應)醫(yī)療干預的病人中用于減少有害淀粉樣蛋白斑的手段和方法。首先，本發(fā)明提供了一種純化抗體分子，其特征是重鏈可變區(qū)(VH)中至少一個抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。本文提供的本發(fā)明純化抗體或抗體組合物尤其靶向Ap和/或Ap片段。本文提供的純化抗體分子，具體是本發(fā)明抗體組合物或抗體制劑可用于制備藥學或診斷性組合物以治療、改善、預防淀粉樣變和/或淀粉樣斑形成相關性疾病。此類疾病的例子如阿爾茨海默病。本發(fā)明中，驚人地發(fā)現重鏈可變區(qū)中至少一個抗原結合位點包含N-連接的糖基化的純化抗體分子尤其可用于減少淀粉斑。而且，發(fā)現本發(fā)明上下文中所提供的糖基化抗體或抗體組合物特別有用，并通過有效斑結合顯示能夠有效跨越血腦屏障/血腦邊界。本文與現有技術的知識形成鮮明對比，WO03/016466公開了特別工程改造以使重鏈缺少N-糖基化位點的抗體，并指出可變區(qū)中的糖基化對于抗體親和力有消極作用。現有技術中指出所述重鏈可變CDR2區(qū)去糖基化形式的抗-A卩抗體對體外合成和純化的AP肽的親和力明顯較高。因此，本發(fā)明涉及改進的、純化的抗體分子或抗體制劑，尤其是抗A卩4/A卩肽(P淀粉樣蛋白)并在體內非常有效的抗體分子或抗體制劑。本發(fā)明抗體分子/抗體制劑的改進在于提供在至少一個重鏈可變區(qū)，如所述重鏈可變區(qū)的CDR2區(qū)中包含N-糖基化的純化抗體分子。如前所述，這與現有技術如WO03/016466形成對比，WO03/016466指出在A(3抗體中必須避免此類N-糖基化。本發(fā)明抗體分子的例子為免疫球蛋白分子，如IgG分子。IgG的特征在于包含兩條重鏈和兩條輕鏈(如圖14所示)，并且該類分子包含兩個抗原結合位點。所述抗原結合位點包含"可變區(qū)"，其由重鏈(VH)某部分和輕鏈(VL)某部分組成?？乖?結合位點由Vh和VL結構域并列形成。關于抗體分子或免疫球蛋白分子的一般信息也可參見普通教科書，如Abbas的"細胞和分子免疫學"，W.B.SoundersCompany(W.B.森德公司)(2003)。一方面，例如提供本發(fā)明鑒定的一種免疫球蛋白分子時，描述了一個抗原結合位點的相應重鏈可變區(qū)(VH)中含有糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗體。所述抗體在下文中稱為"單糖基化的抗體"；參見圖14。另一方面，提供兩個抗原結合位點的對應重鏈可變區(qū)(VH)中均包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的免疫球蛋白分子。所述抗體分子在下文中稱為"雙糖基化的抗體"，參見圖14?？乖Y合位點的重鏈可變區(qū)(VH)無糖基化的天冬酰胺(Asn)的免疫球蛋白在下文中稱為"未糖基化的抗體"。單糖基化的抗體、雙糖基化的抗體和未糖基化的抗體可包含同樣的氨基酸序列或不同氨基酸序列。因此，術語"抗體"包括抗體分子，尤其是重組產生的抗體分子如免疫球蛋白。然而，如下文所討論的，術語"抗體分子"也包含免疫球蛋白的已知同種型和修飾物，如單鏈抗體或單鏈Fv片段(scAB/scFv)或雙特異性抗體構建物，所述同種型和修飾物的特征是包含至少一個如本文定義的糖基化Vh區(qū)。此類同種型或修飾物的具體例子可為Vh-Vl或Vl-Vh形式的sc(單鏈)抗體，其中所述Vh包含本文所述糖基化。同樣考慮到雙特異性scFV，其形式如VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、Vh-Vl-Vl-Vh，其CDR-2區(qū)域包含本文所述糖基化。本發(fā)明上下文中，使用大寫字母的術語"抗體"(ANTIBODY)是為了更清晰地表述。然而，小寫的術語"抗體"(antibody)也用于本申請上下文中。"ANTIBODY"/"ANTIBOD正S"/"antibody"和"antibodies"可互換使用。單糖基化的抗體和雙糖基化的抗體在上文中稱為"糖基化的抗體同種型"。特征在于重鏈可變區(qū)(VH)中至少一個抗原結合位點包含糖基化天冬酰胺(Asn)的純化抗體分子為單糖基化的抗體，它不含或含有很少的雙糖基化抗體或未糖基化抗體，即是"純化的單糖基化的抗體"。本發(fā)明上下文中雙糖基化抗體不含或含有很少的單糖基化抗體或未糖基化抗體，即是"純化的雙糖基化抗體"。術語"不含或含有很少"指完全不含其它(糖基化)同種型或其它(糖基化)同種型的濃度最多10%、如最多5%、如最多4%、如最多3%、如最多2%、如最多1%、如最多0.5%、如最多0.3%、如最多0.2%。下文和所附實施例將進一步提供此方面的信息。本發(fā)明上下文中，術語"單糖基化的抗體"涉及在單一抗體分子(如免疫球蛋白，如IgG，如lgGl)的一個(VH)-區(qū)域中含有N-糖基化的抗體分子。例如，所述"單糖基化形式"的重鏈的一個可變區(qū)中包含糖基化，如下文所定義的天冬酰胺"Asn52"位置。該"單糖基化的IgGl形式或單糖基化的同種型"也可包含(如本文所示)Fc-部分很保守的糖基化位點的糖基化，如非可變FC-部分的天冬酰胺Asn306。本發(fā)明所意的術語"雙-糖基化的抗體"包括本文定義的兩個重鏈可變區(qū)(Vh)的糖基化。再次，此"雙糖基化的形式"的兩條重鏈可變區(qū)均包含糖基化，具體指下文以及所附實施例所示的天冬酰胺Asn52位點。此"雙糖基化的IgGl形式或雙糖基化的同種型"也可包含(如本文所示)在非可變/恒定Fc-部分很保守的糖基化位點的糖基化，具體如免疫球蛋白的306位。附圖14展示了相應的抗體分子。在本發(fā)明上下文中，將可變區(qū)，如重鏈可變區(qū)(兩個(VH)區(qū))缺乏此類翻譯后修飾的抗體被稱為"未糖基化形式"，它的重鏈可變區(qū)不含糖基化。然而，此"未糖基化形式"仍可在抗體恒定區(qū)(C-區(qū))，如Fc-部分通常很保守的糖基化位點，具體為本文所定義的非可變/恒定Fc-部分的天冬酰胺(Asn)306中包含糖基化，參見SEQIDNO:6。重鏈可變區(qū)(VH)的糖基化天冬酰胺(Asn)可位于互補決定區(qū)2(CDR2區(qū))。所述重鏈可變區(qū)(VH)的糖基化天冬酰胺(Asn)可位于可變區(qū)52位，如下文和SEQIDNo.2所示(或在SEQIDNO:6的52位，也包含本文所述的抗體重鏈的Fc-部分的)?？贵w同種型在抗體分子的恒定/非可變部分，如IgG的Fc-部分，如IgGl的Fc-部分也可包含其它糖基化。Fc-部分的糖基化與很保守的糖基化(位點)有關，其特征是位于重鏈的Asn306位點，參見下列序列QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGTWSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:6)下文同樣描述了該序列，并且指出了CDR、CH-區(qū)、重鏈區(qū)以及兩個N-糖基化位點(N52和N306):QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS|GFTFSSYAMS|WVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKV五尸WCZ)ia7/rC尸PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCI,VKGFYPSDTAW,WFSNG.QP-E腿XK.T.T豐L.P顯腿ELX.SK.L.Ty.區(qū).S跳QQG澄墜S^^^H服XIQ跳SMP巡(SEQIDNO:6)l加框l:CDRl、2、3下劃線:CHI鉸鏈區(qū)雙下劃線:CH2點.下劃.線.;.；1粗體N:N-連接的糖基化位點本發(fā)明抗體的IgG-Fc區(qū)域可為由下列區(qū)域組成的同源二聚體鏈間二硫鍵鉸鏈區(qū)、糖基化的CH2結構域、CH2天冬酰胺306(Asn-306)上攜帶的N連接的寡糖和非共價配對的CH3結構域。Asn-306上糖基化的寡糖為復合雙觸角型，可包含具有可變外臂糖的核心七聚糖結構。寡糖影響或者決定Fc結構和功能(Jefferis(1998)Immuno1Rev.163、50-76)。Jefferis(2002)Immuno1Lett.82(1-2)，57-65和Krapp(2003)JMolBiol.325(5)，979-89討論了效應物功能、特定IgG-Fc的編號/效應物配體相互作用。該保守Fc-位置Asn-306與Kabat-系統(tǒng)的"Asn-297"對應(Kabat(1991)免疫學感興趣的蛋白序列(SequenceofProteinsofImmunologicalInterest),第5版，國立衛(wèi)生研究院公共衛(wèi)生服務中心(PublicHealthService、NationalInstitutesofHealth,馬里蘭州貝塞斯達(BethesdaMD))。示例性重鏈可由下列序列編碼caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccag3cct8C8tctgcaacgtgaatc3caagcccagcaac3cc3aggtggacaagaaagttgagccc3gatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagt3C3agtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgag犯aaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQIDNO:5》所述重鏈也可包含(尤其在重組產生過程中)其它序列，如"前導序列"。對應的例子由下列序列編碼atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcc(后接)caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccag3cctacatctgc8acgtg8atcac肌gccc3gcaac3ccaaggtggac肌gaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca3ggagteic肌gtgcaaggtctcc肌caaagccctccc3gccccc3tcg3g3肌acc3tctccaa3gccaEiagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQIDNO:25)對應的氨基酸序列為MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(后接)QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ畫SLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS麗SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF醇YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:26)上述序列也包含"信號肽"，在宿主細胞如CHO細胞中產生本發(fā)明抗體分子時，所述信號肽在分泌途徑中被宿主信號肽酶酶解切割。或者，所述重鏈可由根據重組產生優(yōu)化的核酸序列編碼，如下列序列所示:1atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtga51ttcstggsgsctgagtgtgagtgaacatga101ctggatttgtgtggcattttctgstaacggtgtccttctgtttgcaggtg151后接tccagtgtcaggtggagctggtggagtctgggggaggcctggtccagcct201ggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggatteaccttcagtag251ctatgccatgagctgggtccgccaggctccaggcaaggggctcgagtggg301tgtccgccataaacgccagcggtacccgcacctactatgcagactccgtg351aagggccgattC3CC3tctccagagacaattccaagaacacgctgt3tct401agcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcga451gsggcssgggg33C3CCC3C33gccct己cggetsegtscgctactttgac501gtgtggggccggtc3ccgtctcctcaggtgagtcctcaca5513cctctctcctgcggccgcagcttg33gtctgaggcagaatcttgtccsg601ggtct3tcggactcttgtgagsstt3ggggctgacagttgatggtgacaa651tttcagggtcagtgactgtctggtttctctgaggtgagac701gtcaccttgaggggtccaggggcttttctgcacaggcagg751tggaacaatgacttgaatggttgattcttgtgtg3C3CCs801sg33ttggcstaatgtctgagttgcccssgggtgstcttsgctagactct851ggggtttttgtcgggtacagcsctsttgtg3ttsct3tgc901tatggactactggggtcssggaacctcagtcsccgtctcc9513tggcctctccaggtctttattttt33CCtttgttatggagttttctgag1001C3ttgcsg3ct33tcttggstatttgccctgagggagccggctgagagaa1051gttgggaaataaatctgtctagggatctcagagcctttaggacagattat1101CtCC3C3tctttgaaaaact33g33tctgtgtgatggtgttggtggagtc1151cctggatgatgggatagggsctttggsggctcatttgagggagstgctaa120133C33七CCtatggctggaggg3t3gttggggctgtagttggagattttca1251gtttttagaatg33gt3tt3gctgc33tacttcaaggaccacctctgtga1301C33CC3tttt3t3C3gt3tCcsggcstaggggagtggggc13513CtttCttt3gatttgtgaggs3tgttcc3cactagattgtttsaasctt1401catttgttggssggsgctgtcttagtgattgagtcaaggg1451ctagcctcggtctC333sgggtagttgctgtctagagaggtctggtggag1501cctgcaaaagtccagctttcagaagtatgtgtatggsata1551ttagaagatgttgctttt3Ctcttaagttggttcctaggaaaaatagtta16013st3Ctgtg3ctttsaa3tgtgagagggttttcaagtactC3ttttttta16513atgtcc3saieitttttgtcaLatcaatttgaggtcttgtttgtgtag33ct1701g3cstt3cttcgaggaatgggagtgaggctctctcatscc1751ctattcagaaCtg3Ctttt3t33gttta333t3ttttt1801agcaatgttgagttgagtca3gatggccgstcsg33ccgg1851aacacctgcagcsgctggc3ggaagcaggtcatgtggcaaggctatttgg1901ggaagggaaa3t3333CC3Ctaggtaaacttgtagctgtggtttgaagaa1951gtggttttgs33cactctgtccsgccccscgtccaggctg2001cscctgggts3tttgcettttttgaggattc20513gccg333ctggagsggtcctcttttaacttattgagttcaaccttttaa2101ttttsgcttgagtagttctagtttccccaaacttaagtttatcgacttct2151aaaatgtattgctcggt3C3gctttctggggcaggccagg2201cctgaccttggctttggggc3gggsgggggctaaggtgaggcaggtggcg2251ccsgcsggtgC3C3CCC33tgcccstg3gcccagacactggacgctgaac2301ctcgcggacagttaagaacccsggggcctctgcgcctgggcccagctctg2351tcccscaccgcggtcscstggcsccscctctcttgcagcctccacc33gg2401gcccstcggtcttccccctggcsccctcctccaagagcacctctgggggc2451acagcggccctgggctgcctggtc3aggsctacttccccgaaccggtgac2501ggtgtcgtggsi3ctc3ggcgccctgaccagcggcgtgcacsccttcccgg2551ctgtcctacagtcctcaggactct3ctccctcagcagcgtggtgaccgtg2601ccctccagcagettgggcscccagacctacatctgcaacg2651gccc3gc3acaccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagg2701gagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctgg3cgcs2751tcccggct3tgc3gccccsgtccsgggcsgcaaggcaggccccgtctgcc2801tcttcacccggagcctctgcccgccccsctcatgctcagggsgsgggtct2851tctggctttttccc3ggctctgggcsggc3caggctaggtgcccct33cc2901csggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgcc33gsgc2951C3tstccgggaggaccctgcccctgaccts3gccc3cccc3001ctctccactccctcsgctcggacaccttctctcctcccsg3051CtCCC33tcttctctctgcsgagcccaaatcttgtgac333101tgcccsccgtgcccsggt33gccagcccaggcctcgccctccagctcsag3151gcgggacaggtgccctagagtsgectgestccagggacaggccccagccg3201ggtgctgacscgtccscctccstctcttcctcagcacctgaactcctggg3251gggsccgtcsgtcttcctcttCCCCCC333acccaaggac3ccctC3tgs3301tctcccgg3cccctgsggtc3C3tgcgtggtggtggacgtgsgccscga33351gsccctgsggtcsagttessctggtscgtggscggcgtggsggtgc3taa3401tgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtgg3451tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtac3501aagtgcaaggtCtCC33Ca3sgccctccc3gcccccatcg3551CtCC333gCCaaaggtggg3cccgtggggtgcgagggccai3601ggccggctcggcccsccctctgccctg3g3gtgaccgctgt3CC33CCtC3651tgtccctscagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccst3701cccgggstgagctgaccaag33ccaiggtc3gcctgacctgcctggtcaaa3751ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc3801ggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct3851tcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg3901aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacac3951gcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatga(SEQIDNO:23)SEQIDNO:23所示"選擇性"蛋白序列包含與第一備選物相同的編碼序列，然而在一些稍有區(qū)別的基因組組成中，包含其它內含子和稍有區(qū)別的"前導序列"/"信號序列"。所述"前導序列"也可包含如上所示(其它)內含子。本領域熟練技術人員通過常規(guī)方法易于推倒出本文所示序列中相應的外顯子/內含子結構。本文所述示例抗體也包含輕鏈，所述輕鏈可包含或具有下述氨基酸序列DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCIXNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:8)其可由下列核酸序列編碼gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc3gcagcaccctgacgctg3gca肌gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:7)。本文所述示例抗體的"輕鏈"也包含在技術生產中尤其有用的"前導序列"。相應序列可為(或可包含于(例如)載體系統(tǒng)中)下列序列atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggg(后接)gatatcgtgctgacecagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagegagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcg加agcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccsatcgggtsactccc3ggag3gtgtcac3g3gc3gg3C3gcaaggacagcacct3C3gcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagc3gact3cgag3a織c肌Eigtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:27)所述序列編碼下列氨基酸序列.