去糖基化的人類抗體、其融合蛋白質(zhì)及用途
【專利摘要】本發(fā)明是通過給受影響的受試對象給藥有效量的工程化的去糖基化的人單克隆抗體來降低治療性中和抗體的效應(yīng)子功能的方法，所述單克隆抗體含有工程化的Fc區(qū)域，其中Fc區(qū)域的去糖基化降低與治療性中和抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、抗體介導(dǎo)的經(jīng)典激活途徑和炎癥。
【專利說明】去糖基化的人類抗體、其融合蛋白質(zhì)及用途
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2011年12月28日提交的61/581，080的權(quán)益，該申請的主題以引用 方式全文并入本文。

【背景技術(shù)】
[0003] 免疫球蛋白（IgG)是大分子。它們是由2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成的抗體。每條輕 鏈都具有2個部分：恒定區(qū)（LC)和可變區(qū)（LV)。每條輕鏈都具有1個可變部分（HV)和4 個恒定部分（CHI、CH2、CH3和CH4)。每條鏈上，各可變部分后面為恒定部分。各輕鏈通過 一個或多個鏈間共價二硫鍵而與重鏈連接。各重鏈和輕鏈還包括規(guī)則間隔的鏈間二硫橋。 可變結(jié)構(gòu)域由各抗體特異性的互補決定區(qū)（CDR)和構(gòu)架區(qū)（FW)構(gòu)成?？勺兘Y(jié)構(gòu)域決定了 抗體的功能和結(jié)合。CDR是抗體與抗原結(jié)合的主要結(jié)合節(jié)段。恒定結(jié)構(gòu)域（由CH1、CH2和 CH3區(qū)構(gòu)成）不參與抗原的結(jié)合。CH2和CH3構(gòu)成了抗體的Fc區(qū)。Fc區(qū)形成了多種"效應(yīng) 器功能"（參見下文），包括某些生物活性，這些活性在治療性中和抗體中可能是不利的。此 類不利的效應(yīng)器功能包括Clq結(jié)合以及抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC)的應(yīng)答?？贵w的Fc 區(qū)I (具體而言為效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域）與免疫效應(yīng)器細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞）表面上的Fc受體 (Fc. y.Rs)結(jié)合。這導(dǎo)致吞噬作用或靶細(xì)胞的溶解。在補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC)中， 抗體通過引發(fā)細(xì)胞表面上補體的級聯(lián)作用并形成MAC而殺死靶細(xì)胞。
[0004] 有5種主要類型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG被進一步分為4 種同種型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。由于位于這些同種型恒定結(jié)構(gòu)域中的序列而引發(fā)不 同的應(yīng)答。已知IgGl、IgG2和IgG3同種型會導(dǎo)致補體系統(tǒng)激活及⑶C(參見圖1)。已知 IgGl和IgG3同種型會介導(dǎo)ADCC。4種IgG同種型的重鏈組成不同。在治療性抗體中，人 類IgGl為最常用的同種型。因此，修改治療性抗體效應(yīng)器功能的嘗試集中在IgGl同種型 上。但是，不同的IgG同種型（具有不同的固有的效應(yīng)器功能性）更通常用于降低和/或 利用效應(yīng)器功能。本領(lǐng)域須要研發(fā)IgG2、IgG3、IgG4同種型及同種型雜交體（Fc修飾或Fc 未修飾）用作治療性抗體的用途。本發(fā)明的目的在于解決一部分所述的這些須要。
[0005] 雜交同種型-IgG抗體的鉸鏈區(qū)位于重鏈的CH1和CH2部分之間，并且特別容易 被蛋白水解酶切割?？贵w可以經(jīng)重組改造，從而形成雜交同種型，其包括由2種或多種不同 的同種型得到的部分。例如現(xiàn)有技術(shù)包括雜交抗體，其包括與IgG4同種型抗體的CH2和 CH3部分融合的、IgG2同種型抗體的可變部分和第一恒定部分（美國專利20070041972)。
[0006] Fc介導(dǎo)的效應(yīng)器功能-Fc "效應(yīng)器功能"是除了抗體的主要功能和目的以外的抗 體（天然抗體或改造抗體）的生物活性。在治療性中和抗體中，效應(yīng)器功能是除了中和靶 蛋白或途徑以外的抗體的生物活性?？贵w效應(yīng)器功能的實例包括：Clq結(jié)合和補體依賴的 細(xì)胞毒作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表 面受體（例如B細(xì)胞受體）的下調(diào)節(jié)；表達(dá)Fc受體的血小板激活的缺乏；以及B細(xì)胞的激 活。許多效應(yīng)器功能起始于Fc與Fc γ受體（Fc. γ . R)的結(jié)合。有3種亞類的Fc. γ . R : Fc. γ · RI (CD64)、Fc. γ · RII (CD32)和 Fc. γ · RIII (CD16)。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明為包括Fc變體的改造抗體，該抗體衍生自同種型IgG2、IgG3和IgG4的親 代抗體，其中Fc區(qū)的至少1個氨基酸被修飾。大部分的治療性抗體都是IgG同種型，它們 往往顯示更強的效應(yīng)器功能活性。但是，未修飾的野生型同種型IgG2、IgG3和IgG4表現(xiàn)出 低于IgGl同種型抗體的效應(yīng)器功能活性。所述的改造抗體的Fc區(qū)為多種不理想的效應(yīng)器 功能（例如經(jīng)典的激活途徑及抗體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解）的基因座。同種型IgGl和其他同種 型之間的效應(yīng)器功能活性差異可歸因于同種型Fc區(qū)的差異。在本發(fā)明的多個實施方案中， Fc區(qū)衍生自除了 IgGl以外的同種型的抗體。本發(fā)明為通過向痛苦中的受試對象給藥有效 量的除了 IgGl以外的同種型的改造人類單克隆抗體，來降低治療性中和抗體的效應(yīng)器功 能的方法，其中對Fc區(qū)的修飾阻止了抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、Clq結(jié)合、炎癥以及抗體引發(fā)的 經(jīng)典的激活途徑。本發(fā)明描述了改造抗體和抗體雜交體，它們在Fc區(qū)具有突變，和/或具 有由除了 IgGl以外的同種型衍生的Fc區(qū)。本發(fā)明包括這樣的抗體：具有由一種同種型衍 生的不同的目標(biāo)結(jié)合區(qū)的雜交體；與由IgG2、IgG3或IgG4同種型衍生的經(jīng)修飾和/或未修 飾的Fc區(qū)結(jié)合。本發(fā)明的目的在于能夠使用具有降低的Fc介導(dǎo)的應(yīng)答、但具有正常的體 內(nèi)半衰期的治療性中和抗體。
[0009] 在一些應(yīng)用中，例如在治療性抗體作為抗癌藥品的用途中，某些效應(yīng)器功能是理 想的。在其他的應(yīng)用中，某些效應(yīng)器功能是不理想的。例如在靶向旁路途徑的特異性蛋白 質(zhì)的治療性抗體的情況下，激活經(jīng)典的補體途徑的效應(yīng)器功能是不理想的。為了減小或消 除治療性抗體的副作用，本發(fā)明提供了減小或消除效應(yīng)器功能的方法。
[0010] Fc區(qū)的作用-抗體的Fc區(qū)介導(dǎo)了抗體的效應(yīng)器功能和血清半衰期。這些效應(yīng)器 功能包括但不限于：補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC)、抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC)、抗體依 賴的細(xì)胞吞噬作用（ADCP)、以及Clq依賴的經(jīng)典的激活途徑。IgG與Fc. Y.R和/或Clq 的結(jié)合由Fc區(qū)內(nèi)的特異性殘基或結(jié)構(gòu)域控制。此外，結(jié)合依賴于位于抗體鉸鏈區(qū)及CH2部 分的殘基。由許多發(fā)明人制造的多種突變來識別與Fc結(jié)合有關(guān)的區(qū)域。改造治療性單克 隆抗體（mAb)的Fc區(qū)、或Fc融合蛋白質(zhì)能夠使人們得到這樣的分子，其更適于中和治療所 需的藥理學(xué)活性。
[0011] FcRn :-種類型的Fc受體為新生的Fc受體（FcRn)。該受體在測定單克隆抗體的 血清半衰期中是重要的。FcRn在內(nèi)皮細(xì)胞的表面上表達(dá)并以pH依賴的方式與IgG結(jié)合。 該結(jié)合導(dǎo)致抗體內(nèi)吞至內(nèi)吞膜泡中。這使細(xì)胞能夠使所述的抗體再循環(huán)至血清中，從而使 IgG半衰期為大約23天。
[0012] Fc效應(yīng)器&Clq結(jié)合：抗體的效應(yīng)器功能在體內(nèi)是重要的，并且在抗癌治療性抗體 的研發(fā)中已經(jīng)針對它們的益處進行了開發(fā)。盡管增強的效應(yīng)器功能是研發(fā)抗癌治療所必 須的，但是降低的效應(yīng)器功能在慢性指征的中和抗體的研發(fā)中是必要的。所有4種IgG同 種型均與Fc受體Fc. γ . RI、Fc. γ . RIIA和Fc. γ . RIIIA結(jié)合，并激活Fc受體Fc. γ . RI、 Fc. Y.RIIA和Fc. Y.RIIIA。由于Fc. Y.RIIB為抑制性受體，所以抗體與該受體結(jié)合不會 激活補體和細(xì)胞應(yīng)答。Fc. Y.RI為以單體形式與IgG結(jié)合的高親和性受體。Fc. Y.RIIA、 和Fc. γ . RIIIA為僅以多聚體形式與IgG結(jié)合并具有稍低親和性的低親和性受體。因此， 需要大量的IgG抗體來產(chǎn)生免疫源性應(yīng)答。