-MVLQTQVFISLLLWISGAYG(后接)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:28)或者，所述輕鏈可由根據重組產生優(yōu)化的核酸序列編碼，如下列序列所示:1atggacatgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgttt51cccaggtaagactagcagtttactcagcccagggtgctca101gtactgctttactattcagggsaattctcttacaacatgattaattgtgt151ggacatttgttttt3tgtttccaatctcaggcgccagatgt后接gatstcgtg201ttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccagggg3aagagccac251cctctcctgccgggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggt301accagcagaa3cctggccsggcgcccaggctCCtC3tCt3tggcgcstcc3513gcsgggcc3ctggcgtgcc3gcc3ggttcagtggcagtgggtctgggac4013gscttc3ctCtC3CC3tC3gcagcctggagcctgaagatttcgcgscct4513ttactgtctgcsgstttac3scatgcct3tesegtteggccaagggacc501aaggtggaaatcaaacgtgagtagaattaactttgcggccgcctagac551gtttataigtgggatgstttggatggggatgsggcttca_gga_t3601gaaaagggctgaagtcaagttcagctcctsaaatggatgtgggagcaaac651tttgaagatacccagaggatgaaacagcgcagatcaaaga701ggggcctggagetctgagaactcatccgtgttgsgtttcc751acaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtgggatagcagagttgagt801gagccgtaggctgsgttctctcttttgtctcctssgtttttstg3ct3C3851aaaatcagtagtatgtcctgtaagctgttt901ctgcttgcc3tgtsgstacc3tgtcttgctgaatgatcagaagaggtgtg951sctcttattct3333tttgtcacaaaatgtcaaaatgagagactctgtag1001gaacgagtccttgscsgacagctcaaggggtttttttcctttgtctcstt1051tctacatgaasgt333tttgtttt3tt3t3agagtagaaa1101tacagttgggtttgssictatatgttttaatggccaLcggttttgtaL6Lgscs1151tttggtcctttgttttcccagttattactcgattgtaattttstatcgcc1201tgaaacggtccgcaacctct七Cttt3C33Ctgggtgacct1251cgcggctgtgccsgccstttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtg130133cccccgcggtagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggca1351cagtgataggaacagagccactaatctgaagagaacagagatgtgacaga1401ctscact33tgtgacttattggagatttca1451gc3tttstt3tt3tattccctt3tttt33ttttctattag1501ggaattagaactgctttstccsgtgtt3tstt3s33gctt155133tgt3tsta3tCtttt3g3ggtaa33tct3C3gcc3gc3aaagtcatgg1601ttgsctgasctCtC3Ct333ctcctctsasttatatgtca1651tattaactggataaatttgtgacatgaccttaactggtta1701ggtaggatatttttcttcstaatttagcac1751CCC33t3Ctttaattctgtggtttaactca1801gctactataatCCC3t33ttttgaaaactatttsttagcttttgtgtttg18513CCCttCCCtagccaaaggcggacccttta333ctcttg3190133Ct3Cttt3g3gtc3tt33gttatttsacC3Ctttt33tt3Cttt33331951tgstgtcssttcccttttaactaitt33tttattttaaggggggaaaggct2001gctcatasttctattgtttttcttggt333gaactctcagttttcgtttt2051t3Ct3CCtctgtcacccaagagttggcatctcaacagaggggactttccg2101agaggccatctggcagttgcttssgstcsgaagtgaagtctgccagttcc2151tcccaggcaggtggcccsgscctgttctggtgtggctsaa2201aattgtcccatgtggttaca33CC3tt3g3ccagggtctgatgaattgct2251cagaatatttctggscsccccctggcttaaggccctgtcc2301atacagtaggtttagcttggggasgccatacagaggctaa2351tatcagagtsttcttggaagagacaggagacsgtttctgc2401tcttscctt3tgtgcttgtgttcsgsctccC333cstcaggsgtgtcsgs2451t333ctggtctgaatctctgtctg33gc3tggaactgaaaagaatgtagt2501ttcsgggssg333ggca3tsgaaggaagcctgagaatacggstcwttct2551aaactctgagggggtcggatgscgtggccattctttgcct2601gtttactgcaaggtcagaaagccctcagaatggctgc3sa2651gsgctccsscsg33Ctttsttaaggaataggggg33gct32701agattttaaatacgcttcttggtctccttg2751Ct3t33tt3tctgggataagcatgctgttttctgtctgtcCCt33C3tgC2801cctgtgattatCCgC333C3gggcagaactttgttactta28513SC3CC3tCCtgtttgcttctt七cctcagg33ctgtggctgc3ccstctg2901tcttcaitcttcccgccstctgatgsgcsgttg3d3tctggaactgcctct2951gttgtgtgcctgctgsstasCttCt3tCCC3g3g3ggcc333gtsc3gtg3001gaaggtggst3scgccctcc33tcgggtsactccc3gg3g3gtgtcscsg3051agcaggacagcaaggacagc3cctscagcctcsgcsgcsccctgacgctg3101actaLcgagaataicgcctgcg3151tcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgtt3201ag(SEQ工DNO:24)上述示例性輕鏈"序列"同樣具有稍有不同的基因組結構。"選擇性序列"包含不同的和/或另外的內含子。因此，對描述"重鏈"的實施方式加以必要的變更。本發(fā)明的上下文中，術語"抗體分子"涉及完整免疫球蛋白分子，如IgM、IgD、IgE、IgA或IgG,如IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3或IgG4，以及此類免疫球蛋白分子的某部分，如Fab-片段、Fab，-片段、F(ab)2-片段、嵌合F(ab)2或嵌合Fab，片段、嵌合Fab-片段或分離的V『或CDR-區(qū)(將所述分離的Vh-或CDR-區(qū)整合入或工程改造入相應"框架區(qū)")。術語"抗體分子"也包括包含作為連接于至少一種抗原結合部分/肽如WO00/24782所述肽體的載體的抗體Fc結構域的雙抗體和分子。因此，本文上下文中的術語"重鏈可變區(qū)(vh)"不限于完整免疫球蛋白的可變區(qū)，而且涉及所述重鏈可變區(qū)(vh)的對應部分，如CDR，或單獨或組合的CDR1、2和/或3，或可變區(qū)的對應"框架"。因此，本發(fā)明的抗體分子可以是抗體構建物，該構建物可含有作為抗原結合位點的糖基化重鏈給定可變區(qū)(vh)的CDR或至少一個CDR。如本文所述，使本發(fā)明抗體構建物中所述重鏈可變區(qū)(vh)的所述對應部分糖基化，例如，在抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。重鏈可變區(qū)(vh)"隔離部分"的例子是本文列舉的SEQIDNO:12包含的CDR2區(qū)(或由SEQIDNO:ll所示核酸序列編碼)。而且，術語"抗體分子"涉及修飾的和/或改變的抗體分子，像嵌合、人源化或完全人源化抗體。所述"完全人源化抗體"分子也鑒定和記述為"完全人"抗體?？赏ㄟ^本領域已知方法產生所有此類抗體。例如，通過噬菌體展示技術，可采用體外成熟法產生重組抗體分子，該方法如Knappik(2000)JMolBiol.296(1)，57-86和Rauchenberger(2003)，JBiolChem.278(40)，38194-205所述使用完全人免疫球蛋白y和亞類-l框架(IgGl)。如所附實施例所述，術語抗體涉及如IgG分子和IgGl。該術語也涉及修飾的或改變的單克隆或多克隆抗體，同樣涉及重組的或合成產生/合成的抗體。該術語同樣涉及完整抗體及其抗體片段/部分，如分離的輕鏈和重鏈、Fab、Fab/c、Fv、Fab，和F(ab，)2。術語"抗體分子"也包括抗體衍生物、雙功能抗體和抗體構建物，如單鏈Fvs(scFv)或抗體-融合蛋白。同樣可設想包含糖基化VH結構域的催化和/或蛋白水解抗體，如本文所定義的糖基化VH-CDR。術語"抗體分子"也涉及重組生產的抗體分子/抗體構建物，它們除一種特異性外(如抗A(3/AP)，還可包括其它或更多特異性。此類構建物可包括但不限于"雙特異性"或"三特異性"構建物。本發(fā)明術語"抗體分子"的其它細節(jié)見下。上文指出并考慮到至少一個抗原結合位點，如至少一個本文所述的糖基化的重鏈可變區(qū)中包含本文所定義的糖基化的單鏈抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、二價抗體-構建物、抗體融合蛋白、交叉克隆抗體或合成抗體。例如當生產單鏈抗體時，本文所述的"重鏈可變區(qū)"不限于重鏈本身，還涉及起源于完整抗體重鏈，如完整免疫球蛋白，如IgG的對應部分。此部分可獨自或與對應框架部分一起作為對應的CDR。而且，本文上下文也考慮到免疫球蛋白基因的遺傳變體。如免疫球蛋白重G鏈亞類l(IgGl)的遺傳變體可在CH1結構域中包含Glm(17)或Glm(3)同種異型標記、或在CH3結構域中包含Glm(l)或Glm(非-l)同種異型標記。本文中優(yōu)選使用Gm(17)(z)和Gm(l)(a)同種異型的IgGl。本發(fā)明的抗體分子也包含修飾或突變的抗體，如Fc-受體結合或補體結合增強或削弱的突變IgG。在一個實施方式中，本發(fā)明提供的抗體是完全人源化抗體或"完全人"抗體。因此，本發(fā)明的抗體也包含交叉克隆抗體，即本文所述包含來自一種或多種親本或親和優(yōu)化抗體的不同抗體區(qū)(如CDR-區(qū))的抗體。這些交叉克隆抗體可以是數個不同框架，如IgG-框架，如(人)IgGl-、IgG2a或IgG2b-框架中的抗體。例如，所述抗體框架為哺乳動物如人的框架。輕鏈和重鏈的結構域的總體結構相同，每一結構域含有四個框架區(qū)，其序列相對保守并由三個超變結構域(稱為互補決定區(qū))(CDRl-3)連接。本文所用"人框架區(qū)"涉及與天然產生的人免疫球蛋白框架區(qū)基本相同(約85%或更多，通常90-95%或更多)的框架區(qū)?？贵w的框架區(qū)(如組成性輕鏈和重鏈的框架區(qū)組合)用于排定CDR的位置。CDR主要負責結合抗原表位。值得注意的是，不僅本文所述的交叉克隆抗體可存在于優(yōu)選的(人)抗體框架中，包含本文所述抗體的CDR的抗體分子同樣可被引入免疫球蛋白框架?？蚣軈^(qū)的例子包括IgGl、IgG2a和IgG2b。最優(yōu)選的是人框架和人IgGl框架，如SEQIDNO:6顯示的抗體重鏈。在一個實施方式中，抗體同種型的重鏈可變區(qū)可包含含有下列氨基酸的CDR1:GFTFSSYAMS(SEQIDNO:10)所述CDR1可由下列核酸序列編碼ggatttacctttagcagctatgcgatgagc(SEQIDNO:9)抗體同種型的重鏈可變區(qū)中可包含下列CDR2:AINASGTRTYYADSVKG(SEQIDNO:12)(N:完整重鏈Asn-52的N-連接糖基化位點)所述CDR2可由下列核酸序列編碼gctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggt(SEQIDNO:11)依照本發(fā)明在所述CDR2區(qū)中發(fā)生N-糖基化，位于重鏈可變區(qū)的對應Asn52位點，所述可交區(qū)(Vh)由SEQIDNO:1所示核酸分子編碼并具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列。而且，抗體同種型的重鏈可變區(qū)可包含含有下列氨基酸序列的CDR3:GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQIDNO:14)所述CDR3可由下列核酸序列編碼ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt(SEQIDNO:13)抗體同種型可包含輕(L)鏈，其特征為下列CDR:CDR1:RASQSVSSSYLA(SEQIDNO:16)agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcg(SEQIDNO:15)CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:18)ggcgcgagcagccgtgcaact(SEQIDNO:17)CDR3:LQIYNMPI(SEQIDNO:20)cttcagatttataatatgcctatt(SEQIDNO:19)抗體同種型的抗體重鏈氨基酸序列，如非可變Fc-部分中很保守的糖基化位點Asn306(對應于Kabat-系統(tǒng)中的"Asn297"(Kabat(1991)免疫學感興趣的蛋白序歹ll(SequenceofproteinsofImmunologicalInterest),第5版，馬里蘭州貝塞斯達國家醫(yī)學圖書館國立生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine))中可包含其它潛在糖基化位點(如本領域所知的含有Asn-X-Ser/Thr基序)，所述重鏈為或包含上文提供的SEQIDNO:5編碼的序列，即SEQIDNO:6。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體同種型的特征為至少一個抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)中包含糖基化的天冬酰胺(Asn)，所述VH由下列序列編碼(a)包含如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的核酸分子CAGGTGGAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQIDNO:1);(b)編碼含有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核酸分子OVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:2;粗體"N"代表本文所定義的重鏈可變區(qū)52位的Asn);(c)與核酸分子(a)或(b)雜交并編碼能夠與下列(3-A4肽/Ap4氨基酸序列或包含至少15個氨基酸的它的片段結合的多肽的核酸分子DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);(d)與核酸分子(a)或(b)雜交并編碼能夠與下列卩-A4肽/A(34氨基酸序列中至少兩個區(qū)域或與包含至少15個氨基酸的SEQIDNO:3片段的至少兩個區(qū)域結合的多肽的核酸分子DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3)。其中所述P-A4肽Ap4的兩個區(qū)域或其所述片段包含SEQIDNo.3的3-6位和18-26位氨基酸；或(e)簡并至(a)-(d)中任一項定義的核酸序列的核酸序列。本領域技術人員了解本文所用術語"與核酸分子(a)或(b)雜交并編碼能夠與(3-A4肽/Ap4上至少兩個區(qū)域結合的多肽的核酸分子"涉及雙鏈核酸分子的編碼鏈，其中非編碼鏈與上述核酸分子(a)和(b)雜交。如上所述，含有本文定義Asn-糖基化的純化抗體分子可鑒定和表述為重鏈包含含糖基化的可變區(qū)的抗體分子，所述重鏈選自(a)SEQIDNO:5、23或25所示核酸分子編碼的重鏈多肽；(b)含有SEQIDNO:6或26所示氨基酸序列的重鏈多肽；(c)核酸分子編碼的重鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能與下列氨基酸序列所示(3-A4肽/Ap4或包含至少15個氨基酸的它的片段結合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);或(d)核酸分子編碼的重鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能與下列氨基酸序列所示P-A4肽/A卩4上至少兩個區(qū)域或包含至少15個氨基酸的SEQIDNO.3片段的至少兩個區(qū)域結合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);其中所述(3-A4肽A卩4上兩個區(qū)域或其所述片段包含3-6位和18-26位氨基酸。上述鑒定的抗體(如本文的示例性抗體)也可包含具有下列氨基酸序列的L-鏈DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL麗FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:22)或由(例如)下列核酸序歹lj編碼的L鏈gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO21)如上所述，重鏈含有本文所定義Asn-糖基化的純化抗體分子還可包含選自包含下組的輕鏈(a)SEQIDNO:7、21、24或27所示核酸分子編碼的輕鏈多肽；(b)具有SEQIDNO:8、22或28a所示氨基酸序列的輕鏈多肽；(c)核酸分子編碼的輕鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能與下列氨基酸序列所示(5-A4肽/A卩4或包含至少15個氨基酸的它的片段結合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);或(d)核酸分子編碼的輕鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能與下列氨基酸序列所示P-A4肽/AP4上至少兩個區(qū)域或包含至少15個氨基酸的SEQIDNO.3片段的至少兩個區(qū)域結合的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);本文中提及核酸序列/DNA序列時所用術語"雜交"可涉及嚴謹或非嚴謹條件下的雜交。如無進一步說明，優(yōu)選非嚴謹條件。所述雜交條件可根據已有實驗方法確定，例如Sambrook,Russell《分子克隆，實驗室手冊》(MolecularCloning,ALaboratoryManual),冷泉港實驗室，紐約(ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.)(2001);Ausubel，《新編分子生物學實驗指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),紐約的格林出版協(xié)會和維利科學公司(GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience、N.Y.)(1989))，或Higgins和Hames(編)，《核酸雜交，實踐方法》(Nucleicacidhybridization,apracticalapproach),IRL牛津出版社，華盛頓特區(qū)(IRLPressOxford,WashingtonDC)(1985)。條件的設定為本領域技術人員熟練掌握，并可根據領域所述實驗方法確定。因此，僅特異性雜交序列的檢測通常需要嚴謹的雜交和洗滌條件，如O.lxSSC，0.1%SDS，65°C。用于檢測同源或非精確互補序列的非嚴謹雜交條件可設定為6xSSC，1%SDS,65°C。眾所周知，探針的長度及所檢測核酸的組成構成了雜交條件的另一些參數。注意可通過加入和/或置換雜交實驗中用于抑制背景的另選封閉試劑來改變上述條件。典型的封閉試劑包括鄧氏(Denhardt，s)試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA和所有市售制劑。由于兼容性問題，可能需要加入特定封閉試劑來修飾上述雜交條件。雜交核酸分子也包含上述分子的片段。此片段可代表編碼本文定義的非功能性抗體分子或其非功能性片段或CDR的核酸序列，并且長度至少為12個核苷酸，優(yōu)選至少15個，更優(yōu)選至少18個，更優(yōu)選至少21個，更優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少40個，最優(yōu)選至少60個。而且，與上述任一核酸分子雜交的核酸分子也包括這些分子的互補片段、衍生物和等位基因變體。此外，雜交復合物指兩個核酸序列依靠互補的G、C和A、T堿基氫鍵形成的復合物；堿基堆疊相互作用可進一步穩(wěn)定這些氫鍵。兩個互補核酸序列的氫鍵為反向平行構象。雜交復合物可在溶液中形成(如Cot或Rot分析)或在一條溶液中的核酸序列和另一條固化于固體支持物(如膜、濾器、芯片、插腳或如固定細胞的載玻片)的核酸序列之間形成。術語互補或互補性指在允許的鹽和溫度條件下多核苷酸通過堿基配對自然結合。例如，序列"A-G-T"與互補序列"T-C-A"結合。兩個單鏈分子的互補可為僅有部分核酸結合的"部分"互補，或為單鏈分子間全部互補的完全互補。核酸鏈間的互補程度顯著影響核酸鏈間的雜交效率和長度。當進行依賴于核酸鏈間結合的擴增反應時，這點尤其重要。術語"雜交序列"優(yōu)選指與上述編碼抗體分子的核酸序列序列相同性為至少40%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、特別優(yōu)選至少80%、尤其更優(yōu)選至少90%、尤其更優(yōu)選至少95%以及最優(yōu)選至少97%的序列。而且，術語"雜交序列"尤指編碼與本文上述抗體分子的氨基酸序列序列相同性為至少40%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、尤其優(yōu)選至少80%、尤其更優(yōu)選至少90%、尤其更優(yōu)選至少95%以及最優(yōu)選至少97%的抗體分子的序列。按照本發(fā)明，當出現兩個或多個核酸或氨基酸序列時，術語"相同"或"相同性百分數"指利用本領域熟知序列比較算法、或人工比對或視覺檢視在比較窗口或指定區(qū)域上比較和比對最大對應性時，兩個或多個序列或亞序列相同、或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同(如60%或65%相同，優(yōu)選70-95%相同，更優(yōu)選至少95%相同)。例如序列相同性為60%-95%或更高時認為是二序列基本相同。此定義也應用于測試序列的互補鏈。優(yōu)選在至少長約15-25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域，更優(yōu)選在至少長約50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上存在所述的相同性。本領域技術人員知道如何判斷序列間的相同性百分數，例如采用本領域熟知的基于CLUSTALW計算機程序的算法(ThompsonNucl.AcidsRes.2(1994)，4673-4680)或基于FASTDB的算法(BrutlagComp.App.Biosci.6(1990)，237-245)。盡管FASTDB算法通常不考慮序列內部非匹配刪除或加入，即缺口，但在計算中，可人工糾錯以避免高估相同性％。然而，CLUSTALW不將序列缺口計入相同性計算中。本領域技術人員也可使用BLAST和BLAST2.0算法(Altschul，Nucl.AcidsRes.25(1997)，3389-3402;Altschul，J,Mol.Evol.36(1993);290-300;Altschul,J,Mol.Biol.215(1990)，403-410)。核酸序列BLASTN程序使用默認字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5、N=4，并進行雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認字長(W)為3，期望值(E)為10。BLOSUM62評分矩陣(HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.，USA，89(1989)，10915)使用比對值(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N:4并進行雙鏈比較。而且，本發(fā)明也涉及核酸分子，與上述雜交分子相比其序列是簡并序列。本發(fā)明所用術語"由于遺傳密碼而成為簡并性"意味著由于遺傳代碼的冗余，同一氨基酸可由不同核苷酸序列編碼。為了檢測在給定抗體序列中的氨基酸殘基或核苷酸殘基是否對應SEQIDNO:1、5、23和25中的任一氨基酸序列或核苷酸序列的特定位置，技術人員可使用本領域中熟知的手段和方法(如比對法)，通過人工途徑或使用計算機程序途徑，例如下文提及的與"雜交"和同源程度的定義有關的途徑確定。例如，可使用代表基礎本地比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchToolBLAST)的BLAST2.0(Altschu1(1997)，同上；Altschu1(1993)，同上；Altschu1(1990)，同上)搜索本地序列比對。如上文討論的BLAST能夠比對核苷酸和氨基酸序列以確定序列相似性。因為比對的局部屬性，BLAST在確定精確配對或識別相似序列時尤其有用。BLAST算法輸出的基本單位是高分節(jié)段對(High-scoringSegmentPair)(HSP)。HSP由兩個任意等長的序列片段組成，其比對是局部最大的，該比對評分達到或超過用戶設定的域值或截止評分。BLAST方法是為了在査詢序列和數據庫序列間尋找HSP，評價任何找到的配對的統(tǒng)計學顯著性，并僅報告道那些滿足用戶選擇的顯著性域值的配對。參數E確立了報告數據庫序列配對的統(tǒng)計學顯著性域值。E可解釋為在整個數據庫搜索的環(huán)境中，所期望的HSP(或一組HSP)出現頻率的上限。程序輸出報告任何滿足E的配對的數據庫序列。使用BLAST的類似計算機技術(Altschu1(1997)，同上；Altschu1(1993)，同上和Altschu1(1990)，同上)在核苷酸數據庫，如GenBank或EMBL中搜索相同的或相關的分子。該分析明顯快于基于膜的多重雜交。此外，可更改計算機搜索的靈敏度以確定任何特定配對是否歸類為精確或相似。搜索的基礎是產物評分，其定義如下%序列相同性x"/。最大BLAST分數100考慮了兩序列間的相似程度以及序列配對的長度。例如，產物評分為40時，配對精確到有1-2%的誤差；若為70，配對則為精確。選擇產物評分在15-40間的分子以鑒定相似的分子，盡管更低的分數可能鑒定相關分子。本領域內所知能夠產生序列比對的程序的例子是CLUSTALW計算機程序(Thompson，Nucl.AcidsRes.2(1994)，4673-4680)或FASTDB(BrutlagComp.App.Biosci.6(1990)，237-245)。在一個實施方式中，本發(fā)明提供糖基化的抗體同種型，其中位于Vh區(qū)的Asn糖基化選自(a)雙觸角復合物型無核心巖藻糖化的糖結構；(b)雙觸角雜合型的糖結構；(c)雙觸角寡甘露糖型的糖結構；和(d)附圖5或27提供的任意結構的雙觸角結構。在本發(fā)明抗體的一個實施方式中，對應糖結構不包含核心巖藻糖化。對應的N-糖基化可主要由雙觸角復合物型無核心巖藻糖化的糖結構075%;主要80-90%)組成，并且高達80%以上觸角高度唾液酸化。少數糖結構分別屬于雙觸角雜合子和寡甘露糖型(^25%)，也參見附圖5和27?？勺儏^(qū)的糖基化結構不被來自蛋白質(氨基酸多肽)的N-糖苷酶F切割(氨基酸多肽)。在一個實施方式中，通過以下方法進一步鑒定主要的復合物雙觸角糖結構-含有連接于一個或另一個或兩個觸角的一個或兩個唾液酸。唾液酸是N-乙酰基神經氨酸類型，最可能以a-2,3連接結合于末端p1,4連接的半乳糖。-缺少核心巖藻糖化，即在糖鏈的還原性末端缺少通過a-l—6連接連接于最核心的N-乙酰葡糖胺的巖藻糖殘基。在一個實施方式中，通過以下方法進一步鑒定雜合糖結構-含有復合型觸角(連接于核心糖結構的乳糖胺單位(GlcNAc-Gal))作為雙觸角結構的一個臂。該臂主要包含連接于末端P-l，4連接半乳糖的N-乙酰基神經氨酸。-含有連接于核心糖結構的1-3個其它甘露糖亞基作為其它觸角。-缺少核心巖藻糖化，即在糖鏈的還原性末端缺少通過a-l—6連接連接于最核心的N-乙酰葡糖胺的巖藻糖殘基。在一個實施方式中，通過以下方法進一步鑒定寡甘露糖型糖結構-在完整的糖結構里含有4個(Man4—GlcNAc2)、5個(Man5—GlcNAc2)或6個(Man6—GlcNAc2)甘露糖亞基，即典型N-連接的核心糖結構中存在3個分支甘露糖亞基。-缺少核心巖藻糖化，即在糖鏈的還原性末端缺少通過a-l—6連接連接于最核心的N-乙酰葡糖胺的巖藻糖殘基。在本發(fā)明另一實施方式中，提供了一種組合物，包含特征是在重鏈可變區(qū)(VH)的一個抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗體分子，和特征是在重鏈可變區(qū)(VH)的兩個抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗體分子，亦即包含單糖基化抗體和雙糖基化抗體的組合物，下文中稱作抗體組合物。術語抗體組合物也涉及包含含有至少一個本文所述糖基化VH區(qū)或至少一個所述Vh區(qū)的糖基化CDR的分子的組合物，其中所述分子可為上述免疫球蛋白或免疫球蛋白同種型和修飾物。例如，所述組合物也可包含單鏈抗體(scFvs)或含有糖基化Vh衍生CDR區(qū)的雙特異性分子。在下文提供本發(fā)明抗體組合物的其它定義?？贵w組合物不含或僅含極少量的"Vh未糖基化"的抗體分子，即可變區(qū)，具體為重鏈可變區(qū)(vh)不含本文定義的糖基化的抗體。在本發(fā)明的上下文中，尤其在本文所提供的抗體混合物中，術語"不含或僅含極少量的未糖基化的抗體分子"意為抗體組合物包含本文所述未糖基化同種型少于10%,如少于5%，如少于4%，如少于3%，如少于2%，如少于1%，如少于0.5%或更少。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含單糖基化和/或雙糖基化抗體(糖基化位于重鏈可變區(qū))但不含可變區(qū)無糖基化的抗體分子的抗體制劑。再次，術語"不含可變區(qū)無糖基化的抗體分子"涉及其中本文所述未糖基化同種型的含量至多為10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%，例如至多為4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%的抗體制劑/抗體混合物/抗體庫。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了不含有多于0.5%可變區(qū)未糖基化(，例如重鏈可變區(qū)未糖基化)的抗體同種型的組合物。如上文指出，在本發(fā)明的實施方式中，提供了單糖基化抗體和雙糖基化抗體，如免疫球蛋白的混合物，所述混合物不含可變區(qū)無糖基化的抗體分子。在本發(fā)明中將可變區(qū)如兩個重鏈可變區(qū)(兩個(vh)-區(qū))不含此類翻譯后修飾的抗體稱為"未糖基化形式"，它在重鏈的可變區(qū)中不含糖基化。然而，該"未糖基化形式"仍可包含抗體恒定區(qū)(C-區(qū))的糖基化，例如，最常見位于Fc-部分的高度保守的糖基化位點，具體為本文所定義的在非可變/恒定Fc-部分的天冬酰胺(Asn)306。單獨的糖基化抗體同種型或單糖基化和雙糖基化同種型的混合物是治療阿爾茨海默病(AD)及其它淀粉樣蛋白相關疾病如唐氏綜合征、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、帕金森病，ALS(肌萎縮側索硬化h庫賈氏病，HIV-相關癡呆和運動神經病中非常有用且有利的治療性抗體制劑。單獨的糖基化抗體同種型或單糖基化和雙糖基化同種型的混合物也是獨特的診斷工具。本文所述兩種糖基化同種型在體內的腦穿透性改善且高效。一種AD相關的淀粉樣變小鼠模型PS2APP小鼠顯示了有效的大腦穿透性和對P淀粉斑的特異性結合。而且，體外免疫組織化學染色檢測到提高了對真人P淀粉斑的特異性并顯著降低了非特異性黏性。如所附實施例所述，人(3淀粉斑一致性染色(consistentstaining)的最小有效濃度測定為10ng/ml。如所附實施例所述，不同糖基化抗體如免疫球蛋白的分離及表征揭示了重鏈可變區(qū)的糖基化對于抗原結合AP肽、診斷價值、藥理學特性及功能活性有著驚人的影響。可對純化抗體分子進行MS-分析、與可溶性AJ3結合的結合研究(Biacore)和表位作圖(Pepspot分析)、聚集的AP的解離以及體內外結合卩淀粉斑的顯微術分析。在本發(fā)明的一個實施方式中，純化抗體或抗體組合物能夠特異性識別P-A4肽/A卩4。如本文所述，在一個具體的實施方式中，純化抗體或抗體組合物涉及能夠特異性識別AP/AP4兩個區(qū)域(N-末端區(qū)域和中央/中間部分)的抗體或抗體組合物。本發(fā)明所用術語"特異性識別"指能夠與本文所定義的(3-A4的兩個區(qū)域中每一區(qū)域至少兩個氨基酸特異性作用和/或結合的抗體分子。所述術語涉及抗體分子的特異性，即涉及其區(qū)分本文所定義P-A4肽特定區(qū)域和(3-A4肽的另一不相關區(qū)域或另一非APP-相關蛋白質/肽/(不相關的)測試肽的能力。因此，特異性可通過本領域已知方法和本文所述公開的方法進行檢測。此類方法包括但不限于Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-檢測和肽掃描。此類方法還包括檢測Kd信，如所附實施例所述。肽掃描(pepspot矩陣)常被用于描繪多肽抗原的線性表位圖。在活化纖維素上將肽互相重疊連續(xù)合成多肽的一級序列?？赏ㄟ^常規(guī)發(fā)色法(含有酶或染料，如辣根過氧化物酶或4-氯萘酚或過氧化氫的第二抗體)、化學發(fā)光反應或本領域所知的相似方法對準備測試其檢測或識別特定抗原/表位的能力的抗體對特定肽的識別進行評分。使用化學發(fā)光反應或熒光第二抗體時，反應可定量。當抗體與某組重疊肽反應時，可推斷出該反應必需的最小氨基酸序列；見本發(fā)明提供的說明性實施例。同樣的實驗可揭示反應肽的兩個遠距離簇，表明對抗原性多肽中非連續(xù)即構象表位的識別(Geysen(1986)，Mol.Immunol.23，709-715)。除pepspot實驗外，可進行標準ELISA實驗。如所附實施例所示，小六肽可與蛋白質偶聯并包被到免疫檢測板上，與受試抗體反應?？赏ㄟ^標準發(fā)色進行評分(如辣根過氧化物酶和第二抗體以及四甲基聯苯胺和過氧化氫)。通過光密度(如450nm)對某些孔中的反應進行評分。背景(=陰性反應)一般可為0.1OD，陽性反應一般為10D。這意味著陽性/陰性反應的差異(比率)大于10倍。所附實施例將給出更多細節(jié)。此外，下文中將給出用于檢測特異性和"特異性識別"本文定義(3-A4肽兩個區(qū)域的能力的定量方法。術語"P-A4肽兩個區(qū)域"涉及的兩個區(qū)域與SEQIDNo.3((5-A4肽)N-末端氨基酸3-6和氨基酸18-24的中央/中間表位有關。如所附實施例所述，本文具體提供并舉例的雙糖基化抗體A同種型(見所附實施例)檢測了AP分子的兩個部分，第一部分包含N-末端氨基酸1-10，第二部分包含A(3中央/中間部分氨基酸17-26(如SEQIDNo.3所示)。因此，在本文提供的包含本文所述單糖基化抗體和雙糖基化抗體同種型的抗體混合物中，兩個區(qū)域某種程度上也可放寬至包含氨基酸1-10(或-ll或-12)或其較短部分和氨基酸17-26(或氨基酸16-27)或包含氨基酸17-26間較短部分，如氨基酸19-26或20-26。本發(fā)明上下文中術語"P-A4肽"涉及上文所述A(339、A(341、Ap43，尤其涉及Ap40和A(342。所附SEQIDNO:3中也描述了Ap42。值得注意的是術語"P-A4肽的兩個區(qū)域"也涉及包含本文所定義(3-A4肽兩個區(qū)域或其部分的"表位"和/或"抗原決定簇"。依照本發(fā)明，在P-A4肽一級結構中(在氨基酸序列水平上)所述(5-A4肽兩個區(qū)域之間間隔了至少一個氨基酸，如至少兩個、三個、四個、五個和六個氨基酸。如本文所示以及所附實施例所記錄，本發(fā)明抗體/抗體分子檢測/作用于和/或結合本文所定義P-A4肽的兩個區(qū)域，其中所述兩個區(qū)域間隔(在氨基酸序列一級結構水平上)至少一個氨基酸，其中間隔所述兩個區(qū)域/"表位"的序列可包含多于七個、八個、十個甚至約十四個氨基酸。術語"(5-A4肽兩個區(qū)域"也涉及由所述兩個區(qū)域或其部分組成的構象表位或不連續(xù)表位；參見Geysen(1986)，同上。在本發(fā)明的上下文中，通過在一級序列中隔開、但當多肽折疊為天然蛋白時在表面集中的兩個或多個離散氨基酸序列確定的構象表位(Sela，(1969)Science166，1365和Laver，(1990)Cel，161，553-6)?？紤]到本發(fā)明的抗體分子與由本文所述(3-A4兩個區(qū)域或下文公開的其部分組成或包含所述區(qū)域或部分的構象表位特異性結合和互相作用。認為本發(fā)明"抗體分子"對(a)含有(5-A4(SEQIDNO.3)氨基酸1-11(或其部分)的氨基酸臂以及(b)含有P-A4(SEQIDNO.3)氨基酸16-27(或其部分)的氨基酸臂具有同時和獨立的雙重特異性。這些臂的片段或部分包含至少兩個，大多數情況下至少三個氨基酸?？贵w分子，如免疫球蛋白等可在以下三種系統(tǒng)中進行表達a)含有愛波斯坦-巴爾病毒核抗原的瞬轉的人胚腎細胞(HEK293EBNA，英杰公司(Invitrogen))，b)瞬轉的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)以及c)穩(wěn)轉CHO細胞系(CHOKl和CHOKlSV，龍雜生物公司(LonzaBiologics))。利用特定的純化步驟可以分離三種不同的抗體分子(未糖基化、單糖基化或雙糖基化的抗體分子)，包括如下詳述的蛋白A純化、陽離子交換色譜以及大小排阻柱分離。在本發(fā)明的一個實施方式中，在(如)CHO細胞或HEK293細胞、優(yōu)選CHO細胞中重組產生抗體分子。在一個具體的實施方式中，在CHO細胞中表達后可獲得上述鑒定的糖基化模式。CHO細胞在本領域內為人熟知，包括實驗部分中使用的CHO細胞，如CHOK1或CH0K1SV細胞。常用的HEK293細胞是HEK293EBNA。如實施例所述在真核表達系統(tǒng)尤其在CHO細胞中重組表達糖基化的發(fā)明抗體。然而，也考慮到其它表達細胞即真核細胞。真核細胞包括(如)真菌或動物細胞。合適真菌細胞的例子是酵母細胞，如酵母屬、釀酒酵母種。合適的動物細胞如昆蟲細胞、脊椎動物細胞，如哺乳動物細胞，如NSO、MDCK、U2-0SHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。也考慮到人細胞系。這些宿主細胞如CHO細胞提供對本發(fā)明抗體分子的翻譯后修飾，包括前導肽或信號肽序列的移除、H(重)和L(輕)鏈的折疊和組裝，最重要的是在分子正確位點的糖基化，即在重鏈可變區(qū)的糖基化。如在CHO細胞中，在重組生產過程的分泌過程中，此類信號肽或前導序列被宿主的信號肽酶酶切。其它本領域所知合適的細胞系可獲自細胞系倉庫，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)。依照本發(fā)明，還考慮到原代細胞/細胞培養(yǎng)物可用作宿主細胞。所述細胞具體衍生自昆蟲(如果蠅或蜚蠊類昆蟲)或哺乳動物(如人、豬、小鼠或大鼠)。所述宿主細胞也可包含來自和/或衍生自細胞系如神經母細胞瘤細胞系的細胞。因此，通過重組表達系統(tǒng)制備本發(fā)明的抗體分子。此類系統(tǒng)的一個例子(如上所述)是使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的哺乳動物表達系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可與谷胺酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)一起使用(WO87/04462;WO89/01036;Bebbington，1992，Biotechnology(紐約)，10，169-75)。該系統(tǒng)包括用編碼GS酶的基因和所需抗體基因轉染CHO細胞。利用無谷氨酰胺培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇CHO細胞，并使用甲硫氨酸亞氨基代砜(MSX)抑制GS酶。為了生存，該細胞將增加GS酶表達并伴隨表達mAb。另一種可能的表達系統(tǒng)是CHOdhfr系統(tǒng)，其中CHO細胞為二氫葉酸還原酶(dhfr-)缺陷型，并且依賴胸苷和次黃嘌呤才能生長。利用抗體和dhfr基因轉染親本(parenteral)CHOdhfr-細胞系從而能夠選擇dhfr+表型的CHO細胞轉化子。在缺乏胸苷和次黃嘌呤的條件下進行選擇。使用甲氨蝶呤(MTX)可使抗體基因的表達升高。該藥物是dhfr酶的直接抑制劑，以便分離在此條件下足以生存的擴增dhfr基因拷貝數及抗體基因的抗性集落?？赏ㄟ^包括以下步驟的方法制備純化抗體分子，如免疫球蛋白(a)在哺乳動物細胞，如CHO或HEK293細胞中重組表達編碼如上所述抗體分子的異源核酸分子；和(b)通過包括以下步驟的方法純化所述重組表達的抗體分子(bl)蛋白A柱純化；(b2)離子交換柱純化，如陽離子交換色譜；以及，任選(b3)大小排阻柱純化。純化實驗方案還可包括其它步驟，如其它濃縮步驟如滲濾，或分析步驟，如使用分析柱。該方法/步驟還可包括病毒滅活步驟和/或病毒去除步驟，如過濾/納米過濾。同樣考慮到可行的是重復特定步驟(如可進行兩步離子交換色譜)或省去某些步驟(如大小排阻柱色譜)。蛋白A是一組能夠與大多數IgGl同種型Fc區(qū)域結合的特異性配體。它由某些金黃色葡萄球菌(&";;^/00"^flw"w)菌株合成并可從中分離，并與色譜珠偶聯?？少彽脭捣N類型的凝膠制劑。可使用的蛋白A柱的例子是MabSelect(商標)柱。理想的，使用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA平衡該柱，并將細胞培養(yǎng)物上清上柱。利用1MTris/HClpH7.2洗柱，用100mM乙酸pH3.2洗脫抗體。陽離子交換色譜則利用固定相中帶正電的基團和處于流動相中樣品的相互作用。當使用弱陽離子交換柱(如CMToy叩earl65(f)時，進行如下色譜步驟用100mM乙酸pH4預平衡后，將蛋白A洗脫液上柱，用100mM乙酸pH4洗滌，250mM乙酸鈉(pH7.8-8.5)和500mM乙酸鈉(pH7.8-8.5)洗脫抗體并分餾。第一步時，正常洗脫雙糖基化同種型組分和單糖基化同種型組分的混合物，使用第二步則正常洗脫未糖基化同種型組分。當使用強陽離子交換柱(如SPToy叩earl650)時，利用鹽的步驟洗脫抗體用50mM乙酸pH5.0預平衡后，蛋白A洗脫液上柱并使用50mM乙酸和210mM氯化鈉以pH4進行第一步洗脫。第二個洗脫步驟使用50mM乙酸和350mM氯化鈉。通過第一個鹽步驟正常洗脫雙糖基化同種型組分和單糖基化同種型組分的混合物，通過第二個鹽步驟正常洗脫未糖基化同種型。此外，也可從強陽離子交換柱(如SP-Sepharos^)通過鹽梯度來洗脫抗體預平衡、上柱并在pH4.5洗柱后，使用50mMMESpH5.8-至50mMMES/lM氯化鈉pH5.8的鹽梯度。通常，雙糖基化同種型、單糖基化的同種型和未糖基化同種型組分分別被洗脫。接著可收集雙糖基化同種型組分和單糖基化同種型組分，形成產物庫和/或所需的抗體混合物。進一步純化雙糖基化抗體分子和單糖基化抗體分子的混合物如免疫球蛋白可使用大小排阻色譜。有用柱子的例子是Superdex200柱。運行緩沖液的例子包括組氨酸/氯化鈉，如10mM組氨酸/125mM氯化鈉/pH6和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。流過模式的陰離子交換色譜后接濃縮/滲濾步驟是另一種純化步驟。Q861^1"036@是陰離子交換步驟樹脂的例子。例如，用37.5mMTris/HClpH7.9三倍稀釋SP色譜洗脫液并通過25mMTris/83mM乙酸鈉預平衡的Q-Sepharose柱。收集流出液并調節(jié)至pH5.5，利用如Hydrosart30kD⑧膜超濾濃縮。接下來用10體積的20mM組氨酸/HClpH5.5滲濾濃縮液。上述純化方案也可還包含另一步驟(c)分析色譜步驟，如使用Mono-SHR5/5柱。