[0013] 本文中"野生型或WT"是指自然界發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因 變體。WT蛋白質(zhì)具有具有未經(jīng)特異修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0014] 去糖基化-已知IgG抗體Fc區(qū)的去糖基化會干擾抗體的效應(yīng)器功能。Fc區(qū)的去 糖基化可以以多種方式完成。一種所述的方式是通過Fc區(qū)的CH2部分內(nèi)在位置297處氨 基酸（天冬氨酸）的突變。該位置似乎為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4中天冬氨酸297處的單 一保守位點。與該糖基化位點連接的糖鏈對于IgG效應(yīng)器功能而言是重要的。晶體學(xué)研究 證明碳水化合物鏈在2個相對的CH2結(jié)構(gòu)域之間形成的橋。去糖基化的IgG不再與FcyR 或Clq結(jié)合，因此不會引發(fā)ADCC和經(jīng)典的補體激活途徑。
[0015] 許多報告顯示，調(diào)節(jié)與FcyRIIIA結(jié)合的IgG對于生成用于腫瘤抑制的治療性mAb 是重要的。在小鼠模型中，治療性mAb必須存在激活的FcyR來控制腫瘤的進程并增加存活 率。因此，在抗癌治療方面，已經(jīng)廣泛探索修飾人類IgGl的糖基化譜的策略。Fc受體（FcyR) 連接細(xì)胞與體液的免疫應(yīng)答。通過IgG的Fc區(qū)刺激表達(dá)這些受體的細(xì)胞具有引人注意的 結(jié)果，包括ADCC、ADCP、經(jīng)典的激活途徑、氧爆作用及炎癥中間體的釋放。IgGl對經(jīng)典激活 途徑和Fc效應(yīng)器功能具有強烈的影響。除去IgGl同種型Fc區(qū)的糖基化會極大地減少經(jīng) 典激活途徑。Fc介導(dǎo)的效應(yīng)器功能可以通過在Fc區(qū)內(nèi)引入所選的定點突變而降低。如發(fā) 明詳述中所討論的那樣，F(xiàn)c介導(dǎo)的效應(yīng)器功能的降低還可以通過使用另一種同種型的Fc 區(qū)取代IgGl同種型的Fc區(qū)來實現(xiàn)。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方案中，改造抗體包括在位置297處的突變，其阻止了在該 位點處的糖基化。位置297處的天冬氨酸可以被不會導(dǎo)致N-連接的糖基化的氨基酸殘基 替代?？梢宰R別一部分所述的這種氨基酸為丙氨酸和谷氨酸。阻止糖基化會阻止不理想的 效應(yīng)器的功能。
[0017] 用于阻止Clq結(jié)合&補體激活的現(xiàn)有方法-Clq與Clr和Cls形成了 C1復(fù)合物， 其為補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC)途徑的第一成分。效應(yīng)器功能為全長IgG的固有性質(zhì)， 并且在中和特異性蛋白質(zhì)的治療性單克隆抗體中必須受到下調(diào)節(jié)/抑制。在現(xiàn)有技術(shù)范圍 內(nèi)，有3種不同的策略來降低抗體的效應(yīng)器功能：1)位于Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸的突變，這 些氨基酸涉及效應(yīng)器結(jié)合的相互作用；2)除去Fc區(qū)，并使用聚乙二醇（PEG)綴合物替代Fc 區(qū)；以及3)使用IgG4抗體的Fc區(qū)替代IgG2抗體的Fc區(qū)（創(chuàng)建雜交同種型）。體外試驗 已經(jīng)用于證明Clq與抗體的結(jié)合。
[0018] 通過N297處的定點突變?nèi)ヌ腔?已經(jīng)顯示糖基化會誘導(dǎo)經(jīng)典激活途徑，這 會導(dǎo)致炎癥中間體（包括C3a、C5a、C5b-9)以及一系列有害的白細(xì)胞介素（包括IL-1和 TNF-α)的形成。這種多余的經(jīng)典補體激活途徑可以通過將位置297處的天冬氨酸（N)突 變成丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而降低。去糖基化的IgGl抗體會減少Clq的結(jié)合（示于 表1中）。這種去糖基的抗體還可以通過利用酶和/或化學(xué)的去糖基化而形成。宿主細(xì)胞 可以是細(xì)菌、哺乳動物病毒或酵母。去糖基抗體或抗體衍生物在轉(zhuǎn)基因哺乳動物（其在牛 奶中表達(dá)抗體）中生產(chǎn)，從而有利于大規(guī)模地生產(chǎn)去糖基的抗體。幾乎所有市場化的抗體 均為IgGl。
[0019] 通過PEG取代去糖基化-使用聚乙二醇（PEG)綴合物替代Fc區(qū)會降低效應(yīng)器功 能，而且還會減小抗體的半衰期。因此，該方法在具有更慢性指征的治療性抗體中是不理想 的。