然而，也考慮到其它步驟如滲濾來濃縮抗體分子。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了包含本文所述抗體分子或上文所述方法制備的抗體分子的組合物、抗體制劑或抗體庫。在本發(fā)明的這個實施方式中，所述組合物包含單糖基化或雙糖基化抗體。在另一實施方式中，所述組合物包含單糖基化或雙糖基化(在重鏈可變區(qū))抗體并且所述組合物衍生自可變區(qū)缺少糖基化的抗體分子。在本實施方式的上下文中，術語"抗體庫"涉及單糖基化或雙糖基化(在重鏈可變區(qū))抗體的混合物，這些抗體可單獨分離并混合成一種混合物。本文所提供抗體混合物或抗體庫可包含50%單糖基化的抗體和50%雙糖基化的抗體(如本文定義)。然而，也考慮了比率為30/70至70/30。然而，本領域熟練技術人員明白本發(fā)明抗體混合物中也能采用其它比率。例如，本發(fā)明上下文中也可使用10/90或90/10、20/80或80/20以及40/60或60/40。如實施例所述，本文抗體混合物包含本文所定義的雙糖基化和單糖基化的抗體的尤其有用的比率為40/60-至45/55。本文提供的組合物在診斷或藥物組合物中尤其有用。因此，本發(fā)明提供包含下述成分的診斷或藥物組合物(a)包含一個具有糖基化Asn的抗原結合位點的上述抗體分子；(b)包含兩個具有糖基化Asn的抗原結合位點的上述抗體分子；或者，最優(yōu)選(c)抗體分子(a)與(b)的混合物。本文提供的包含一個具有糖基化Asn的抗原結合位點的抗體分子以及兩個具有糖基化Asn的抗原結合位點的抗體分子的混合物缺少未糖基化(涉及重鏈可變區(qū))的同種型。如上文指出，術語"缺少未糖基化(涉及重鏈可變區(qū))的同種型"涉及混合物/抗體庫/抗體制劑，所述混合物中重鏈可變區(qū)未糖基化的抗體種類少于5%、4%、3%、2%、1%、甚至少于0.5%。如實施例所述，所述混合物/抗體庫/抗體制劑可能幾乎不包含(少于0.5%)未糖基化的同種型。使用本領域已知方法容易測定給定抗體組合物中給定糖基化同種型(如本文所述，重鏈可變區(qū)的糖基化，見附圖14)的百分數和/或數量，這些方法包括但不限于質譜、SDS-PAGE分析、離子交換、HPLL、ELISA等。如所附實施例所示，本發(fā)明抗體對真阿爾茨海默病卩淀粉斑進行特異、靈敏的免疫修飾通過使用AD病人腦組織的冰凍切片進行免疫組化染色實驗得以證明。利用來自AP免疫接種病人的人抗AP抗體同樣顯示了對腦切片的P淀粉斑有效染色(Hock，2002，NatureMedicine,8，1270-1275)。此外，在荷載人|3淀粉斑的轉基因動物模型上也顯示了免疫修飾(Richards，2003，J.Neuroscience，23，8989-9003)。在類似的動物模型上證明這種斑結合導致其清除并最終引起疾病相關癥狀的改善，討論了Fc-依賴過程的參與(Bard、2000，NatureMedicine,6，916-919;Wilcock，2003，NeurobiologyDisease,15，11-20;Wilcock，2004，J.Neuroscience,24,6144-6151)。而且，有報道稱抗-A(3抗體與p淀粉斑的有效結合與疾病進展減緩有關(Hock，2002，NatureMedicine,8，1270-1275;Hock，2003，Neuron,38，547-554)。這個發(fā)現以及人腦組織的尸檢分析表明小膠質細胞的吞噬作用參與了人體斑清除機制(Nicoll,2003，NatureMedicine,9，448-452)。因此本發(fā)明抗體或包含于藥物組合物的特定抗體是人IgGl，IgGl主要負責人體中FcR依賴的過程。本發(fā)明抗體/混合物有效免疫修飾(3淀粉斑表明藥物能夠在人體中有效引起被動免疫以清除存在的P淀粉斑并防止(3淀粉斑的形成。此外，抗體優(yōu)選可透過血腦屏障到達其目的地。對于大分子如人IgG而言，該過程顯著減少，因此CSF中僅能達到約0.1-0.2%血漿抗體濃度。斑清除的機制還是一個存在爭議的話題，A卩肽的外周效應可能參與其中(Dodart，2002，NatureNeuroscience,5:452-457)。因此，產生的治療性抗體或本發(fā)明相應的單糖基化和雙糖基化(重鏈可變區(qū))的混合物對于體外無需Fc-依賴過程參與的A卩多聚體解聚以及與CSF中可溶性A|3單體和寡聚體結合同樣具有價值，因為中和可溶性單體AP肽或寡聚AP肽(如聚集中間體)同樣也可有利于整體的淀粉樣變的減輕(Du，2003，Brain，126:1-5)。本發(fā)明組合物可以固體或液體形式給藥，可為粉末、片劑、溶液或氣溶膠等形式。所述組合物可包含一種或多種本發(fā)明的抗體/抗體分子，最優(yōu)選本文提供的單糖基化和雙糖基化抗體的混合物。所述藥物組合物優(yōu)選任選地包含藥學上可接受的運載體和/或稀釋劑。本文公開的藥物組合物對于治療神經病和/或神經變性疾病尤其有用。所述疾病包括但不限于阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化(ALS)、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、唐氏綜合征、HIV-癡呆、帕金森病和衰老相關性神經元疾病。可考慮將本發(fā)明藥物組合物用作淀粉斑形成的有效抑制劑或淀粉斑解聚的有效刺激劑。因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明化合物的藥物組合物，用于治療淀粉樣蛋白形成疾病/失調。術語"淀粉樣蛋白形成疾病/失調"包括淀粉樣纖維的形成或沉積和/或病理性APP蛋白水解相關或引起的任何疾病。淀粉樣蛋白形成疾病的示例包括但不限于阿爾茨海默病(AD)、唐氏綜合征、Lewy體形成相關性癡呆、帕金森病癡呆、輕度認知損傷、大腦淀粉樣蛋白血管病和血管性癡呆。不同的淀粉樣蛋白形成疾病定義為或特征是淀粉樣蛋白沉積物的多肽組分的特性。例如，(3淀粉樣蛋白的特征是在阿爾茨海默病對象中發(fā)現淀粉樣蛋白沉積。合適的藥學運載體、賦形劑和/或稀釋劑的例子為本領域所熟知，包括磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、各種類型的濕潤劑、消毒溶液等。利用已知常規(guī)方法可配制包含此類運載體的組合物。合適的運載體可包含與抗A(3特異性結合試劑或抗體聯用時，保留對AP的高度親和結合性，并不與對象免疫系統(tǒng)反應的任何材料，包括賦形劑、表面活性劑、增強劑等；參見《雷明頓藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences)(1980)16版，Osol，A.編。這些藥物組合物可以合適劑量給予對象?？赏ㄟ^不同方式給予合適組合物，如胃腸道外、皮下、腹膜內、外用、支氣管內、肺內和鼻內給藥，并且，如需局部治療，可進行損傷內給藥。胃腸道外給藥包括腹膜內、肌肉內、皮內、皮下、靜脈內或動脈內給藥。尤其優(yōu)選的給藥方式是注射和/或遞送至腦動脈的某部位或直接遞送至腦組織。本發(fā)明組合物也可直接給予靶位點，如通過生物射彈遞送至外部或內部靶位點，如腦。將所需純度的抗體與任意生理上可接受的運載體、賦形劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液和/或張力劑混合制備包含本文所述糖基化抗體的藥物組合物。在所使用的劑量和濃度下，可接受的運載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑沒有毒性，并且包含緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和檸檬酸；防腐劑(如乙醇、芐醇、苯酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、殺藻胺或其組合)；氨基酸如精氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸和其組合物；單糖、二糖和其它糖；低分子量(少于約IO個殘基)的多肽；蛋白質，如明膠或血清白蛋白；螯合劑如EDTA;糖如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(所謂"甲葡胺")、半乳糖胺和神經氨酸；和/或非離子表面活性劑，如吐溫、Brij普朗尼克、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。藥物組合物可為液體形式、凍干形式或凍干形式重建的液體形式，其中在給藥前用無菌溶液重建凍干制劑。重建凍干組合物的標準步驟是將一定體積的純水(通常與凍干中去除的水等量)加回，然而含有抗菌藥的溶液也可用于生產胃腸道外給藥的藥物組合物；參見Chen(1992)DrugDevIndPharm18，1311-54。藥物組合物中示例性的抗體濃度范圍可為約1mg/mL-200mg/ml或約50mg/mL-200mg/mL、或約150mg/mL-200mg/mL。明確起見，需要強調的是本文標明的濃度是液體中的濃度或自固體形式精確重建的液體中的濃度?？贵w的水性制劑可在pH-緩沖液中制備，如pH范圍約4.0-7.0，或約5.0-6.0、或約5.5。pH在該范圍內的合適緩沖液的例子包括磷酸鹽、組氨酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽緩沖液和其它有機酸緩沖液。根據緩沖液和所需制劑張力，緩沖液濃度可為約1mM-100mM、或約5mM-50mM。抗體制劑可包含張力劑以調節(jié)制劑的張力。示例性的張力劑包括氯化鈉、氯化鉀、甘油和來自氨基酸組的任何組分、糖及它們的組合。盡管高滲或低滲溶液可可能合適，但優(yōu)選等張的水性制劑。術語"等張的"指與其它溶液相比該溶液具有相同的張力，如生理鹽溶液和血清。張力劑的用量可以是約5mM-350mM，尤其是105mM-305nM。也可在抗體制劑中加入表面活性劑以減少制劑抗體的聚集和/或最大程度減少制劑中形成的顆粒和/或降低吸附性。表面活性劑的示范性例子包括聚氧乙基山梨聚糖脂肪酸酯(吐溫)、聚氧乙烯垸基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(Poloxamer)、普朗尼克(Pluronic))和十二垸基硫酸鈉(SDS)。優(yōu)選的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨酯20(商標吐溫20tm)和聚山梨酷80(商標吐溫80)。優(yōu)選的聚乙烯-聚丙烯共聚物是商標為普朗尼克⑧F68或泊洛沙姆188TM的物質。優(yōu)選的聚氧乙烯烷基醚是商標為BrijTM的物質。表面活性劑的示例性濃度范圍可以是約0.001%-l%w/v。也可加入凍干保護劑(ly叩rotectant)對抗凍干過程中的不穩(wěn)定條件以保護不穩(wěn)定活性成分(如蛋白質)。例如，已知的凍干保護劑包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)、多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。凍干保護劑用量通常為約10mM-500nM。在一個實施方式中，該制劑包含上述物質(即糖基化的抗體、表面活性劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和/或張力劑)，基本不含一種或多種防腐劑，如乙醇、芐醇、苯酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、殺藻胺或其組合。在另一實施方式中，制劑中可包含防腐劑，如濃度范圍為約0.001-2。/。(w/v)的防腐劑。在一個實施方式中，本發(fā)明抗體制劑為適合腸道外給藥的液體或凍干制劑，可包含-約1-200mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物；-約0.001-1%至少一種表面活性劑；-約1-100mM緩沖劑；-任選約10-500mM穩(wěn)定劑和/或約5-305mM張力劑；-pH約4.0-7.0。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的胃腸道外制劑為含有以下組分的液體或凍干制劑-約1-200mg/mL本文所述糖基化的抗體或抗體組合物，-0.04%吐溫20w/v、-20mML-組氨酸，-250mM蔗糖，-pH5.5。在更優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明胃腸道外制劑也可包括含有以下組分的凍干制劑-15mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，誦0.04%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM蔗糖，-pH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，誦0.04%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-2501!1^1蔗糖，陽pH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM蔗糖，-pH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.04%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250111]^海藻糖，-PH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM海藻糖，-pH5.5在另一更優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明胃腸道外制劑也可包括含有以下組分的液體制劑-7.5mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.022%吐溫20w/v，-120mML-組氨酸，-250125mM蔗糖，-pH5,5;或者-37.5mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-10mML-組氨酸，-125mM蔗糖，-pH5.5;或者-37.5mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.01%吐溫20w/v，-10mML-組氨酸，-125mM蔗糖，-pH5.5;或者-37.5mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-10mML-組氨酸，-125mM海藻糖，-pH5.5;或者-37.5mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.01%吐溫20w/v，-10mML-組氨酸，-125mM海藻糖，-pH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM海藻糖，-pH5.5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM甘露醇，-pH5,5;或者-75mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-140mM氯化鈉，-pH5.5;或者-150mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM海藻糖，-pH5.5。或者-150mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-2501!1]^甘露醇，隱pH5.5?；蛘?150mg/mL本文所述的糖基化抗體或抗體組合物，-0.02%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-140mM氯化鈉，-pH5.5。或者-10mg/mLAj3抗體，-0.01%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-140mM氯化鈉，-pH5.5。在一個實施方式中，本發(fā)明藥物組合物為包含下列組分的液體制劑:-10mg/mLAp抗體，-0.01%吐溫20w/v、-20mML-組氨酸，-140mM氯化鈉，-pH5.5。在另一個實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物為包含下列組分的凍干制劑-75mg/mLA卩抗體，-0.04%吐溫20w/v，-20mML-組氨酸，-250mM蔗糖，-pH5.5。在示例性制劑的上下文中術語"本文所述的糖基化抗體"可包括本發(fā)明所述的單糖基化的抗體、本文所述的雙糖基化抗體及其混合物。主治醫(yī)師和臨床因素決定給藥方案。如醫(yī)學領域所熟知，任一病人的給藥方案取決于很多因素，包括；病人大小、體表面積、年齡、所給具體化合物、性別、給藥時間和方式、總體健康狀況和同時給予的其它藥物。蛋白質性質的藥物活性物質的給藥量為每劑量1ng-20mg/kg體重，例如0.1mg-10mg/kg體重、0.5mg-5mg/kg體重；然而，也考慮到低于或高于此示例范圍的劑量，特別是考慮到上述因素時。若方案為連續(xù)輸注，每分鐘給藥量應在1mg/kg體重的范圍內。本文所述藥物組合物可配制為短效型、速釋型、長效型或緩釋型制劑。因此，該藥物組合物可適于緩釋或控釋。利用本領域熟知方法制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括包含抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，其中所述基質為塑形制品形式如薄膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解型乙烯-乙酸乙烯酯、水凝膠、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚_1>(_)_3_羥基丁酸。通過使用合適的添加劑、控制水分含量、開發(fā)特異性聚合物基質組合物可防止緩釋制劑中所含抗體可能發(fā)生的生物學活性損失和免疫原性改變。定期評估監(jiān)測該過程?？删植炕蛉斫o予該組合物，即本發(fā)明的單糖基化抗體或雙糖基化抗體或其混合物。值得注意的是，外周給藥的抗體可進入中樞神經系統(tǒng)，參見Bard(2000)，NatureMed.6，916-919等。胃腸道外給藥制劑包含水性和非水性無菌溶液、懸液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射有機酯如油酸乙酯。水性運載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格右旋糖溶液、右旋糖和氯化鈉、乳糖化林格注射液、或不揮發(fā)油。靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充物、電解質補充物(如基于林格右旋糖溶液的補充物)等。也可存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。而且，根據藥物組合物的計劃用途，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其它物質。所述物質可為作用于中樞神經系統(tǒng)的藥物，如神經保護因子、膽堿酶抑制劑、Ml蕈堿樣受體激動劑、激素、抗氧化劑、炎癥抑制劑等。尤其優(yōu)選的是，所述藥物組合物中包含其它物質如神經遞質和/或神經遞質替代分子、維生素E或a硫辛酸。本領域技術人員，具體說但不限于生化學家、生物學家、化學家、藥師和上述專業(yè)人員組成的小組，不難工作產生上述藥物組合物。醫(yī)學領域技術人員，如主治醫(yī)師也清楚如何將此類藥物組合物給予需要本文所述藥物組合物治療的病人。此類給藥可包含全身給藥，如通過輸注和/或注射給藥。然而，也考慮到將本發(fā)明化合物和/或化合物混合物直接給予腦。例如，該化合物或化合物混合物或化合物制劑可經腦室內或鞘內注射直接給予腦，優(yōu)選通過緩慢輸注以減少對腦實質的影響。也可使用腦內緩慢植入。也考慮到使用基因治療的方法，例如植入產生本發(fā)明所述抗體的重組細胞。這些"重組細胞"應該能夠提供本文所定義的可變區(qū)糖基化/本文所述抗體，尤其是本發(fā)明的抗-A卩抗體的某部分。然而，如上文所指出的，本發(fā)明抗體/抗體組合物的優(yōu)點在于它們能夠通過血腦屏障并與淀粉斑結合。下文所述的本發(fā)明藥物組合物可用于治療迄今未知的或者關于或依賴病理APP聚集或病理APP加工的所有疾病類型。它們在治療阿爾茨海默病或胞外P淀粉樣蛋白沉積似乎起一定作用的其它疾病中尤其有用。它們宜用于人，但本文所述方法、應用及組合物也可用于動物治療。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，上述本發(fā)明組合物為診斷性組合物，還任選包含合適的檢測手段。診斷性組合物包含上述本發(fā)明化合物，即本文所述糖基化抗體中的至少一種。所述診斷性組合物可包含本發(fā)明化合物，尤其是本發(fā)明的糖基化抗體分子、可溶形式/液相，但也考慮到所述化合物結合于/附連于和/或連接于固體支持物。固體支持物可與本文所述的診斷性組合物聯用，或者可將本發(fā)明化合物可直接結合于所述固體支持物上。此類支持物為本領域所熟知，包括市售柱材料、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝基纖維素條、膜、薄片、duracytes、反應容器的孔和壁、塑料管等。本發(fā)明化合物，尤其是本發(fā)明的抗體，可結合于許多不同的運載體。熟知的運載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龍、直鏈淀粉、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。根據本發(fā)明的目的，運載體特性可為可溶性或不溶性。上面鑒定了合適的標記和標記方法，下文中作進一步描述。適合固定/固化本發(fā)明化合物的方法為人熟知，包括但不限于離子、疏水、共價相互作用等。尤其優(yōu)選將本發(fā)明的診斷性組合物用于檢測和/或定量測定APP和/或APP-加工產物，如P淀粉樣蛋白，或用于檢測和/或定量測定病理性和/或(遺傳)修飾的APP切割位點。如所附實施例所示，本發(fā)明糖基化抗體分子尤其可用作以直接免疫熒光法檢測阿爾茨海默病病人腦切片中真正人淀粉斑的診斷試劑。優(yōu)選在診斷性組合物中使用的所述本發(fā)明化合物是可檢測標記的。利用本領域熟練技術人員所知且屬于本發(fā)明范圍內的數種技術標記生物分子。本領域一般技術人員了解數種不同標記和標記方法?？捎糜诒景l(fā)明的標記類型的例子包括酶、放射性同位素、膠體金屬、熒光化合物、化學發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。常用標記包括熒光染料(如熒光素、羅丹明和得克薩斯紅等)、酶(如辣根過氧化物酶、卩-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶)、放射性同位素(如"P或1251)、生物素、地高辛、膠體金屬、化學或生物發(fā)光化合物(如二氧雜環(huán)丁垸(dioxetane)、發(fā)光胺或吖啶镥)等。標記過程，如酶或生物素基團的共價偶聯、碘化、磷酸化、生物素化等為本領域所熟知。檢測方法包括但不限于放射自顯影、熒光顯微術、直接和間接酶反應等。常用檢測方法包括放射性同位素或非放射性同位素方法。這些方法包括Western印跡、覆蓋(overlay)實驗、RIA(放射性免疫實驗)和IMA(免疫放射性免疫測定實驗)、EIA(酶免疫實驗)、ELISA(酶連免疫吸附實驗)、FIA(熒光免疫實驗)和CLIA(化學發(fā)光免疫實驗)。而且，本發(fā)明提供了本發(fā)明糖基化抗體分子、或本發(fā)明方法生產的抗體分子、或本文提供的單、雙糖基化抗體混合物用于制備預防、治療和/或診斷淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關疾病的藥物或診斷組合物的應用。進一步優(yōu)選的是，本文所述化合物，特別是本發(fā)明抗體分子用于預防和/或治療與改變或異常的APP加工和/或淀粉樣蛋白形成有關的神經病的應用。將抗體分子，如(工程改造的)免疫球蛋白形式，如IgG框架、特別是IgGl框架中的抗體，或嵌合抗體形式(尤其是完全人源化抗體或完整抗體)、雙特異性抗體、單鏈Fv(scFv)或雙特異性scFv等用于制備本文所述藥物組合物。然而，本文所提供的抗體分子和混合物也可用于診斷，如所附實施例所述，因為本發(fā)明抗體分子能特異性作用于或檢測A(34和/或淀粉樣蛋白沉積/斑。因此，本發(fā)明化合物的發(fā)明用途是用于制備治療需要改善的神經病的藥物組合物的用途，例如通過分解P淀粉斑、清除淀粉樣蛋白(斑)或對抗卩淀粉斑形成的被動免疫來改善該疾病。如所附實施例所示，本發(fā)明抗體分子在阻止AP聚集和已形成淀粉樣蛋白聚集的解聚中尤其有用。因此，本文所述的本發(fā)明糖基化抗體或單、雙糖基化抗體混合物可用于減少淀粉樣沉積物/斑，清除淀粉斑/斑前體以及保護神經元。尤其考慮到將本發(fā)明抗體分子用于防止體內形成淀粉斑以及體內清除已存在的淀粉斑/沉積物。而且，本發(fā)明抗體分子或混合物可用于對A(3肽和AP聚集體即(3淀粉斑產生被動免疫。醫(yī)學使用包含Fc-部分的本發(fā)明抗體可達到清除A|34/AP4沉積物的目的。所述抗體的Fc-部分在Fc-受體介導的免疫應答，例如吸引巨噬細胞(吞噬細胞和/或小膠質細胞)和/或助細胞中尤其有用。介導Fc-部分相關的免疫應答時，本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選位于(人)IgGl框架中。如本文所討論，優(yōu)選使用本發(fā)明抗體分子或抗體混合物治療的對象為人對象。也考慮到其它框架，如lgG2a-或IgG2b-框架可用于本發(fā)明抗體分子。在小鼠中尤其考慮了IgG2a和IgG2b形式的免疫球蛋白框架，例如在本發(fā)明抗體分子的科學應用中，如在表達(人)野生型或突變型APP、APP-片段和/或A(34的轉基因小鼠中的測試。上述淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關疾病的例子包括但不限于癡呆、阿爾茨海默病、運動神經病、帕金森病、ALS(肌萎縮側索硬化)、癢病、HIV-相關癡呆癡呆以及庫賈氏病、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、唐氏綜合征和衰老相關性神經元疾病。本發(fā)明抗體分子及本文提供的組合物也可用于改善和/或防止與淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關的炎癥過程。因此，本發(fā)明也提供了治療、預防和/或延遲神經病和/或神經變性疾病的方法，其包括給予患有所述神經病和/或神經變性疾病的對象和/或給予神經病和/或神經變性疾病易患個體有效量的抗A卩抗體分子或本文提供的本發(fā)明單、雙糖基化A-P抗體的混合物和/或上文定義的組合物的步驟。本文提供的治療可包括單獨給予本發(fā)明化合物/組合物或以共同治療的形式給藥，即與其它藥物和醫(yī)藥品聯合給藥。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方式中，提供了治療、預防和/或延遲神經病和/或神經變性疾病的方法，包括給予需要相應醫(yī)療干預的患者本文所提供的包含單、雙糖基化抗A(3抗體的抗體混合物的步驟。本文所用術語"治療"考慮給予需要的患者本文所述單、雙糖基化抗體(或其混合物)。所述患者可為人患者，在一個實施方式中為患有或易患病理APP加工相關性疾病的人。因此，本文所用術語"治療"包括預防性和治療性給予本文提供的化合物或化合物混合物?？捎帽疚奶峁┗衔锖徒M合物治療的一種疾病是阿爾茨海默病。根據國立神經和語言障礙、中風/阿爾茨海默病和相關疾病協(xié)會的診斷標準(NINCDS/ADRDA標準)(Mckhann等，1984)，可能診斷有阿爾茨海默病的病人。在本發(fā)明的上下文中也可考慮到"共同治療"情況下使用本文提供的化合物和/或組合物，例如當治療APP相關疾病，如阿爾茨海默病時。在所述情況下，考慮到與其它批準藥物如美金剛胺、多奈哌齊、酒石酸卡巴拉汀或加蘭他敏共同治療。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了包含至少一種本文定義的糖基化抗體分子或本文提供的本發(fā)明單和/或雙糖基化方法的混合物的試劑盒。方便地，本發(fā)明試劑盒還任選包括緩沖液、儲存液和/或醫(yī)學、科學或診斷實驗或目的所需的其它試劑和材料。而且，本發(fā)明試劑盒的一部分可單獨包裝于小瓶或瓶中，或者組合包裝于容器或多容器單元中。本發(fā)明試劑盒宜用于進行本發(fā)明方法，并可用于本文引用的數種應用，如用作診斷試劑盒、研究工具或醫(yī)學工具。此外，本發(fā)明試劑盒可包括適合科學、醫(yī)學和/或診斷目的的檢測手段。優(yōu)選依照本領域熟練人員所知的標準步驟生產試劑盒。圖示圖l:重鏈和輕鏈序列插入位點的質粒圖圖2:分析色譜圖例圖3:文中所述的CMT柱色譜圖。雙糖基化和單糖基化同種型在雙峰l中洗脫，未糖基化同種型在峰2洗脫。圖4:抗體A同種型的完整IgGESI-MS分析。主峰的分子量以Da表示。A:未糖基化的抗體A;B:單糖基化的抗體A;C:雙糖基化的抗體A圖5:抗體N-糖基化模式的推導方案。以括號表示只發(fā)生部分糖基化的結構。A:復合物類型；B:雜合子類型；C:寡聚甘露糖類型；GlcNAC=N-乙?；?葡糖胺、Mai^甘露糖；Ga卜半乳糖；Fuc-巖藻糖；NeuAc二N-乙酰神經氨酸。圖6:MS和HPAEC-PAD分析推斷出的抗體AAsn306糖結構的示意圖。以括號表示只發(fā)生部分糖基化的結構。GlcNA(^N-乙?；?葡糖胺、Mai^甘露糖；Ga卜半乳糖；Fuc-巖藻糖；NeuAc-N-乙酰神經氨酸圖7:抗體A同種型與固化纖維狀A|340結合(Biacore傳感器芯片)?？贵w濃度60nM。顯示了純化前所有同種型混合物的結合曲線。圖8:Pepspot分析抗體A組合物的表位作圖。A)所示單獨重疊的十肽點的pepspot信號。B)單獨重疊十肽點的信號強度的密度分析。圖9:解聚實驗。抗體A組合物和抗體A同種型誘導從聚集的AP中釋放生物素化A|3。圖10:包含抗體A同種型的抗體A組合物從人腦脊液(CSF)中捕獲可溶性AP。平均在2個庫中分析4個阿爾茨海默病人的腦脊液樣品。每庫進行兩次免疫沉淀，然后進行Western印跡分析，并利用Western印跡光密度對捕獲的A(3進行定量。給定系列Western印跡中最高的Ap值定為100%。圖11:體外利用抗體A對人淀粉斑進行間接免疫熒光染色。利用10ng/ml抗體A濃度對真正離體人p淀粉斑染色后，進行高度靈敏和特異的檢測。利用(A)抗體A組合物；(B)雙糖基化的抗體A;(C)單糖基化的抗體A;和(D)未糖基化的抗體A的山羊抗人(H+L)-Cy3抗體檢測結合的抗體A。標尺=80pm。圖12:共聚焦顯微術揭示含有糖基化抗體A同種型的PS2APP轉基因小鼠斑的體內免疫修飾。免疫修飾揭示對小鼠單次給予1mg抗體A同種型3天后抗體A同種型的體內結合。圖中顯示了抗體A同種型分布的代表性圖片，這些同種型包括雙(A)、單(B)和未糖基化的(C)抗體A同種型。標尺=80pm。圖13:抗-A卩抗體與細胞表面APP的結合分析。流式細胞術分析人APP轉染的HEK293細胞和非轉染的對照細胞與抗體的結合。圖14:抗體A非糖基化、單糖基化和雙糖基化抗體分子(免疫球蛋白)的示意圖。圖15:抗體組合物(包含單和雙糖基化抗體A)、雙糖基化的和單糖基化的抗體A同種型(每周20mg/kg，i.v.)或載體治療5個月后，丘腦區(qū)總斑表面積(A)、總斑數目(B)以及斑數目和大小分布(C)。圖16:抗體組合物(包含單和雙糖基化抗體A)、雙糖基化的和單糖基化的抗體A同種型(每周20mg/kg，i.v.)或載體治療5個月后皮層和胼胝體區(qū)總斑表面積(A)、總斑數目(B)以及斑數目和大小分布(C)。圖17:抗體組合物(包含單和雙糖基化抗體A)、雙糖基化的和單糖基化的抗體A同種型(每周20mg/kg，i.v.)或載體治療5個月后海馬區(qū)總斑表面積(A)、總斑數目(B)以及斑數目和大小分布(C)。圖18:抗體組合物(包含單和雙糖基化抗體A)、雙糖基化的和單糖基化的抗體A同種型(每周20mg/kg，i.v.)或載體治療5個月后下腳區(qū)總斑表面積(A)、總斑數目(B)以及斑數目和大小分布(C)。圖19:每兩周1次共1、2和4次經i.v.將0.1mg/kg給予PS2APP小鼠后，測量結合于P淀粉斑的免疫染色抗體A組合物的熒光強度。最后一次注射2周后進行分析。圖20:每月1次共2和3次經i.v.將0.15mg/kg給予PS2APP小鼠后，測量結合于P淀粉斑的免疫染色抗體A組合物的熒光強度。最后一次注射2周后進行分析。圖21:兩周1次共4次經注射將0.05、0.1和0.30mg/kg給予PS2APP小鼠后，測量結合于卩淀粉斑的免疫染色抗體A組合物的熒光強度，表明淀粉斑結合為劑量相關性。最后一次注射2周后進行分析。圖22:兩月1次共3次經注射將0.075、0.15和0.45mg/kg給予PS2APP小鼠后，測量結合于P淀粉斑的免疫染色抗體A組合物的熒光強度，表明淀粉斑結合為劑量相關性。最后一次注射2周后進行分析。圖23:人AD腦切片與所示濃度抗體A組合物及活的分化的人原代巨噬細胞(80萬細胞/毫升)共孵育40小時后，利用抗A卩鼠單克隆抗體(BAP-2)對切片中A(3進行染色。結果顯示淀粉樣蛋白載量減少，表明了抗體A組合物對P淀粉斑的抗原依賴性細胞吞噬作用。標尺=300pm。圖24:將人AD腦切片與80萬細胞/毫升孵育后，抗體A組合物對切片中(3淀粉斑的劑量反應。(A)顯示總斑面積，(B)是染色強度。圖25:用0、0.1、1和10嗎/ml抗體A組合物孵育的P388D1細胞的熒光顯微照片(分別為A-D)。圖26:利用AP偶聯熒光珠及P3881D1細胞定量測定抗體A組合物的劑量反應(表示為相對熒光單位，RFU)。兩次獨立實驗表明抗體A組合物的效能范圍相當大。圖27:顯示重鏈恒定區(qū)(Asn306;前2列)和重鏈可變區(qū)(Asn52;第3、4歹U)中抗體A的不同糖結構的表格。實施例用下列非限定性實施例舉例說明本發(fā)明。實施例l:通過克隆技術產生抗體A根據本發(fā)明，通過常用克隆技術產生IgGl分子。用重鏈可變區(qū)(VH)來鑒定抗體A的編碼序列及表達的氨基酸序列。以下DNA序列編碼相應的重鏈例子caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccc紹acctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccagatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaa3acc3tctccaaagcca肌gggcagccccg3gaaccacaggtgtBcaccctgccccc3tcccggg3tgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQIDNO:5)。其編碼下列免疫球蛋白H鏈SAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF麗YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:6)如下所示包含額外"前導序列"的序列也可編碼同樣的重鏈atgaaacacctgtggttcttcetcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctcc肌gagcacetctgggggcacagcggccctgggctgcctggtca3ggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcac肌gcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacEiaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt3ccgggtggtcagcgtcctc3ccgtcctgcaccagg3CtggctgaatggC3aggagtac肌gtgc肌ggtctccaacaa3gccctcccagcccccatcgag肌aaccatctcc3aagccaa3gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQIDNO:25)對應的氨基酸序列為MKHLWFFIXLVAAPRWVLSINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ畫SLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS濯SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE顧YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:26)類似地，下列核苷酸序列編碼抗體A的輕鏈gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggetctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggata3cgccctcc肌tcgggt3actcccagg3gagtgtcac3gagcaggac3gc肌ggBcagc3cct3CBgcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:7)并編碼下列氨基酸序列(L鏈)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:8)同樣可使用"前導序列"，相應的序列為atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaa加atggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacgga加accctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcac3gagcaggacagC33ggac3gC3cct3cagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctaegcctgcgaagteacccateagggcetgagctcgccegtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:27)該序列編碼下列氨基酸序列MVLQTQVFISLLLWISGAYGGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:28)上述序列與WO03/070760所述的MAB31有區(qū)別。然而，示例性抗體A的重鏈和輕鏈也可由下列序列編碼:a)重鏈atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgattcatggagaaatagagagactgagtgtgagtgaacatgagtgagaaaaactggatttgtgtggcattttctgataacggtgtccttctgtttgcaggtgtccagtgtcaggtggagctggtggagtctgggggaggcctggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatgccatgagctgggtccgccaggctccaggcaaggggctcgagtgggtgtccgccataaacgccagcggtacccgcacctactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggcaaggggaacacccacaagccctacggctacgtacgctactttgacgtgtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtgagtcctcacaacctctctcctgcggccgcagcttgaagtctgaggcagaatcttgtccagggtctatcggactcttgtgagaattaggggctgacagttgatggtgacaatttcagggtcagtgactgtctggtttctctgaggtgagactggaatataggtcaccttgaagactaaagaggggtccaggggcttttctgcacaggcagggaacagaatgtggaacaatgacttgaatggttgattcttgtgtgacaccaagaattggcataatgtctgagttgcccaagggtgatcttagctagactctggggtttttgtcgggtacagaggaaaaacccactattgtgattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggtaagaatggcctctccaggtctttatttttaacctttgttatggagttttctgagcattgcagactaatcttggatatttgccctgagggagccggctgagagaagttgggaaataaatctgtctagggatctcagagcctttaggacagattatctccacatctttgaaaaactaagaatctgtgtgatggtgttggtggagtccctggatgatgggatagggactttggaggctcatttgagggagatgctaaaacaatcctatggctggagggatagttggggctgtagttggagattttcagtttttagaatgaagtattagctgcaatacttcaaggaccacctctgtgacaaccattttatacagtatccaggcatagggacaaaaagtggagtggggcactttctttagatttgtgaggaatgttccacactagattgtttaaaacttcatttgttggaaggagctgtcttagtgattgagtcaagggagaaaggcatctagcctcggtctcaaaagggtagttgctgtctagagaggtctggtggagcctgcaaaagtccagctttcaaaggaacacagaagtatgtgtatggaatattagaagatgttgcttttactcttaagttggttectaggaaaaatagttaaatactgtgactttaaaatgtgagagggttttcaagtactcatttttttaaatgtccaaaatttttgtcaatcaatttgaggtcttgtttgtgtagaactgacattacttaaagtttaaccgaggaatgggagtgaggctctctcataccctattcagaactgacttttaacaataataaattaagtttaaaatatttttaaatgaattgagcaatgttgagttgagtcaagatggccgatcagaaccggaacacctgcagcagctggcaggaagcaggtcatgtggcaaggctatttggggaagggaaaataaaaccactaggtaaacttgtagctgtggtttgaagaagtggttttgaaacactctgtccagccccaccaaaccgaaagtccaggctgagcaaaacaccacctgggtaatttgcatttctaaaataagttgaggattcagccgaaactggagaggtcctcttttaacttattgagttcaaccttttaattttagcttgagtagttctagtttccccaaacttaagtttatcgacttctaaaatgtatttagaattcgagctcggtacagctttctggggcaggccaggcctgaccttggctttggggcagggagggggctaaggtgaggcaggtggcgccagcaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggacgctgaacctcgcgg3cagttaagaacccaggggcctctgcgcctgggccc3gctctgtccc￡ic3ccgcggtcacatggc8ccacctctcttgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaeicgtgaatcacaagcccagc犯caccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggagcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttcccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg3gtac83gtgcaaggtctccaac肌3gccctccc3gcccccatcga^aaacc3tctcc33agcc3aaggtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatg8gctg3ccaagaacc3ggtc8gcctgBcctgcctggtca^ggcttct8tcccagcgac3tcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatga(SEQIDNO:23)b)輕鏈atggacatgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtaaggatggagaacactagcagtttactcagcccagggtgctcagtactgctttactattcagggaaattctcttacaacatgattaattgtgtggacatttgtttttatgtttccaatctcaggcgccagatgtgatatcgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccgggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggcgcccaggctcctcatctatggcgcatccagcagggccactggcgtgccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctggagcctgaagatttcgcgacctattactgtctgcagatttaca3C3tgcctatc3cgttcggcc肌ggg3ccaaggtgg肌8tcaaacgtgagt3gaatttaaactttgcggccgcctagacgtttaagtgggagatttggaggggatgaggaatgaaggaacttcaggatagaaaagggctgaagtcaagttcagctcctaaaatggatgtgggagcaaactttgaagataaactgaatgacccagaggatgaaacagcgcagatcaaagaggggcctggagctctgagaagagaaggagactcatccgtgttgagtttccacaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtgggatagcagagttgagtgagccgtaggctgagttctctcttttgtctcctaagtttttatgactacaaaaatcagtagtatgtcctgaaataatcattaagctgtttgaaagtatgactgcttgccatgtagat8cc3tgtcttgctg3atg3tcag肌gaggtgtgactcttattctaa3atttgtcacaaaatgtc肌肌tgagag3ctctgtaggaacgagtccttgacagacagctcaaggggtttttttcctttgtctcatttctacatgaaagtaaatttgaaatgatcttttttattataagagtagaaatacagttgggtttgaactatatgttttaatggccacggttttgtaagacatttggtcctttgttttcccagttattactcgattgtaattttatatcgccagcaatggactgaaacggtccgcaacctcttctttacaactgggtgacctcgcggctgtgccagccatttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtgaacccccgcggtagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggcacagtgataggaacagagccactaatctgaagagaacagagatgtgacagactacactaatgtgagaaaaacaaggaaagggtgacttattggagatttcagaaataaaatgcatttattattatattcccttattttaattttctattagggaattagaaagggcataaactgctttatccagtgttatattaaaagcttaatgtatataatcttttagaggtaaaatctacagccagcaaaagtcatggtaaatattctttgactgaactctcactaaactcctctaaattatatgtcatattaactggttaaattaatataaatttgtgacatgaccttaactggttaggtaggatatttttcttcatgcaaaaatatgactaataataatttagcacaaaaatatttcccaatactttaattctgtgatagaaaaatgtttaactcagctactataatcccataattttgaaaactatttattagcttttgtgtttgacccttccctagccaaaggcaactatttaaggaccctttaaaactcttgaaactactttagagtcattaagttatttaaccacttttaattactttaaaatgatgtcaattcccttttaactattaatttattttaaggggggaaaggctgctcataattctattgtttttcttggtaaagaactctcagttttegtttttactacctctgtcacccaagagttggcatctcaacagaggggactttccgagaggccatctggcagttgcttaagatcagaagtgaagtctgccagttcctcccaggcaggtggcccagattacagttgacctgttctggtgtggctaaaaattgtcccatgtggttacaaaccattagaccagggtctgatgaattgctcagaatatttctggacacccaaatacagaccctggcttaaggccctgtccatacagtaggtttagcttggctacaccaaaggaagccatacagaggctaatatcagagtattcttggaagagacaggagaaaatgaaagccagtttctgctcttaccttatgtgcttgtgttcagactcccaaacatcaggagtgtcagataaactggtctgaatctctgtctgaagcatggaactgaaaagaatgtagtttcagggaagaaaggcaatagaaggaagcctgagaatacggatcaattctaaactctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcctaaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaagccctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatttagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaactcaaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctccttgctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagggcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgcttctttcctcaggaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttccegecatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQIDNO:24)實施例1.1載體構建抗體A序列來源于初篩合成噬菌體展示文庫MorphoSysHuCAL文庫后的二次成熟。最初在德國MorphoSys的載體pMorph中提供抗體A的DNA，對應于WO03/070760，附件p6/43中圖2所示Fab表達載體。出于本發(fā)明目的的載體構建中，編碼載體pEE6.1和pEE14.4(均購自龍雜生物公司)以在同一載體中獲得含兩條鏈的構建物，參見附圖1;參見WO87/04462或WO89/01036。應用下列方案進行克隆利用引物ACGTAAGCTTGCCGCCACCATGGTGTTGCAG(正義鏈；HindIII;SEQIDNO.29)禾卩引物ACGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTT(反義鏈，EcoRI;SEQIDNO.30)從載體MS-Rocher7.9.H7—Igjc鏈(如WO03/070760所述)PCR分離IgK鏈，插入pCR2.1TopoTA中，并對插入物進行完全測序。HinDIII/EcoR消化pCRTopo2.1從而移出IgK鏈插入物，并將其作為HindlII/EcoRI插入物連接入載體pEE14.4中。禾U用弓I物ACGTAAGCTTGCCGCCACCATGAAACACCTG(正義鏈，HindIII;SEQIDNO:31)和引物ACGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAG(反義鏈，EcoRI;SEQIDNO:32)從載體pMorphMS-Roche#7.9.H7_IgGl中PCR克隆Ig重鏈，插入pCR2.1TopoTA中，并對插入物進行完全測序。HindlII/EcoRI消化pCRTopo2.1從而移出Ig^重鏈插入物，將其作為HindlII/EcoRI插入物連接入載體pEE6.4中。NotI/SalI消化pEE6.4IgGl移出重鏈表達盒，并將分離片段插入SalI/Notl消化的pEE14.4k中得到最終雙基因構建物pEE14.4mAb-31。實施例1.2:轉染CHO細胞并表達抗體A根據標準實驗方法進行轉染。宿主細胞系CHOKl衍生自龍雜生物公司工作細胞庫(WCB)存028-W2(Lonza，2002，1-179),宿主細胞系CHOKlSV衍生自龍雜生物公司主細胞庫(MCB)弁269-M(Lonza，2003，1-87)。利用脂質體轉染(Fugene，羅氏診斷公司)用含有重鏈和K輕鏈基因的載體pEE14.4MAb31轉染衍生自WCB#028-W2的貼壁CHOKl細胞。在DMEM、GS補充物(均來自JRH生物科技公司(JRHBiosciences))、10%透析FCS(PAA實驗室公司(PAALaboratories)，CoS#R0-CEP2001-083-Rev00)和50pM甲硫氨酸砜亞胺(MSX購自西格瑪公司(sigma))存在下選擇轉染分離物。2周后，挑選集落并轉移至96孔培養(yǎng)板，利用ELISA檢測抗體的產生。通過有限連續(xù)稀釋克隆抗體A表達量最高的4個集落，以獲得單細胞衍生的培養(yǎng)物，一周后衍生出82個克隆并進行擴增。選擇其中一個克隆，其貼壁狀態(tài)下有著最高特異性產率48pg/細胞/天。通過有限稀釋進一步亞克隆以獲得具有高穩(wěn)定性的良好抗體生產者(Pu，(1998)MolBiotechnol，10，17-25)。此夕卜，利用電穿孔將載體pEE14.4MAb31轉染至CHOKl細胞的懸浮變體CHOKlSV細胞(來自MCB弁269-M)中。如前所述選擇轉染子，通過有限稀釋對得到的克隆進行單細胞克隆，得到數個抗體A的高產克隆。實施例1.3使抗體A表達克隆適應懸浮培養(yǎng)在含有不同蛋白水解產物的DHI培養(yǎng)基中檢測CH0K1克隆的最佳生長性質細胞最終適應含有/不含谷胺酰胺(英杰公司(Invitrogen))的DHI培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基是DMEM、Ham，sF12和IMDM分別以l:l:2(v:v:v)比例混合的混合物(Schlaeger禾卩Schumpp，1992，JImmunolMethods,146，111-20)，其中有如下改變大豆和稻米水解產物0.2Xsoy/^Pe;"M浙0.2%r/ce7fy尸e;5603(凱瑞生物科技公司(KerryBioscience))、0.03%普朗尼克F68(英杰公司)、25^MMSX(西格瑪公司)和5%透析FCS(PAA實驗室公司)。逐漸降低FCS濃度，直到細胞在無血清DHI培養(yǎng)基中指數生長。用無血清DHI培養(yǎng)基凍存數種重組細胞克隆的原代種子細胞庫。利用兩步過程(Lonza)使CHOKlSV克隆適應從含10%透析FCS的DMEM改變?yōu)樵诤?5pMMSX的化學成分明確的CD-CHO培養(yǎng)基(吉布科-英杰公司(Gibco-Invitrogen))中懸浮生長。在CD-CHO中產生細胞庫。任選地，任何其它供CHO細胞生長的無血清、無蛋白培養(yǎng)基均可用于懸浮培養(yǎng)并作為抗體表達的基礎。實施例2:生產抗體A生產抗體A(通過補料-分批發(fā)酵)利用下述方法從振蕩培養(yǎng)或旋動培養(yǎng)的儲存培養(yǎng)物中發(fā)酵制備CHO克隆在100ml振蕩培養(yǎng)瓶或標稱容積50-75ml的旋瓶中分別用含25pMMSX的各培養(yǎng)基解凍一凍存管的各克隆。以1:5比例連續(xù)分瓶擴增細胞，在振蕩培養(yǎng)瓶或旋瓶得到體積為400-500ml的儲存培養(yǎng)物。用于發(fā)酵接種的細胞可衍生自解凍后至多90天的這些儲存培養(yǎng)物。在2L振蕩培養(yǎng)瓶或旋瓶中，種子列車(seedtrain)由2xl000ml步驟組成，隨后接種于另一個IOL發(fā)酵罐中?；蛘?，10L發(fā)酵罐本身可用作補料-分批發(fā)酵容器或用于接種100L通過補料-分批發(fā)酵罐。培養(yǎng)基中含有MSX作為選擇條件，直到接種10L發(fā)酵罐時除去MSX。發(fā)酵過程第0天從3-4xl0V毫升細胞開始(由種子培養(yǎng)物1:4-1:5分瓶而來)。第2-3天開始補料，細胞密度應高于1.5xl0V毫升。補料每天2%連續(xù)或一次性補料。在整個發(fā)酵過程中，利用離子交換色譜監(jiān)測抗體A同種型組合物(見下)。第14-18天當細胞活力開始下降(50%)并達到預期滴度，則通過離心和/或過濾和過濾除菌收集細胞上清，并按照下一章節(jié)所述進一步處理。按照標準步驟進行發(fā)酵，參見如Werner，(1993)，Arzneimittelforschung，43，1242-9或Rendall，(2003)，第十八屆ESACT會議錄(Proceedingsofthe18thESACTmeeting),2003年5月11-14日，1，701-704)。實施例3:純化抗體A純化過程基于三個色譜步驟和一個滲濾步驟蛋白A親和色譜、陽離子交換色譜、陰離子交換色譜和利用100kD膜進行滲濾。凝膠類型和柱尺寸為11MabSelect(GE保健公司(GEHealthcare),Art.17-5199，柱直徑9cm，床長度18+/-2cm)、0.41CM-Toyopearl650M(托所生物科技公司(TosoBioscience),Art.007972，小離子容量=85微當量/毫升，直徑5.0cm，床長度20+/-2固)、1.31Q-SepharoseFF(GE保健公司，Art.l7-0510-04)、直徑9cm，床長度20+Z-2cm。柱子在室溫下運行。組分儲存于2-8'C。在280nm處進行檢測。使用面積為0.11!12的Biomax100超濾模塊(密立博集團公司，Art.P2B100A01)進行濃縮和滲濾。蛋白A色譜使用純化水制備下列溶液溶液A(平衡緩沖液)25mMTris，25mMNaCl，5mMEDTA，利用HC1調節(jié)至pH7.1+/-0.1溶液B(洗滌緩沖液1):100mM乙酸，用NaOH調節(jié)至pH4.5+A0.1溶液C(洗脫緩沖液)100mM乙酸，用NaOH調節(jié)至pH3.2+/-0.1溶液D(洗滌緩沖液2):100mM乙酸，75mMNaCl，pH3+/-0.1溶液E(再生緩沖液)2M鹽酸胍，100mMTris，用HC1調節(jié)至pH7.5+/-0.1溶液F(儲存緩沖液)200mM芐醇，100mM乙酸，用NaOH調節(jié)至pH5.0+/-0.1首先用3床體積的溶液A平衡柱子。接下來利用澄清的細胞培養(yǎng)物上清裝柱(451，386mg/1抗體)用5床體積的溶液A洗滌，用3床體積的溶液B洗滌，用3.5床體積的溶液C洗脫，并收集洗脫液，用3柱體積的溶液D洗滌，和用2柱體積的溶液E再生，用3床體積的緩沖液A平衡，并且用床體積的緩沖液F洗滌以便儲存。所有色譜步驟均使用100cm/h的線性流速。柱載量為17.4g抗體/lMabselect凝膠，全部同種型混合物的產率為96病毒滅活使用純化水制備下列溶液溶液G(調節(jié)溶液)2M乙酸鈉加入濃乙酸或2M乙酸鈉(溶液G)將蛋白A洗脫液的pH調節(jié)至pH3.5-3.7。攪動15分鐘然后加入214乙酸鈉(溶液0)調節(jié)至？114+/-0.1。陽離子交換色譜使用純化水制備下列溶液溶液H(平衡緩沖液)100mM乙酸，用NaOH調節(jié)至pH4.0+Z-0.1溶液I(洗脫緩沖液1):250mM乙酸鈉，無需調節(jié)pH，pH7.8-8.5溶液J(洗脫緩沖液2):500mM乙酸鈉，無需調節(jié)pH，pH7.8-8.5溶液K(再生溶液)0.5M氫氧化鈉溶液L(儲存緩沖液)0.01M氫氧化鈉首先利用2床體積的溶液K再生柱，然后用5床體積的溶液H平衡。接著用蛋白A洗脫液等份裝柱，并用1床體積的溶液H洗滌。接著用6床體積的溶液I洗脫。此步驟中，雙糖基化和單糖基化同種型被洗脫。在下一步驟中，用3床體積的溶液J洗脫未糖基化同種型。在使用兩床體積的溶液K再生柱后，將柱儲存于該緩沖液中24小時，接著再用2床體積的溶液K洗滌。用3床體積的溶液L洗漆以便存儲。圖3顯示了色譜圖例。如下所述通過分析性IEX分析色譜組分。所有的色譜步驟均使用100cm/h的線性流速。柱載量為14.3g抗體/1CMToyopearl650M，雙糖基化和單糖基化同種型混合物的產率為79%，未糖基化同種型的產率為6.2%。利用O-SepharoseFF進行流過(Flowthrough)色譜使用純化水制備下列溶液溶液M(稀釋緩沖液)37.5mMTris，用乙酸調節(jié)至pH7.9+/-0.1溶液N(調節(jié)溶液)2MTris溶液O(平衡緩沖液)83mM乙酸鈉，25mMTris，pH7.5+/-0.1溶液P(再生緩沖液1):0.5MNaOH/lMNaCl溶液Q(再生緩沖液2):0.2M乙酸/1MNaCl溶液R(儲存緩沖液)O.OlMNaOH首先，利用溶液M1:3稀釋CMT柱(酸性)的洗脫液并用溶液N調節(jié)至pH7.5。首先利用2床體積的溶液O平衡柱，接著將稀釋的CMT柱洗脫液過柱并收集流出液。利用溶液O洗掉柱上的產物直至280nm吸光度低于O.l(收集流出液)。用1.5床的溶液P再生該柱，儲存1小時后再用1.5床體積的溶液P再生該柱。然后再用2床體積的溶液Q再生該柱，用3床體積的溶液R洗滌并儲存。所有的色譜步驟均使用100cm/h的線性流速。柱載量為3.5g抗體/1QSepharoseFF，雙糖基化和單糖基化同種型混合物的產率為91%。滲濾使用純化水制備下列溶液溶液S(滲濾緩沖液)20mM組氨酸，用HCl調節(jié)至pH5.5濾器支架Pellicon2(密立博集團公司)配備有1個型號為BiomaxIOO(密立博集團公司，面積=0.1m2、Art.P2B100A01)的超濾模塊。配有硅樹脂管的WATSON-MARLOW501U泵用于泵吸。用緩沖液O沖洗該系統(tǒng)，然后于4-irC在l小時內將3.8升(1.1g抗體/l)的QS色譜流出液(用濃乙酸調節(jié)至pH5.5)濃縮至250-300ml。接著用31緩沖液S(約為10體積)進行滲濾(V-常量)(4-11°)。最后利用Millipac20濾器(密立博集團公司)對產物進行過濾除菌。超濾/滲濾步驟的產率為91%。產物濃度為15mg/ml。產物凍存于-70°C。用于分析組分的分析性IEX方法柱Mono-SHR5/5(GE保健公司，Art.17-0547-01)緩沖液l:50mM嗎啉代乙磺酸，用氫氧化鈉調節(jié)至pH5.8緩沖液2:50mM嗎啉代乙磺酸，1MNaCl，用氫氧化鈉調節(jié)pH5.8流速1ml/min檢測280nm上樣量36-72p梯度時間％緩沖液20分鐘01025632763280350圖2給出示例性色譜產率<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>實施例4:SDS-PAGE鑒定抗體A同種型依照標準實驗方法使用4-12%NuPage梯度Bis-Tris凝膠(英杰公司)和MARK12(英杰公司)作為對照進行SDS-PAGE分析。每孔上樣l-3^ig蛋白A純化的發(fā)酵物上清液(Prod01、02、03)或旋動培養(yǎng)物上清液(所有其它泳道)。在還原條件下進行分析時，在重鏈分子量范圍內得到峰1的單一條帶(雙糖基化抗體A)、峰2的兩條條帶(單糖基化抗體A)和峰3的單一條帶(未糖基化抗體A)。峰2二條帶的分子量分別對應峰1和峰2的分子量。使用以下數種表達系統(tǒng)得到相似的結果，如HEK293EBNA細胞瞬時轉染、CHO細胞瞬時轉染和CHO細胞穩(wěn)定轉染。實施例5:質譜(MS)分析鑒定抗體A同種型。利用電噴霧電離質譜A(ESI-MS)測定所有抗體A同種型的完整抗體質譜圖。為此，在非還原條件下制備抗體A的樣品。通過G25凝膠過濾使樣品脫鹽至2%甲酸和40%乙腈中，然后在沃特斯公司(Waters)的Q-Tof2或LCT-質譜儀上進行ESI-MS分析。通過分子量分離得到未糖基化抗體A和單糖基化抗體A的分子量差別為1623。從氨基酸序列預測的未糖基化抗體A的分子量為145,987Da，這與實驗測定的分子量145,979Da吻合。相似的，如圖4所示單、雙糖基化抗體同種型分子量差1624Da。所觀察到的分子量的差異與下文進一步詳述的N-糖基化類型相一致。實施例6:抗體A的Asn-52糖基化結構Asn52是重鏈可變部分序列aaa-aaa-Asn-Ala-Ser-aaa-aaa的一部分，其對應N-糖基化共有序列Asn-aaa-Ser/Thr。通過對抗體A同種型進行胰蛋白酶解肽作圖及質譜評估含Asn52的肽HC/T4確認Asn52的N-連接糖基化。在未糖基化抗體A的胰蛋白酶解肽圖中，只出現了質量對應于未糖基化HC/T4肽的肽，表明Asn52未糖基化，而在單、雙糖基化的抗體A中，檢測到質量對應于含N-連接糖結構的HC/T4的肽。為進一步確認在重鏈蛋白酶解肽HC/T4中共有序列的糖基化，從糖基化抗體A同種型的肽圖中分離糖基化HC/T4肽，并在N-糖苷酶F孵育之前和之后進行MALDI-質譜分析。在N-糖苷酶F作用之前，獲得對應包含N-連接糖結構的HC/T4肽的質量。然而，N-糖苷酶F作用的HC/T4肽的質量對應于所需未糖基化HC/T4+lDa的預計質量，正如N-糖苷酶F從天冬酰胺移去糖鏈(Asn-Asp轉換)時的預計質量。在連接于Asn52的糖結構中N-乙酰神經氨酸的出現進一步表明了N-連接復合物和雜合類型糖結構的存在。因此，單用N-糖苷酶F(去除Asn306而非Asn52上的N-糖)處理或與神經酰胺酶聯合處理糖基化抗體A同種型，并在變性、還原和脫鹽分離HC和LC后進行分析。兩種方法處理的HC質量相差約291Da或582Da，對應1或2個唾液酸。由此可知復合物和/或雜合類型的N-連接糖連接于Asn52。Asn-52糖基化(N糖基化)主要由無核心巖藻糖化的雙觸角復合物型糖結構(275%;主要為80-90%)組成，并且高度唾液酸化，以致于高達80%的復合物型觸角包含N-乙酰神經氨酸。少數糖結構分別屬于雙觸角雜合子和寡聚甘露糖型(《25%)(圖5或圖27)。所有Asn52糖基化結構的共性是無法被N-糖苷酶F從完整抗體A上切割下來。實施例7:抗體A的Asn306糖基化結構如上指出，抗體A含有連接于重鏈(HC)Fc-部分的天冬酰胺306(Asn306)的抗體型糖基化，它由復合物雙觸角型寡糖鏈組成。眾所周知，抗體包含此類復合物雙觸角寡糖鏈的不同同種型，其不同之處在于末端半乳糖化、唾液酸化的程度以及核心巖藻糖化的程度。此外己知Fc糖鏈結構缺少核心巖藻糖化的程度對于抗體體內的效能很重要，廣為接受的是核心巖藻糖化程度調節(jié)抗體的效應物功能。對抗體A主體而言，發(fā)現連接于Asn306的Fc糖鏈的抗體典型變化(Routier(1997)，Glyoconjugate14(2)，201-207;Raju(2003)，BioProcessInternational,44-52)與末端半乳糖化和核心巖藻糖化有關。檢測到末端半乳糖基化(GO:Gl:G2結構)程度的異質性為約35-40%G0-結構、約45%Gl-結構和約15-20%G2-結構(參見圖6或圖27的結構示意圖)。缺少核心巖藻糖化，即缺少連接于核心糖結構最內側N-乙酰葡糖胺的巖藻糖單元的Fc-糖結構的含量也許對抗體很重要，因為巖藻糖單元的存在與否可調節(jié)該抗體與效應細胞Fc-受體的結合，從而影響這些細胞的活動。利用下述兩種不同方法檢測抗體A中Asn306缺少核心巖藻糖化的糖鏈同種型的相對含量A)完全糖基化HC的質譜用6M鹽酸胍和250mMTCEP使抗體A變性并還原為輕鏈(LC)和糖基化HC。