[0020] 通過同種型雜交體去糖基化-盡管IgG2和IgG4抗體是糖基化的，但是它們固有 地降低補體的激活并減少Fc結(jié)合（參見表1)。這些觀察表明這些同種型包括具有氨基酸序 列或蛋白質(zhì)基元的Fc區(qū)，這證明了降低的Fc效應(yīng)器功能和補體依賴的細(xì)胞毒作用。為了進 一步降低這些同種型的效應(yīng)器功能，如同IgG2m4和IgG2m3抗體一樣，將去糖基化的突變引 入到IgG2抗體的Fc區(qū)。這些抗體證明了甚至進一步降低的效應(yīng)器功能。位置234/235/237 在介導(dǎo)Fc應(yīng)答中似乎是重要的，由此已經(jīng)由V/A/G突變?yōu)锳/A/A。此外，諸如330/331之類 的其他突變似乎也是重要的，并被許多研究組廣泛研究。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明新生成的抗體具有完整的FcRn結(jié)合區(qū)及保持的半衰 期。效應(yīng)器功能降低且Clq結(jié)合能力降低的抗體為這樣的抗體，與未突變的天然IgG相比， 所述的抗體對Fc受體1、11和III的結(jié)合親和性降低，且ADCCXDC及Clq降低。本發(fā)明包 括一種方法，其會降低效應(yīng)器的功能，同時保持半衰期，其中改造的抗體會結(jié)合FcRn，但不 會結(jié)合Clq。所述的此類抗體具有保持的半衰期，但不會激活經(jīng)典途徑。
[0022] 如本文所述，IgG的Fc區(qū)、特別是本發(fā)明的CH2區(qū)可以用于生產(chǎn)任何非免疫刺激 性抗體或抗體樣蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)（包括人源化的和治療性抗體），并且可以用于阻止Fc 受體的結(jié)合，或者與補體蛋白質(zhì)的結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員生成并生產(chǎn)的抗體包括但不限 于它們的多克隆或單克隆抗體、嵌合或人類抗體、人源化的或人類中和抗體、雙特異性或單 鏈抗體。本發(fā)明的抗體可以具有附著于其上的其他部分，例如微球體、微粒子或聚乙二醇化 的分子可以附著在抗體或抗體片段上。
[0023] N297突變阻止IgGl的糖基化-目前公開的技術(shù)描述了 N297突變在阻止IgGl的 糖基化、并由此降低IgGl的效應(yīng)器功能中的有效性。與IgGl相比，IgG2固有地降低了補 體激活途徑、ADCC和Fc效應(yīng)器功能，如圖1所示。因此，除去糖基化應(yīng)該會進一步降低補 體的激活、ADCC活性劑Fc受體的結(jié)合。因此，本發(fā)明靶向于如同IgG2固有地降低效應(yīng)器 功能及補體激活的、具有297突變的IgG2同種型。通過297突變而除去糖基化，可以進一 步降低Clq的結(jié)合和效應(yīng)器功能。突變可以包括不會導(dǎo)致天冬氨酸（asp)被糖基化的任何 氨基酸。
[0024] IgGl的CH2區(qū)內(nèi)的突變-已經(jīng)識別IgGl的CH2區(qū)內(nèi)的一系列突變。公開的突 變涵蓋整個CH2區(qū)。難以選擇一種可以得到所需的降低的⑶C、ADCC和Fc受體的結(jié)合的 突變。本發(fā)明要求形成特異性刪除了 CH1的抗體的權(quán)利，其中所述的抗體會降低CDC、ADCC 和Fc受體（不包括FcRn)的結(jié)合。在之前的發(fā)明涉及突變?yōu)镮gGl同種型的條件下，本發(fā) 明將這些突變應(yīng)用于IgG2同種型?？梢允褂肅H2刪除方法來構(gòu)建這些抗體，其中大部分的 Fc效應(yīng)器突變位于IgG的CH2區(qū)中。此外，這種刪除還生成了去糖基化的抗體，這是由于 N297為CH2結(jié)構(gòu)域的一部分。N297是指位置297處（Kabat編號）的天冬氨酸，其被Q或 Ala替代。
[0025] 具有4個IgG2m4的IgG2抗體-之前的發(fā)明要求被稱為IgG2m4的具有4個突變 的糖基化IgG2抗體的權(quán)利。這種突變的IgG2m4構(gòu)建體是基于IgG2和IgG4序列。由IgG4 得到的一些天然發(fā)現(xiàn)的序列被引入到IgG2序列中。這種突變的IgG2似乎阻止了 Fc效應(yīng)器 功能，包括Clq結(jié)合和Fc受體的結(jié)合。Merk(USPT0#7700099)描述了效應(yīng)器能夠被降低的 糖基化IgG2抗體的用途。與去糖基化的IgGl抗體相似的突變會進一步降低Fc應(yīng)答。IgG2 的CH1序列與IgGl的CH1序列不同。但是，可以使用由IgGl、IgG3和IgG4得到的CH1，并 與由IgG2或IgG4序列衍生得到的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3連接。本發(fā)明（本申請）得到抗體 雜合體，其中IgGl抗體的可變區(qū)與IgG2或IgG抗體的下方恒定區(qū)（包括Fc)結(jié)合。CH2結(jié) 構(gòu)域在以下殘基234, 235, 230, 237, 268, 297, 309, 330和331的一個或多個殘基處具有突變 (或不包括突變），從而生成IgGl/IgG2或IgGl/IgG4雜交體。
[0026] 附圖簡述
[0027] 圖1為不同IgG同種型的特征的表，其比較了正常的性質(zhì)、結(jié)合及效應(yīng)器功能活 性。
[0028] 圖2描述了 IgG2野生型（WT)與底物結(jié)合的抗原的結(jié)合?？贵w以高親和性與其目 標(biāo)抗原結(jié)合。
[0029] 圖3描述了去糖基化的IgG2 (297突變）與底物結(jié)合的抗原的結(jié)合。去糖基化的 IgG2抗體以高親和性與其目標(biāo)抗原結(jié)合。
[0030] 圖4描述了 IgGl和IgG2的去糖基化的IgG2 (297突變）雜交體與底物結(jié)合的抗 原的結(jié)合。去糖基化的雜交體抗體以高親和性與其目標(biāo)抗原結(jié)合。
[0031] 圖5描述了正常人類血清中，IgG(297突變）對備選途徑的抑制。去糖基化的雜 交體抗體與備選途徑的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合并中和該蛋白質(zhì)。
[0032] 圖6描述了正常人類血清中，具有297突變的IgGl/IgG2雜交體對備選途徑的抑 制。雜交體抗體與備選途徑的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合并中和該蛋白質(zhì)。
[0033] 圖7描述了正常人類血清中，具有297突變的IgGl/IgG2雜交體對經(jīng)典途徑的抑 制或激活的缺乏。雜交體抗體不會影響經(jīng)典途徑的活性。
[0034] 圖8描述了正常人類血清中，具有IgG2Fc區(qū)（其具有297突變）的抗體對經(jīng)典途 徑的抑制或激活的缺乏。去糖基化的IgG2抗體會結(jié)合但不會影響經(jīng)典途徑的活性。
[0035] 圖9證明了在正常人類血清中，IgGl/IgG2雜交體抗體不會結(jié)合Clq。Clq被用作 Clq的來源。Avastin被用作以高親和性與Clq結(jié)合的陽性對照。
[0036] 圖10證明了在正常人類血清中，去糖基化的IgG2 (297突變）抗體不會結(jié)合Clq。 人類血清被用作Clq的來源。Avastin被用作以高親和性與Clq結(jié)合的陽性對照。
[0037] 圖11證明了糖基化的IgGl抗體以高親和性與目標(biāo)抗原備解素結(jié)合。
[0038] 圖12證明了去糖基化的IgGl (297突變）抗體以高親和性與目標(biāo)蛋白質(zhì)備解素結(jié) 合。
[0039] 圖13證明了糖基化的IgGl抗體會抑制AP的激活。
[0040] 圖14證明了去糖基化的IgGl (297突變）抗體會抑制AP的激活。
[0041] 圖15證明了在正常的人類血清中，去糖基化的IgGl (297突變）抗體不會結(jié)合 Clq。糖基化的抗體會結(jié)合Clq。
[0042] 圖16證明了去糖基化的IgGl (297突變）不會結(jié)合Fc. γ · RI蛋白質(zhì)。
[0043] 圖17證明了去糖基化的IgGl (297突變）抗體不會結(jié)合Fc. Y.RIII蛋白質(zhì)。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 定義
[0046] 除非本文中特意說明，否則該文件中使用的所有術(shù)語都具有如同本發(fā)明領(lǐng)域的那 些普通技術(shù)人員所理解的相同的含義。為了清楚起見，提供以下定義，并將它們的預(yù)期含義 定義為如同描述本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中所用的那樣。
[0047] "抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用"（"ADCC"）是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá) FcyR的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞識別并導(dǎo)致具有結(jié)合抗體的目標(biāo)細(xì)胞的溶解。
[0048] "抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用"("ADCP"）是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)FcyR 的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別并導(dǎo)致具有結(jié)合抗體的目標(biāo)細(xì)胞的吞噬作用。
[0049] "去糖基化的"是指具有羥基或未附著于糖基化基團上的其他官能團的抗體。也稱 為不具有碳水化合物殘基的抗體。