還原樣品脫鹽到2%甲酸和40%乙腈中，并用于在沃特斯公司的Q-Tof2或LCT-HC質譜儀上進行ESI-MS分析。通過獲取的m/z譜，通過含有所選單一m/z狀態(tài)的單個寡糖同種型的糖基化HC的峰高計算各寡糖同種型相對含量。對于計算缺少核心巖藻糖化的糖結構的相對含量而言，缺少核心巖藻糖的G0結構(GO-Fuc)的峰高與GO+(00^1^)之和相關聯。通過糖基化HC和HC質量差別來區(qū)別各個糖結構，在對照實驗中MS-分析之前，通過與N-糖苷酶F孵育去除HC的寡糖結構。B)HPEAC-PAD色譜分析釋放的寡糖在pH7.2的磷酸鈉緩沖液中孵育抗體A樣品與N-糖苷酶F，以便釋放Asn306上的寡糖鏈(在所使用的條件下，不會從完整非變性抗體釋放Asn52的糖結構)。通過離心過濾分將釋放糖鏈與抗體A蛋白分離開，并在BioLC系統(tǒng)中用來自迪氏公司(Dionex)的CarboPacPA200柱進行分析，使用強堿性(pH13)的乙酸鈉梯度。所用柱能夠將非巖藻糖化的寡糖鏈與巖藻糖化寡糖鏈分離開。通過對CarboPacPA200柱分析的樣品停留時間與合適寡糖標準品的停留時間進行比較，并通過測定MALDI質譜分離和收集的峰的摩爾質量，可將所獲各峰指定到對應的糖結構。為計算缺少核心巖藻糖化糖結構的相對含量，對所有缺少核心巖藻糖的結構的面積％求和。數批雙、單糖基化抗體A同種型混合物和純化抗體A同種型的分析揭示了非巖藻糖化Asn306連接的寡糖鏈的含量分別在~14%-27%(MS測定)和6%-26%(HPAEC-PAD測定)的范圍內。實施例8:利用表面等離振子共振(SPR)在體外測定抗體A組合物和同種型(如本發(fā)明未糖基化、單糖基化或雙糖基化抗體)與Api-40和Api-42纖維結合的KD值表面等離振子共振(SPR)在線測定抗體A與A(3纖維的結合，如下所述測定分子相互作用的親和力利用Biacore2000和Biacore3000儀器進行測量。37'C下在10mM醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中將200pg/ml濃度的合成肽孵育三天，以便在體外產生Api-40和Apl-42纖維。電子顯微鏡確認兩種肽的纖維結構，Apl-40主要顯示為較短纖維(〈l微米)而Apl-42主要顯示較長纖維(>1微米)。假定與無定形聚集物和無結構沉淀的不清楚混合物相比，這些纖維更接近人AD腦中聚集的A(3肽。將纖維1:10稀釋并按照廠商指導手冊所述直接偶聯于CM5(BIA應用手冊(BIAapplicationHandbook),AB版，BiacoreAB，烏普薩拉，1998)。偶聯過程包括活化步驟和固定步驟，在活化步驟中用N-羥基琥珀酰亞胺和鹽酸l-乙基-l-(3-二氨基丙基)-碳二亞胺的水性混合物接觸表面從而將表面的羧基基團轉化成化學反應性琥珀酰亞胺酯基團，在固定過程中，活化表面與溶解于10mM醋酸緩沖液(pH4.5)的纖維接觸達到200-350共振單位(l個共振單位對應的表面載量約為1皮克/mm2)。接著，表面加載纖維與濃度范圍為200nM2C20.15nM的抗體溶液接觸。圖7顯示了監(jiān)測到的結合相(與緩沖液接觸期間)和解離相(隨后與緩沖液接觸期間)的典型的時間依賴反應曲線(=感應譜)。下表中顯示了AJ31-40和A卩l(xiāng)-42纖維與抗體A同種型結合的Kd僮。簡要的，利用Scatchard類型分析計算Kd僮，該分析使用濃度依賴的平衡結合反應?？梢詢煞N方法獲得這些平衡結合常數。由于低抗體濃度下結合過程極慢，所以達到平衡的接觸時間間隔非常長(圖7)。不過，可以在Biacore儀器上實現這種接觸時間間隔，可對實驗平衡反應進行Scatchard分析。也可通過無限外推較短時間依賴性結合曲線來獲取平衡結合數據。這些理論上獲得的平衡結合水平可再次用于測定Kd信。與測定平衡傳感器響應曲線的方式無關，可獨立獲取Scatchard曲線圖。從Scatchard曲線圖可得到第二親和成熟循環(huán)衍生的抗體A同種型更高(二價)和更低(單價)的親和相互作用。這兩種親和力代表如下表所示范圍的較低和狡高的Kd僮7<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>上表顯示經表面等離振子共振檢測，由抗體A同種型和Apl-40纖維相互作用形成的低親和力復合物(單價)和高親和力復合物(二價)的KD值。給出外推平衡反應所得(標記為"外推")和實驗測定平衡反應所得(標記為"實驗")的Kd信。至少測定外推值6次并給出標準差?；趯嶒灪屯馔破胶鈧鞲衅鞣磻腒D在由標準差給定的限度內相等。實施例9:通過Pepspot十肽分析對抗體A組合物及同種型(如本發(fā)明的未糖基化、單糖基化或雙糖基化抗體)進行表位作圖表位(抗原決定簇)可為線性或構象的。本文所述雙表位特異性是抗體與兩種非連續(xù)線性肽的反應性。用于限定特異性表位識別的表位作圖方法是基于使用6肽偶聯物包被微孔板的ELISA技術或基于pepspot技術。后一技術可使用將蛋白質Western印跡到PVDF膜上的已知實驗方法檢測和定量測定抗體。設計應用表位作圖技術以特異性檢測線性表位，但是這些技術不能對空間上更復雜的表位如非連續(xù)或構象表位進行作圖?？蓱糜跇嬒蠡虿贿B續(xù)表位作圖的技術如結構域掃描和組合肽矩陣需要長至36個氨基酸的長肽(結構域)或各自由12個氨基酸組成的肽組合。因此認為所應用的技術為線性表位特異的，不包括不連續(xù)或不連續(xù)散在的構象表位?？傊?，所呈現的數據表明本文所定義的Ap肽內兩個區(qū)域類似獨立線性表位，根據所研究抗體對一種六聚體或十聚體A|3肽的獨特雙表位特異性同時識別。將下列包含A(3(l-42)的氨基酸序列分成含有1個氨基酸移碼的43條重疊十肽。數字指來自Api-40序列的必需氨基酸，為了使抗體最優(yōu)結合十肽上必須存在這些氨基酸。ISEVKM力AEFRHDSGYEVHHQKXVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI"ATVIV(SEQIDNO:4)。因此，DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3)代表A(34/卩-A4肽的氨基酸1-42。供應商(捷瑞尼生物工具公司(JeriniBioTools)，柏林)合成的43條十肽N末端乙?；褻末端共價連接于纖維素片("pepspot")。在震蕩平臺上將纖維素片與封閉緩沖液(50mMTrisHCl，140mMNaCl，5mMNaEDTA，0.05。/。NP40(福祿卡公司(Fluka))，0.25%明膠(西格瑪)、1%牛血清白蛋白片段V(西格瑪)，pH7.4)中的單克隆抗體(1pg/ml)孵育2小時。在震蕩平臺上用TBS(IOmMTris.HCl，150mMNaCl，pH7.5)洗滌纖維片三次，各三分鐘。然后將纖維片壓在濾紙上，用陰極緩沖液(25mMTris堿，40mM6-氨基己酸，0.01%SDS，20%甲醇)潤濕，轉移至半干印跡架，有肽的一側面朝向等尺寸的PVDF膜(伯樂公司(Biorad))。半干印跡架包含新鮮濕潤的略大于肽片的濾紙(Whatman3號)陰極緩沖液潤濕的三張紙肽片甲醇濕潤的一張PVDF膜陽極緩沖液1(30mMTris堿，20%甲醇)潤濕的三張紙陽極緩沖液2(0.3mMTris堿，20%甲醇)潤濕的三張紙在陰陽極電流密度為0.8mA/cn^下轉移1小時，這個時間足以從纖維素片上完全洗脫抗體并轉移至PVDF膜上。將PVDF膜浸沒于封閉緩沖液中10分鐘。以1:10000稀釋度將熒光素IRdye800標記的山羊抗-人IgG(H+L)(洛克蘭公司，貨號609-132-123)加入奧德賽(Odyssey)封閉緩沖液中(Li-Cor)，進一步用PBS和0.05%吐溫201:1稀釋。膜在震蕩平臺上孵育1小時。用TBST(含0.005%吐溫20的TBS)洗滌3x10分鐘。將膜干燥并用長波長熒光掃描儀(奧德賽公司(Odyssey))掃描800nm熒光，如圖8所示。利用針刺標記PVDF膜，以便準確地標記抗體反應斑點。所研究的抗體表位定義為反應肽中的最小氨基酸序列。對每一斑點的熒光強度進行積分并記錄為相對熒光單位(RFU)。為了比較，以同一方式分析兩種小鼠單克隆抗體，其中BAP-1相當于對N末端結構域具有特異性的抗體6E10(Kim(1998))，BAP-44相當于對中間結構域具有特異性的抗體4G8(Kim(1998))，除了在檢測中使用抗-小鼠Ig替代抗-人Ig。值得注意的是，單價Fab片段親和成熟并轉變?yōu)槿LIgGl抗體通常會引起表位識別序列的增寬，如pepspot和ELISA分析所示。這也許涉及由于親和成熟在抗體抗原結合區(qū)域募集了更多的接觸點，或者涉及與最小表位的更強結合以致可檢測到對相鄰氨基酸的微弱作用。后者也許是用全長IgG抗體探查AP-衍生肽時的情況。如下表所示，當對母體Fab和對應完全成熟IgG進行比較時，N末端和中間表位的識別序列擴展三個氨基酸。然而，值得留意的是為了在氨基酸C端共價連接對十肽進行修飾，該氨基酸由于空間位阻不易接近全長抗體。若在此情況下，最后一個C末端氨基酸未對表位識別序列產生顯著貢獻，并且本發(fā)明所用的pepspot分析中必須考慮最小識別序列的C末端可能減少.入<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>上表涉及在纖維素片上對全長IgG抗體與十肽結合進行的pepspot分析。數字指A(31-40序列中氨基酸的位置，為了與抗體結合十肽中必須存在這些氨基酸。表位進一步的延伸標示于括號中以便表明達到最大結合所需的側接氨基酸。實施例10:使用抗體A同種型(即本發(fā)明未糖基化、單糖基化或雙糖基化抗體)誘導聚集AP釋放生物素化AP的解聚實驗。檢測抗體A同種型誘導聚集A(3解聚的潛能的實驗設定如下在抗體A同種型作用前首先將生物素化A卩l(xiāng)-40摻入預制的A(31-40/A(31-42纖維中。如下所述使用鏈霉親和素-POD偶聯物的實驗檢測生物素化AP的釋放。在水性緩沖液中孵育數天后，合成A卩自發(fā)聚集并形成與阿爾茨海默病患者腦中見到淀粉沉積類似的纖維結構。下列體外實驗適合用于檢測生物素化Ap摻入預制A(3聚集體中或從中釋放，從而分析抗A(3抗體和其它AP結合蛋白如清蛋白的Ap中和作用(Bohrmann(1999)J.Biol.Chem.274，15990-15995)。通過摻入的生物素化A(51-40的釋放測量抗體A同種型誘導的聚集A(5解聚。實驗歩聚'用A(31-40和A(U-42(均為2^M，每孔100pl)的1:1混合物在37°C條件下包被NUNCMaxisorb微量滴定板(MTP)3天。在此條件下，孔表面吸附并固化高度聚集并纖維化的Ap。移去包被液在室溫下干燥該平板2-4小時。干燥的平板可存于-20。C。為了摻入生物素化的AP，37。C下用溶于含0.05%NaN3TBS的20nM生物素化Api-40孵育包被平板過夜(200pl/孔)。300pl/孔T-PBS洗板3次，加入用含0.05%NaN3TBS連續(xù)稀釋的抗體并在37。C孵育3小時。洗滌該平板并分析是否存在生物素化A(31-40。300^1T-PBS洗滌3次后，加入用含1%BSAT-PBS1:1000稀釋的鏈霉親和素-POD偶聯物(IOO|11/孔)(羅氏分子生化公司(RocheMolecularBiochemicals)并在室溫下孵育2小時。300^UT-PBS洗板3次，加入100pl/孔新鮮配制的四甲基聯苯胺(TMB)溶液。[配制TMB溶液10ml30mM檸檬酸pH4.1(用KOH調節(jié))+0.5mlTMB(12mgTMB溶于1ml丙酮+9ml甲醇)+0.01ml35%11202]。加入100nl/孔1NH2S04中止反應，在微量滴定板讀板機上讀出450nm的吸光度。如附圖9所示，利用摻入的生物素化Api-40的釋放測定抗體A同種型誘導的聚集A(3的解聚?？贵wA同種型和小鼠單克隆抗體BAP-1活性相似(圖9)，但是顯然BAP-2、BAP-17和4G8抗體從固化Ap堆中釋放生物素化A(5效能較弱(數據未顯示)。可通過與細胞表面全長APP反應的特性清除地區(qū)分BAP-1與糖基化抗體A。具有此類特性的抗體如BAP-1因其可能誘導自身免疫反應將不能用于治療應用。有趣的是，盡管BAP-2對暴露于聚集Ap的氨基酸殘基4-6具有特異性，但在此實驗中BAP-2活性明顯較低，這表明并非所有N末端特異性抗體都有等效的從預制聚集物中釋放A(3的能力。BAP-17(C末端特異性)和4G8(氨基酸殘基16-24特異性)在此實驗中效率相對較低是因為這兩個表位在聚集A(3中隱蔽的特性。所用濃度的BSA對聚集AP無效。與雙糖基化同種型相比，單糖基化同種型在體外具有更高的解聚聚集A卩肽的能力，在體內也許相同。實施例ll:抗體A組合物及包含同種型(本發(fā)明單、雙糖基化的抗體)從人腦脊液(CSF)中捕獲可溶性AP利用免疫沉淀(IP)和半定量Western印跡(WB)分析測定從人CSF中捕獲可溶性A(3的能力。魏按照以下方案免疫沉淀人CSF:70|il人CSF20(il孵育緩沖液(50mMTris，140mMNaCl，5mMEDTA，0.05%NP-40,1%BSA，0.25%明膠，0.25%奶粉，pH7.2)來自母液的抗體A(1000-10嗎/ml)100pl溶液置于4。Cl小時。加入40nl蛋白G瓊脂糖珠(安瑪西亞生物科技公司(AmershamBiosciences)弁17-0618-01;PBS洗滌，50%漿液)并在旋轉器上4。C孵育2小時。4。C500g離心3分鐘后，去除上清并將200plPBS加入珠中，轉移到密立博濾器管0.45pm中(密立博公司弁UFC30HVNB)并在4。C500g離心3分鐘。珠子中再加入200lJlPBS，渦旋并在4°C2000g離心3分鐘。加入45pl含DTT的lxNuPage樣品緩沖液，7CTC放置10分鐘后，4°C2000g離心3分鐘。在SDS-PAGE中，將18^蛋白G洗脫液施加到NuPage凝膠10%Bis-Tris凝膠上，同時將A^42(霸凱公司(Bachem))直接加入樣品緩沖液作為內標，并在MES緩沖系統(tǒng)中電泳。將該凝膠轉移到HybondCextra膜(挪威克斯公司(Novex)半干系統(tǒng))上。室溫下干膜3分鐘。將膜轉移到預熱的PBS中并在600W微波爐中加熱3分鐘。利用SuperBlock溶液(皮爾斯公司(Pierce))封閉1小時，再用含5%奶粉(伯樂公司)的T-PBS(含0.1%吐溫20的PBS)封閉1小時。4°。下用抗A(3抗體W02抗體(1:1500-1:2000稀釋，基因泰克公司，蘇黎世，瑞士)在旋轉器上孵育過夜，然后用T-PBS洗滌三次每次5分鐘，然后在室溫下用T-PBSl:5000稀釋的抗小鼠IgG-HRP(達科公司(Dako))孵育2小時。再用T-PBS洗滌三次每次5分鐘，接著用LumiLightPlus在室溫下孵育5分鐘。利用AlphaInnotech數碼相機系統(tǒng)將Western印跡數字化并分析其光密度。如圖10所示，免疫沉淀和Western印跡實驗顯示抗體A組合物(包含單和雙糖基化的抗體A同種型)與人CSF中可溶性Ap有效結合。值得注意的是，在這個實驗中，單糖基化的抗體A比雙糖基化的抗體A能夠更有效捕獲可溶性AP(圖10)。實施例12:抗體A組合物和同種型(如本發(fā)明的未糖基化、單糖基化或雙糖基化抗體)對人淀粉斑進行體外免疫染色。利用間接免疫熒光通過免疫組織化學分析檢測糖基化的抗體A同種型對獲自嚴重阿爾茨海默病患者腦切片的真正人(3-淀粉斑的染色能力。顯示了對真正人P-淀粉斑特異和敏感的染色。間接免疫熒光標記來自于阿爾茨海默病診斷陽性病人尸檢獲取的丘腦未固定組織的冰凍切片。使用連續(xù)的兩步孵育檢測結合的抗體A同種型，通過親和純化的偶聯于Cy3的山羊抗人(GAH)IgG(H+L)(tfl09-165-003，批號49353，杰克遜免疫研究公司(JacksonlmmunoResearch))顯示。對照組包括單獨的無關人IgGl抗體(西格瑪公司)和第二抗體，均產生陰性結果。所有類型P淀粉斑均被敏感、特異的檢測并當抗體A濃度為10ng/ml時被一致揭示(圖11)。當糖基化抗體A同種型濃度高至1pg/ml時，能特異和靈敏地對真正人(3淀粉斑染色。濃度為10pg/ml時觀察到背景染色，使用未糖基化的抗體A同種型時最顯著。經過體外組織切片，未糖基化同種型在接觸的載玻片表面和幾乎所有組織組分上具有相當大的非特異性粘性。這似乎是離子和/獲疏水作用造成的非特異性結合。實施例13:在小鼠阿爾茨海默病模型中利用抗體A修飾P淀粉斑為研究糖基化的抗體A同種型體內免疫修飾p淀粉斑的能力，利用單次給藥研究在PS2APP雙重轉基因小鼠(Richards(2003)、J.Neuroscience、23、8989-9003)中進行研究。以1mg/小鼠的劑量給予糖基化的抗體A同種型，3天后用磷酸鹽緩沖鹽水對動物進行灌注，將腦凍存于干冰上，準備用于冰凍切片。兩種糖基化同種型均在體內顯示了改進的和高效的腦滲透作用(與未糖基化形式相比)。在一種AD相關淀粉樣變的小鼠模型，PS2APP小鼠中顯示了有效的腦滲透及對I3淀粉斑的特異性結合。用未固定的冰凍切片評估(3淀粉斑結合抗體的存在，其中采用偶聯于Cy3的山羊抗人IgG(H+L)(#109-165-003，杰克遜免疫研究公司)進行間接免疫熒光單一標記(圖12)，或者再利用BAP-2-Alexa488免疫偶聯物復染以觀察組織中存在的所有I3淀粉斑類型的位置和分布。利用免疫熒光染色方法檢測結合的抗體A。切片黏附于預冷的載玻片后，于PBS中水化，再用-20'C預冷的丙酮處理2分鐘。用PBS洗滌兩次每次2分鐘。用含1XBSA的PBS封閉非特異性結合位點，或通過在UltraVblock(拉波威信公司(LabVision))孵育5分鐘、PBS洗滌、在含10%正常綿羊血清的強力封閉溶液(博奧基因公司(Biogenex))中孵育20分鐘進行封閉。在含有10X正常綿羊血清的PBS中洗滌后，用親和純化的偶聯于Cy3的山羊抗人(GAH)IgG(H+L)(存109-165-003，批號49353，杰克遜免疫研究公司)(濃度15pg/ml)室溫下孵育該載玻片1小時。通過與濃度為0.5pg/ml的一種偶聯于Alexa488的小鼠單克隆抗體抗體BAP-2室溫下孵育1小時對淀粉斑進行復染。在4mMCuS04的50mM醋酸銨溶液中孵育以淬滅脂褐質(lipofuscin)的自發(fā)熒光。用雙蒸水沖洗蓋片并用500^PBS/片洗滌兩次，用熒光封片劑(達科公司(Dako)S3023)包埋蓋片。用激光共聚焦顯微術成像，用IMARIS和COLOCALIZATION軟件(比特普蘭公司(Bitplane)，瑞士)對圖片進行共定位的定量分析。小鼠單次給藥lmg/小鼠三天后，發(fā)現糖基化的抗體A同種型在體內透過血腦屏障并有效免疫修飾/結合所有的p淀粉斑。圖12顯示了代表性圖片。明顯的對比是未在淀粉斑處檢測到未糖基化形式。實施例14:抗體A同種型與HEK293細胞表面表達的淀粉樣前體蛋白(APP)結合的研究本領域熟知流式細胞術。流式細胞術測量的相對熒光單位(如FL1-H)表明各抗體與細胞表面的結合。與未轉染的HEK293相比，APP轉染的HEK293發(fā)生的熒光改變表明與細胞表面發(fā)生不良反應。例如，與未轉染的HEK293細胞相比(圖13，虛線，右圖)，抗N末端結構域的抗體BAP-1和BAP-2能顯著改變HEK293/APP的FL-1信號(圖13，實線，右圖)。類似地，BAP-44抗體(中間A卩表位特異性)引起的改變大小相似。相反，所有的抗體A同種型(圖13左圖)(N-末端和中間A-p表位特異性)未顯示出顯著熒光改變。未轉染的HEK293細胞比APP轉染細胞顯示出更高的本底熒光，這是因為不同的細胞大小及表面特性。FACScan儀器與CellquestPro軟件包(均為貝克頓迪金森公司產品(BectonDickinson))聯合使用。抗體A同種型對細胞表面APP無反應性(圖13)。實施例15:小鼠阿爾茨海默病模型中AP淀粉斑沉積的形態(tài)學分析利用定量計算機輔助影像分析研究接受5個月抗體A組合物或抗體A同種型治療的PS2APP小鼠腦的不同區(qū)域(丘腦、皮層、海馬區(qū)和下腳)的中抗體A組合物或抗體A同種型體內降低淀粉樣變的能力。因此，利用抗體A組合物或抗體A同種型及載體對雄性PS2APP轉基因小鼠進行靜脈注射。75只5-6月齡的PS2APP小鼠分為5組(A-E)，每組15只小鼠。從第0天開始，每只小鼠通過尾靜脈推注接受O.lmL載體(Omg/kg)、或抗體A制劑(20mg/kg)。A、B、C、D和E組PS2APP小鼠分別接受載體(組氨酸緩沖鹽水)、含有單、雙糖基化抗體A但不含未糖基化抗體A的抗體A組合物、雙糖基化的抗體A、單糖基化的抗體A和未糖基化的抗體A。注射抗-CD-4抗體(雜交瘤克隆GK1.5購自ATCC)誘導對人抗-A卩抗體給藥產生免疫耐受。對耐藥抗體的監(jiān)測表明抗體治療的動物在治療16周以上后僅發(fā)生中等程度的免疫應答并且可檢測抗體具有低親和力或者僅有少量產生(數據未顯示)。治療5個月后小鼠被處死。對未固定的腦進行矢向切片，包括丘腦、海馬結構和皮層區(qū)。每一腦半球按照如下方法制備50張切片從側面1.92處開始，連續(xù)切出5個5xlOpm和5x20pm切片。連續(xù)切片中沒有間隔，共使用組織750jim。因此切片系列在側面約1.20處結束(Paxinos和Franklin，2003)。為了進行形態(tài)定量分析，每十張切片使用一張。使用濃度為5pg/ml的雙糖基化抗體A同種型對切片中的淀粉斑沉積物進行染色。使用偶聯于Alexa-488熒光團的小鼠單克隆抗體(BAP-2)(5化/ml)對A(3染色的結果相當，盡管神經元的顯著胞內和背景染色干擾了下述圖片常規(guī)處理。應用15pg/ml濃度的親和純化的偶聯Cy3的山羊抗-人(GAH)IgG(H+L)(#109-165-003，批號49353，杰克遜免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))在室溫下孵育1小時以便檢測。500plPBS/片洗滌兩次后，用熒光封片劑(S3023，達科公司)包埋該載玻片。使用GenePix個人4100A微陣列掃描儀(?？怂蓛x器公司(AxonInstruments),現在為分子儀器公司(MolecularDevices),美國加州)獲取圖像。通過計算機輔助圖像分析使用無偏形態(tài)測定方法，使用兩個參數測量(3淀粉斑載量和數目，這兩個參數是P淀粉斑覆蓋面積的百分數和卩淀粉斑數目。使用MCIDM7Elite軟件(圖像研究公司(ImageResearchInc)，加拿大安大略省圣凱瑟琳(St.Catherines/Ontario,Canada))定量測定斑載量和數目。用細節(jié)提取濾鏡和靶點著重濾鏡增強掃描圖像。對所得圖像進行二進制化、根據染色強度調整閾值。在原始參考圖像上標示出偽像、血管和邊緣效應。在參考圖像上勾畫感興趣區(qū)域。在二進制圖片中測量這些區(qū)域的面積、斑占據面積以及斑數目以進行最終的定量。忽略單一像素。使用通用電子表格軟件進行計算(微軟Excel,美國華盛頓州雷蒙德)。將斑尺寸分為ll組，范圍從<100到>1000nm2。使用雙尾異方差t-檢驗進行統(tǒng)計學評估。為了進行比較和統(tǒng)計評估，利用一組(15只動物)未治療6月齡PS2APP小鼠開始研究，以測定淀粉樣變((3淀粉斑病)基線。具有顯著性水平的結果顯示于圖15-18中(*:p^0.05;**:p^0.01;***:p^0.0(H)。在丘腦區(qū)淀粉斑的減少尤其顯著(圖15)。經測定抗體治療組總P淀粉斑表面積平均減少抗體A組合物64。/。、雙糖基化的抗體A70。/q、單糖基化的抗體A81%和未糖基化抗體A44%。總P淀粉斑數目平均減少抗體A組合物70%、雙糖基化的抗體A78%、單糖基化的抗體A82%和未糖基化抗體A36%。值得注意的是未糖基化抗體的顯著性低，觀察到變化相當大。圖16顯示新皮質區(qū)域及胼胝體淀粉斑的減少。經檢測抗體治療組總(3淀粉斑表面積平均減少抗體A組合物19。/。、雙糖基化的抗體A27。/。、單糖基化的抗體A30%和未糖基化抗體A10%。總P淀粉斑數目平均減少抗體A組合物40n/。、雙糖基化的抗體A46y。、單糖基化的抗體A42n/。和未糖基化抗體A11%。圖17顯示整個海馬區(qū)淀粉斑的減少。經檢測抗體治療組總P淀粉斑表面積平均減少抗體A組合物12。/。、雙糖基化的抗體A24。/。、單糖基化的抗體A24。/。和未糖基化抗體A6。/。?？?3淀粉斑數目平均減少抗體A組合物36%、雙糖基化的抗體A46%、單糖基化的抗體A37%和未糖基化抗體A3%。圖18顯示淀粉樣變高度易感區(qū)域腦下腳淀粉斑的減少。經檢測抗體治療組總P淀粉斑表面積平均減少抗體A組合物2%、雙糖基化的抗體A12%、單糖基化的抗體A5。/。和未糖基化抗體A1%?？傏嗟矸郯邤的科骄鶞p少抗體A組合物22%、雙糖基化的抗體A36%、單糖基化的抗體A13%和未糖基化抗體A1%?？贵wA組合物和主要N-糖基化同種型(雙糖基化的抗體A和單糖基化的抗體A)降低p淀粉斑載量和斑數目的效能相當。斑載量的減少最明顯并在低或中等淀粉樣變區(qū)域具有統(tǒng)計學顯著性?？傊?，在所有測量的腦區(qū)域發(fā)現，用抗體A組合物和兩種含Asn52糖基化的抗體A同種型治療后，p淀粉斑數目的減少具有統(tǒng)計顯著性。相反的是，發(fā)現對丘腦I3淀粉斑數目的影響很小，使用抗體A的未糖基化同種型治療后對其它研究腦區(qū)域的P淀粉斑數目無顯著影響，其中未糖基化同種型是在本發(fā)明詳述的純化后被排除于抗體A組合物之外。我們也研究了涉及斑大小的斑清除效力。通常，發(fā)現受試人抗-A卩抗體能明顯清除小P淀粉斑。該現象在全部腦區(qū)域均可觀察到(圖15C、16C、17C和18C)。相反，用抗體A的未糖基化同種型觀察到的趨勢很小或無顯著性趨勢。對于抗體A和主要Asn52糖基化同種型的比較分析顯示其降低斑載量的能力相當，然而未糖基化同種型則沒有顯著降低斑載量的效應。實施例16:抗體A組合物與p淀粉斑結合的體內藥代動力學。比較兩種給藥頻率以研究抗體A組合物的結合動力學，如上述定義抗體A組合物包含單糖基化抗體A和雙糖基化抗體A，不含未糖基化抗體A。因此，通過尾靜脈注射給予PS2APP轉基因雄性小鼠抗體A組合物，每隔兩周給予0.05、0.1和0.3mg/kg共給四次，或者每隔一個月給予0.075、0.15和0.45mg/kg共給三次。為了比較，每隔兩周給予O.lmg/kg—次和兩次，每隔一月給予0.15mg/kg兩次，最后一次給藥兩周后處死所有小鼠。根據Paxinos和Franklin,準備未固定的PS2APP腦組織(包括丘腦、海馬結構和皮層區(qū)域)在側向1.92至1.2mm處進行矢向切片。在低溫器中制作40pm腦切片。使用免疫熒光離體免疫染色法檢測結合的抗體A組合物抗體。因此，將腦切片，并與檢測抗體一親和純化的偶聯Cy3的山羊抗人(GAH)IgG(H+L)(#109-165-003，批號49353，杰克遜免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))(15pg/ml)室溫下孵育1小時。使用一種偶聯Alexa488熒光團的小鼠抗A(3單克隆抗體BAP-2(0.5pg/ml)室溫下孵育1小時，以便對P淀粉斑進行復染。如上所述使用萊卡(Leica)TCSSP2AOBS激光共聚焦掃描顯微鏡記錄接近小腦的皮層枕葉的圖像。利用IMARIS軟件(比特普蘭(Bitplane)，瑞士)進行計算機輔助圖像處理。首先利用軟件的裁剪功能選擇較低劑量(兩個最高劑量0.3和0.45mg/kg除外)的斑圖像，因為獲取最高劑量組的線性信號記錄需要不同的增益設定。在設定閾值(T)為p淀粉斑位點上結合的GAH-Cy3的讀數后，使用超越(SURPASS)功能選取正體素(voxel)。對于較低和較高劑量組，閾值分別設定為19和12。作為(3淀粉斑特異性的對照，比較雙重標記后GAH-Cy3染色圖像和偶聯Alexa488的小鼠單克隆BAP2染色的斑圖像，并在不同通道記錄。使用IMARISMeasurementPro軟件模塊對所有圖像的定量描述進行描述性統(tǒng)計。選擇低劑量組P淀粉斑或高劑量組圖像總信號確定平均體素熒光強度(MVI)值。機器噪聲、組織散射信號和脂褐質自發(fā)熒光引起基線MVI(B)。為了校正背景，測量遠離P淀粉斑區(qū)域的平均信號強度確定B，并從所有測定圖像MVI中減去B(MVI-B=S)。從每個劑量組的每只小鼠的每張腦切片上獲取3-4張圖像得到類似斑平均強度的信號強度(S)。為了具有可比性，將信號強度標準化至獲自早先研究的參比樣品。我們使用單次給藥0.25mg/kg后的PS2APP小鼠腦切片作為參照。給藥后一周作為測量終點。將全部測量強度值標準化至使用單次給予0.25mg/kg抗體A組合物一周后測量的P淀粉斑處的平均強度(見下表)。對每劑量組3只動物進行免疫染色并測定其信號強度平均值后，用CLSM得到免疫陽性p淀粉斑的平均相對熒光強度的標準化值。僅在低劑量組觀察到無抗體A組合物衍生的抗體A的斑，很可能由于抗體A組合物衍生的抗體A有限或部分占據了斑表面，而在切片過程中丟失。因此，僅將免疫陽性斑納入比較分析中。下表顯示PS2APP轉基因小鼠中多次靜脈推注抗體A組合物后每個劑量組的平均相對熒光強度-<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>'實驗數據代表標準化至1周后單次給藥0.25mg/kg所得數據的強度值。圖19顯示抗體A組合物結合和連續(xù)每兩周給藥0.1mg/kg次數的關系。兩次給藥后，雖然免疫染色的程度差異大而且并未達到顯著性，但平均強度出現上升。4次注射后，(3淀粉斑的免疫染色更加均一，但平均強度僅輕微上升。總體上，雙周給藥的數據清楚表明斑結合增加的趨勢與給藥次數相關。圖20顯示抗體A組合物結合和連續(xù)每月給藥0.15mg/kg的次數的關系。有趣的是，給藥兩次和三次后獲得的水平相當。這并非所期望的結果，也許表明啟動了早期效應，這種效應導致清除機制的時間依賴性差異(如小膠質細胞活化延遲)。圖21、22顯示抗體A組合物結合效力和給藥劑量的關系。雙周給予0.05、0.1和0.3mg/kg(圖21)和每月給予0.075、0.15和0.45mg/kg(圖22)清楚顯示了劑量關系。有證據表明反應是非線性的，并且其它因素如小膠質細胞活化時間延遲也可能影響所觀察到的非線性。因此得出以下結論抗體A組合物與小鼠A(3斑結合是劑量相關的，表明多次給藥具有累加效應。實施例17:抗原依賴性胞吞作用分析。為了檢測抗體A組合物介導的胞吞效應，將來自AD腦切片的真正A卩斑與不同濃度抗體A組合物(如上文所定義抗體A組合物包含單糖基化抗體A和雙糖基化抗體A但不含未糖基化抗體A)預孵育，并且接觸活的人原代單核細胞。由嚴重AD病例(Braak第IV階段)制備皮層枕葉區(qū)的未固定的人AD腦組織切片。切片在PBS中再水化5分鐘后加入活細胞。使用PBS配制的指定濃度抗體A組合物抗體孵育1小時。PBS洗滌后加入活細胞。在37°C、5%二氧化碳的條件下，用含1%抗生素(稀釋自含有10,000U/ml青霉素和IO，OOOmg/ml鏈霉素(吉布科#15140-122)的母液)的RPMI1640(吉布科#61870-044)培養(yǎng)基培養(yǎng)密度為0.8和1.5x106/ml的預刺激的人原代單核細胞2-4天。制備預刺激人原代單核細胞的方法為本領域所熟知，如使用剌激因子如巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)制備。孵育后，小心移去培養(yǎng)基，在含2%甲醛的PBS中化學固定10分鐘以保存切片。使用濃度為10mg/ml的一種偶聯Alexa488(分子探針公司(MolecularProbes):A-20181,單克隆抗體標記試劑盒)的小鼠單克隆抗體抗體BAP-2在室溫下孵育1小時，對殘留淀粉斑載量進行染色。通過測量免疫熒光染色的殘留A卩斑確定斑移除的量。利用萊卡TCSSP2AOBS共聚焦激光掃描顯微鏡記錄圖像。采用488nm激發(fā)波長、針孔設定4、HCXPLFL20x/0.40校正物鏡記錄一個光學層面，但在一個實驗中，使用HCPLFluotar10x/0.30物鏡、針孔設定3。在所有圖像中保持儀器設定不變以便于比較相關定量結果。特殊的，調整激光功率、增益和偏移量以使觀察信號強度處于動態(tài)監(jiān)測范圍內。對于每一抗體A組合物濃度，在連續(xù)切片的相似位置記錄灰質區(qū)以便最大程度減小解剖學差異可能對斑載量造成的波動。在所有抗體A組合物濃度缺少細胞的條件下，測定抗體A組合物和檢測抗體BAP-2的潛在競爭結合。使用無關人IgGl(塞羅泰克公司(Serotec)，PHP010)抗體作為另一對照。使用IMARIS軟件(比特普蘭，瑞士)進行圖像分析。通過設定強度閾值創(chuàng)建代表與斑結合的BAP-2目標的BAP-2陽性像素的等高面。利用Su卬assPro軟件模塊的"等高面功能"計算表面積和總熒光強度值。數據表示為從一張腦切片的5個灰質區(qū)域獲取的平均染色面積和總染色強度值。儀器噪聲形成信號基線，并發(fā)現組織散射信號是可忽略的，因此無需從總強度信號中減去。如圖23所示，A|3斑染色的減少表明來自人AD腦切片中A|3斑吞噬作用增強，從而顯示了抗體A組合物的定性效應。免疫組織化學揭示與100ng/ml抗體A組合物預孵育40小時后明顯可見可染色A|3斑減少。在抗體A組合物濃度為l和5mg/ml時，此效應非常明顯。5mg/ml時，胞吞作用顯然大量清除了A(3斑，僅留下很少的大AP斑。圖24顯示了同一實驗中基于免疫反應信號的定量測量結果表示為面積和強度?；蛘?，利用AP偶聯的熒光聚苯乙烯珠測量抗體A組合物介導的胞吞作用。因此，熒光珠(3mm，FluoresbritecarboxyYG，頗里塞恩斯公司(PolysciencesInc.))與Ap偶聯。簡要的，用偶聯緩沖液(50mMMES緩沖液、pH5.2、1%DMSO)懸浮和離心來洗滌珠兩次。將沉淀(約10pl)懸浮于200ul偶聯緩沖液中，在偶聯緩沖液中加入20pi20%EDC溶液(乙基-二氨基丙基-碳二亞胺，皮爾斯公司)進行激活。立即加入20ingA卩(l-40)或Ap(l-42)(用0.1%氫氧化銨配制，霸凱公司(Bachem))能啟動該偶聯反應。孵育過夜后利用0.5ml10mMTris.HClpH8.0和0.5ml儲存緩沖液(IOmmTris.HClpH8.0，0.05%BSA，0.05%NaN3)分別洗滌珠三次。將1%懸液儲存于4。C待用。利用與所有D-氨基酸Ap(l-40)(用0.1%氫氧化暗中銨配制，霸凱公司)偶聯的FhioresbriteCarboxyNYO(紅色熒光)珠作為陰性對照。鼠單核細胞/巨噬細胞(細胞系P388D1)在C24透明組織培養(yǎng)板或C96黑色微孔板中生長至約50%匯合度。培養(yǎng)基為含5%FBS、谷胺酰胺和抗生素的IMEM。為封閉非特異性清道夫受體，在200ml培養(yǎng)體積中加入10ml巖藻依聚糖(福祿卡公司，10mg/ml水溶液)并孵育2小時。加入連續(xù)稀釋的抗體A組合物并預孵育30分鐘。加入熒光AP珠懸液(20pl)并孵育3小時以進行胞吞作用。分別利用冰冷EDTA和PBS用力清洗貼壁細胞一次和兩次以移除細胞表面的粘著物。利用蔡司(Zeiss)Axiovert405觀察監(jiān)測殘留的珠子，或通過微孔板熒光計(Fluoroscan，實驗室系統(tǒng)公司(Labsystems))用444nm(激發(fā)光)和485nm(發(fā)射光)濾光片組對其進行定量。圖25顯示抗體A組合物在P388D1細胞中對偶聯熒光珠的合成Ap聚集物胞吞作用的定性影響。圖26顯示抗體A組合物劑量反應的定量測定結果。兩次獨立實驗揭示了ECso范圍為30-200ng/ml，MEC范圍為10-60ng/ml。孵育化學計量法差異即珠/細胞比可能引起了觀察到的差異。單價抗體與有限的抗原相互作用導致了在濃度"00ng/ml時觀察到的珠胞吞作用的下降。因此得出結論，抗體A組合物以劑量相關方式有效誘導AD腦組織切片中A卩斑的胞吞作用。權利要求1.一種純化抗體分子，其中所述抗體分子中至少一個抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。2.如權利要求1所述的純化抗體分子，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)(VH)的糖基化的天冬酰胺(Asn)位于CDR2區(qū)域。3.如權利要求1或2所述的純化抗體分子，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)(VH)的糖基化的天冬酰胺(Asn)位于SEQIDNO:2的位置52或SEQIDNO:6的位置52。4.如權利要求1-3中任一項所述的純化抗體分子，其特征在于，所述抗體分子能夠特異性識別(3-A4肽/A(34。5.如權利要求4所述的純化抗體分子，其特征在于，所述(3-A4肽/A(54具有如下序列或所述序列中至少15個氨基酸的部分DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGS服GAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3)。6.如權利要求1-5中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述抗體分子的至少一個抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)包含一個糖基化的天冬酰胺(Asn)，所述VH由以下序列編碼(a)包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的核酸分子TGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA;(b)編碼含有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽的核酸分子GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.2);(c)能與核酸分子(a)或(b)雜交、并編碼能結合下列氨基酸序列所示P-A4肽/Ap4或者能結合包含其中至少15個氨基酸的片段的多肽的核酸分子DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);(d)能與核酸分子(a)或(b)雜交、并編碼能結合下列氨基酸序列所示(3-A4肽/A(54中至少兩個區(qū)域或能結合包含SEQIDNO.3中至少15個氨基酸的片段的至少兩個區(qū)域的多肽的核酸分子DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3)，所述(5-A4肽A(34的兩個區(qū)域或其所述片段包含3-6位和18-26位氨基酸；或(e)簡并為(a)-(d)中任一項所述核酸序列的核酸序列。7.如權利要求1-5中任一項所述的抗體分子，其特征在于，包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的可變區(qū)包含在選自下組的重鏈中(a)SEQIDNO:5、23或25所示核酸分子編碼的重鏈多肽；(b)含有SEQIDNO:6或26所示氨基酸序列的重鏈多肽；(c)某核酸分子編碼的重鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能結合下列氨基酸序列所示P-A4肽/A(34或其包含至少15個氨基酸的片段的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);(d)某核酸分子編碼的重鏈多肽，該核酸分子能與核酸分子(a)雜交，并編碼能結合下列氨基酸序列所示P-A4肽/A(34上至少兩個區(qū)域或結合包含SEQIDNO.3中至少15個氨基酸的片段的至少兩個區(qū)域的多肽DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQIDNO:3);所述(3-A4肽A(34的兩個區(qū)域或其所述片段包含3-6位和18-26位氨基酸。8.如權利要求1-7中任一項所述的抗體分子，其特征在于，兩個抗原結合位點包含重鏈可變區(qū)(VH)中的糖基化的Asn。9.如權利要求8所述的抗體分子，其特征在于，所述重鏈(VH)CDR2區(qū)域包含糖基化Asn。10.如權利要求l-9中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述Asn為位于SEQIDNO:2位置52的Asn或SEQIDNO:6位置52的Asn。11.如權利要求1-10中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述位于Vh區(qū)的Asn糖基化選自(a)雙觸角復合物型糖結構；(b)雙觸角雜合型糖結構；(c)雙觸角寡甘露糖型的糖結構；和(d)附圖5或27提供的任意結構的雙觸角糖結構。12.如權利要求11所述的抗體分子，其特征在于，所述糖結構不包含核心巖藻糖化。13.如權利要求2-12中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述CDR-2區(qū)域含有SEQIDNO:12所示氨基酸序列。14.如權利要求1-13中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述抗體分子是重組產生的。15.如權利要求1-14中任一項所述的抗體分子，其特征在于，所述抗體分子是在CHO細胞中產生的。16.如權利要求15所述的抗體分子，其特征在于，所述CHO細胞為CHOKl或CHOK1SV。17.—種制備權利要求1-16中任一項所述抗體分子的方法，其包括以下步驟(a)在哺乳動物培養(yǎng)細胞中重組表達編碼權利要求1-13中任一項所述抗體分子的異源核酸分子；和(b)通過包括以下步驟的方法純化所述重組表達的抗體分子(bl)蛋白A柱純化；(b2)離子交換柱純化；以及(b3)大小排阻柱純化。18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述離子交換柱純化包括陽離子交換色譜。19.如權利要求17或18所述的方法，還包括另一步驟(c)分析色譜和/或進一步濃縮步驟。20.—種組合物，該組合物含有其一個抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗體分子，和其兩個抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)包含糖基化的天冬酰胺(Asn)的抗體分子，該組合物中少于5%抗體分子的抗原結合位點的重鏈可變區(qū)(VH)不含糖基化的天冬酰胺(Asn)。21.—種包含權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求17-19中任一項所述方法制備的抗體分子的組合物。22.如權利要求20或21所述的組合物，為診斷性或藥學組合物。23.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備預防和/或治療淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關性疾病的藥物中的應用。24.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備檢測淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關性疾病的診斷試劑盒中的應用。25.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備分解P淀粉斑的藥物中的應用。26.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備用于對(3淀粉斑形成產生被動免疫的藥物組合物中的應用。27.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備預防性治療淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關性疾病的藥物組合物中的應用。28.如權利要求27所述的應用，其特征在于，預先存在的卩淀粉斑或p淀粉斑聚集中間體將減少。29.權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物在制備診斷病人的淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關性疾病或診斷病人對患上淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關疾病的易感性的診斷試劑盒中的應用。30.如權利要求23、24或27-29中任一項所述的應用，其特征在于，所述疾病為癡呆、阿爾茨海默病、運動神經病、唐氏綜合征、庫賈氏病、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、Lewy體形成相關性癡呆、帕金森病、HIV相關性癡呆、ALS或衰老相關性神經元疾病。31.—種試劑盒，其包含權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或按照權利要求17-19中任一項所述方法制備的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物。32.—種預防、治療或改善淀粉樣蛋白形成和/或淀粉斑形成相關疾病的方法，所述方法包括給予需要此類預防或治療的哺乳動物權利要求1-16中任一項所述的抗體分子或權利要求20-22中任一項所述的組合物。33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述疾病為癡呆、阿爾茨海默病、運動神經病、唐氏綜合征、庫賈氏病、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變、Lewy體形成相關性癡呆、帕金森病、HIV相關性癡呆、ALS或衰老相關性神經元疾病。34.如權利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物為人。全文摘要本發(fā)明涉及純化抗體分子的制劑，其特征是重鏈可變區(qū)(V_H)中的至少一個抗原結合位點包含糖基化的天冬酰胺(Asn)。更具體說，提供了包含所述抗體分子和抗體混合物的藥學和診斷性組合物，該組合物能夠特異性識別β-A4肽/Aβ4。本發(fā)明具體涉及包含在重鏈可變區(qū)中有一個或兩個具有糖基化天冬酰胺(Asn)的糖基化抗原結合位點的抗體混合物，即重鏈可變區(qū)(V_H)中含有糖基化Asn的抗體同種型的混合物。也公開了包含特異性糖基化抗體同種型的組合物或抗體制劑。而且提供了這些抗體的藥學和診斷性用途。所述抗體同種型可用于藥學干預淀粉樣蛋白形成或淀粉樣蛋白斑形成和/或這些病癥的診斷。文檔編號C07K16/18GK101351476SQ200680046307公開日2009年1月21日申請日期2006年12月11日優(yōu)先權日2005年12月12日發(fā)明者A·紹布瑪,B·寶曼,D·舒鮑爾,H·洛茨西爾,H·科爾,K·蘭奇,K·魏爾,M·布洛克豪斯,W·赫伯申請人:豪夫邁·羅氏有限公司