[0050] 如本文所用，術(shù)語"抗體"是指由生產(chǎn)抗體的任何哺乳動物（例如小鼠、大鼠、兔子 和靈長動物，包括人）衍生得到的抗體或其抗體片段，其特異性地與備選途徑的特異性蛋 白質(zhì)結(jié)合。示例性的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體；多特異性抗體（例如雙 特異性抗體）；人源化的抗體；鼠抗體；嵌合、鼠-人、鼠-靈長動物、靈長動物-人單克隆抗 體；以及抗獨特型抗體，并且可以為任何完整的分子或其片段。
[0051] "抗體片段"是指由全長抗體衍生的或者與全長抗體相關(guān)的部分，通常包括抗原結(jié) 合或其可變區(qū)（參見"抗原結(jié)合片段"）。術(shù)語"抗體片段"是指由全長抗體衍生的部分，通 常包括抗原結(jié)合及其可變區(qū)。其他抗體包括由抗體片段形成的雙價抗體、線性抗體、單鏈抗 體分子和多特異性抗體。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab'）2、Fv片段或scFv 片段。
[0052] 抗體的"抗原結(jié)合片段"（或"抗原結(jié)合區(qū)"）是指完整抗體的一個或多個片段，其 中所述的抗體保持了與給定抗原特異性結(jié)合的能力。可以通過完整抗體的片段來進行抗體 的抗原結(jié)合功能，其中所述的抗體包括互補決定區(qū)（CDR)?？乖Y(jié)合片段的實例：
[0053] "Fab"片段（具有VH和VL的單鏈可變區(qū)）；
[0054] "單價片段"（由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段）；
[0055] "F (ab'）2"片段（包括2個Fab片段的二價片段，其中所述的2個Fab片段是通過 在絞鏈區(qū)的-硫鍵連接的）；
[0056] "Fd"片段（其由抗體的VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成）；
[0057] "Fv"片段（其由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成）；
[0058] 單一結(jié)構(gòu)域抗體（"dAb"），其由VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域組成；
[0059] 分離的互補決定區(qū)（"⑶R"）。
[0060] ⑶R(抗原結(jié)合片段）還可以被引入到單一結(jié)構(gòu)域抗體、大抗體、小抗體、內(nèi)抗體、 雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR抗體和bis-scFv?？贵w的抗原結(jié)合片段可以被接枝 到基于多肽（例如III型纖維連接蛋白Fn3)的構(gòu)架上?？乖Y(jié)合片段可以被引入到包括 一對串聯(lián)的Fv節(jié)段（VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，其中所述的節(jié)段與互補的輕鏈多肽一 起形成了一對抗原結(jié)合區(qū)。
[0061] 如本文所用，"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些 結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。
[0062] "補體依賴的細(xì)胞毒作用""⑶C"）是指由于補體系統(tǒng)激活及MAC形成所導(dǎo)致的 細(xì)胞溶解。⑶C作為效應(yīng)器功能，由Fc與Clq結(jié)合而引發(fā)。
[0063] "嵌合抗體"為重組蛋白質(zhì)，其包括由得自非人類物種的動物衍生的可變結(jié)構(gòu)域和 CDR，而所述的嵌合抗體分子的剩余部分則由人類抗體衍生得到。使用人類恒定區(qū)替代抗體 的非結(jié)合區(qū)能夠使嵌合抗體在識別并結(jié)合目標(biāo)抗原中保持其特異性，同時在人類中具有降 低的抗原性（與最初的小鼠抗體相比）。
[0064] "經(jīng)典途徑"是指由抗體-抗體復(fù)合物引發(fā)并需要C1Q激活的補體。經(jīng)典途徑的傳 播可以需要或不需要備選途徑的擴增環(huán)。
[0065] "互補決定區(qū)（⑶R) "是抗體重要的結(jié)合區(qū)。在2條重鏈和2條輕鏈可變區(qū)的每個 可變區(qū)內(nèi)通常都可以發(fā)現(xiàn)3個⑶R。就位置而言，⑶R可以是變換位置的，從而創(chuàng)建了特定 的結(jié)合親和性。還可參見"抗原結(jié)合片段"。
[0066] "效應(yīng)器功能"是指有助于抗體的天然Fc區(qū)的那些生物活性，并隨抗體同種型的不 同而改變?？贵w效應(yīng)器功能的實例包括：Clq結(jié)合及補體依賴的細(xì)胞毒作用；Fc受體的結(jié) 合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC);吞噬作用；下調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體（例如B細(xì) 胞受體）；表達(dá)Fc受體的血小板激活的缺乏；以及B細(xì)胞的激活。為了減小或消除治療性 抗體的副作用，優(yōu)選的是減小或消除效應(yīng)器功能。
[0067] 就所述的這些應(yīng)用而言，"不理想的效應(yīng)器功能"包括ADCC、⑶C、經(jīng)典的激活途徑、 細(xì)胞激活以及抗體介導(dǎo)的炎癥。
[0068] "改造的抗體"為非天然生產(chǎn)的抗體，其經(jīng)改變或創(chuàng)建，從而取得特定的目的或者 具有特定的特征。例如對野生型形式進行蓄意的修飾從而具有降低的效應(yīng)器功能的抗體為 改造的抗體。
[0069] 如本文所用，術(shù)語"Fc區(qū)"是指對給定抗原提供防御的抗體區(qū)域。
[0070] "抗體的第一部分"是指整個抗體的一部分（小于整個抗體的部分），其包括抗體 的抗原結(jié)合區(qū)。"抗體的第二部分"是指整個抗體的一部分（小于整個抗體的部分），其由 抗體的一部分組成，該部分未包括在第一部分中。
[0071] 術(shù)語"Fc受體"或"FcyR"描述了與IgG的Fc區(qū)結(jié)合的受體。"FcyRI"、"FCyRII" 及"FcyRIII"為FcyR的亞類。
[0072] 如本文所用，術(shù)語"降低的Fc效應(yīng)器功能"是指抗體的功能，其中所述的抗體不會 針對識別抗體的Fc區(qū)的抗原發(fā)生作用。降低的Fc效應(yīng)器功能的實例包括但不限于降低的 Fc與抗原的結(jié)合；針對抗原的Fc激活的缺乏；包括突變（阻止正常的Fc效應(yīng)器功能）的 Fc區(qū)；或者阻止血小板和具有Fc受體的其他細(xì)胞的激活。
[0073] "人類抗體"為這樣的抗體，其中抗體的所有成分均為人類起源的，包括構(gòu)架、CDR 和恒定區(qū)。術(shù)語"人源化的抗體"為非人類起源的抗體，其保持了非人類抗體的結(jié)合特異性， 同時在人類中具有較低的免疫源性。參見嵌合抗體和人源化抗體。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"免疫源性"是指抗原引發(fā)受試對象產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。
[0075] 對抗體、抗體片段和/或抗體的Fc區(qū)進行的"修飾"是指在蛋白質(zhì)的野生型多肽 序列中，一個或多個氨基酸的取代、插入或刪除。修飾的抗體、抗體片段和/或Fc區(qū)為其中 采用人工方法進行修飾的那些。
[0076] "親本抗體"為野生型或未修飾的抗體，由這些抗體衍生得到改造的抗體或抗體片 段。
[0077] "目標(biāo)抗原"是指抗體特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或其他化學(xué)化合 物。
[0078] "治療性中和抗體"是指這樣的任何抗體，其經(jīng)研發(fā)將靶向特定蛋白質(zhì)并預(yù)計/預(yù) 期在給與該抗體的受試對象中具有治療作用。
[0079] 本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0080] 本發(fā)明中，我們描述了具有改造的重鏈恒定區(qū)的重組單克隆治療性抗體，該抗體 可表征為不理想的效應(yīng)器功能被降低，例如ADCC、CDC、經(jīng)典的激活途徑和抗體引發(fā)的炎癥。 我們的目標(biāo)是設(shè)計并研發(fā)不理想的效應(yīng)器功能被降低的效應(yīng)器功能。在一個實施方案中， 本發(fā)明為其中位置N297處的氨基酸被修飾的、去糖基化的IgG2同種型抗體。在另一個實施 方案中，本發(fā)明為具有修飾的Fc區(qū)的去糖基化的IgGl/IgG2雜交體。這些抗體不會與Clq 結(jié)合，因此不會激活經(jīng)典途徑。
[0081] 文獻綜述表明效應(yīng)器功能的降低可以通過以下3種方式來完成：
[0082] 1)通過產(chǎn)生缺乏完整的Fc區(qū)的抗體；
[0083] 2)通過在IgGl同種型抗體的Fc區(qū)內(nèi)進行突變；以及
[0084] 3)形成雜交同種型抗體，其中由IgG2同種型得到的Fab部分與由IgG4同種型得 到的 Fc 區(qū)連接（EP1635872 A2)。
[0085] 完全缺乏Fc區(qū)（上述方法2)的抗體的血清半衰期會降低。使用此類抗體進行治 療在臨床上需要頻繁的定量給藥，從而在慢性情況下取得效力。有多種臨床指征，在臨床上 對這些指征進行所述的頻繁定量給藥并非是不可能，但是不切實際的。盡管具有修飾的Fc 區(qū)的IgGl抗體未顯示出降低的效應(yīng)器功能，但是IgGl同種型并非是降低效應(yīng)器功能的理 想的同種型。雜交IgG2m4同種型抗體（上述方法3)顯示效應(yīng)器功能有一些降低。IgG2和 IgG4同種型是極相似的，因此相對容易研發(fā)出IgG2/IgG4雜交體。本發(fā)明的雜交抗體證明 效應(yīng)器功能甚至進一步降低。
[0086] 在本發(fā)明的一個實施方案中，IgG2同種型的Fc區(qū)經(jīng)修飾而產(chǎn)生具有降低的效應(yīng) 器功能的去糖基化的抗體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，IgG2或IgG3同種型的天然或 修飾的Fc區(qū)域與由IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型得到的可變區(qū)結(jié)合。本發(fā)明為通過在 IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc區(qū)內(nèi)進行定點突變和/或重組改造來生產(chǎn)雜交同種型（其中 Fc區(qū)衍生自IgG2、IgG3或IgG4抗體），從而制備和使用去糖基化的抗體。此類抗體具有降 低的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)、Fcy受體結(jié)合及補體依賴的細(xì)胞毒作用 (CDC)。Fc區(qū)內(nèi)的天冬氨酸（N)突變?yōu)楸彼岷?或谷氨酸會降低抗體的C1Q結(jié)合性。 [0087] 本發(fā)明涵蓋了具有以下構(gòu)造的非雜交和雜交抗體：
[0088] 1)抗體的第一部分得自IgGl、IgG3或IgG4,而Fc區(qū)得自野生型IgG4或去糖基化 的IgG4冋種型；
[0089] 2)抗體的第一部分得自IgG2,而Fc區(qū)得自去糖基化的IgG2、IgG3或IgG4 ;
[0090] 3)抗體的第一部分得自IgGl，而Fc區(qū)得自未修飾的IgG2、IgG3、IgG4,以及
[0091] 4)抗體的第一部分得自IgG4,而Fc部分得自去糖基化的及糖基化的IgGl、IgG2、 IgG3。
[0092] 通過在Fc區(qū)內(nèi)位置297處的突變使IgGl去糖基化在本領(lǐng)域中已經(jīng)有所描述。此 類抗體已經(jīng)顯示在體內(nèi)具有較長的半衰期。此外，它們還被描述為顯示出降低的C1Q結(jié)合、 降低的Fc結(jié)合以及降低的效應(yīng)器功能。
[0093] 術(shù)語"Fc受體"及"FcyR"描述了與IgG的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcyR為FcyRI、 FcyRII和FcyRIII亞類。FcyRII受體包括FcyRIIA( "激活受體"）和FcyRIIB( "抑制受 體"）。本發(fā)明分離的非免疫刺激性抗體伴隨而來的是不能與Clq結(jié)合。
[0094] 在具體的實施方案中，本發(fā)明并入了 IgG2、IgG3或IgG4的Fc區(qū)氨基酸序列的基 本部分。免疫球蛋白的Fc區(qū)通常涵蓋了 2個恒定結(jié)構(gòu)域CH2和CH3。如本文所用，"IgG2 的Fc區(qū)的基本部分"是指80%至98%的Fc區(qū)的氨基酸序列為天然IgG2。ADCC、CDC、Fc結(jié) 合及Clq結(jié)合的降低是通過使IgG2Fc區(qū)的所選氨基酸殘基突變而取得的。CH2結(jié)構(gòu)域由氨 基酸231延伸至氨基酸340。在具體的實施方案中，IgG2Fc區(qū)包括在氨基酸殘基297、234、 235和331處的氨基酸殘基突變。此外，去糖基化的IgG2的非糖基化Fc區(qū)除了 N297突變 以外，還可以包括在氨基酸殘基H268Q、V309L、A330S和P331S處的突變。在297、234、235 和331處具有突變的本發(fā)明的IgG2Fc區(qū)可以用于生產(chǎn)具有降低的Fc效應(yīng)器和Clq結(jié)合的 抗體和/或融合蛋白質(zhì)，而不會影響抗體的FcRn和其他藥理學(xué)性質(zhì)。此外，突變的這些組 合還可以被引入到它們的多克隆或單克隆抗體，嵌合或人類抗體，人源化的、中和的、雙特 異性的或單鏈抗體。本發(fā)明的抗體可以具有附著于其上的其他部分。
[0095] 本發(fā)明的抗體或抗體樣分子可以作為藥物組合物或藥劑的成分給與。藥物組合物 或藥劑通常包括活性治療劑以及多種其他藥物可接受的成分。
[0096] 雜奪抗體和融合蛋白質(zhì)
[0097] 此外，還可以使用本發(fā)明所建議的IgG的改變的恒定區(qū)來制備抗體融合蛋白 質(zhì)。可以使用連接體或不使用連接體，將抗體的抗原結(jié)合區(qū)（例如Fab、F(ab)2、SCFv)與 CH2-CH3融合。還可以使用本領(lǐng)域已知的其他連接體。此外，本發(fā)明還描述了其中CH2被 CH1替代的融合蛋白質(zhì)。CH1區(qū)是溫和的，并且不會導(dǎo)致不理想的Fc效應(yīng)器功能。由于CH3 結(jié)構(gòu)域中的FcRn結(jié)合區(qū)，所述的分子的半衰期將保持與在它們的原始位置具有CH2和CH3 的分子相似。此外，還制備并生產(chǎn)CH1和CH2區(qū)被刪除的抗體。本發(fā)明涵蓋以下抗體：
[0098] 1)去糖基化的IgG2和IgG4抗體。去糖基化是由于297位置處的突變所導(dǎo)致的。
[0099] 2)包括H268Q、V309L、A330S和P331S突變的去糖基化的IgG2,其將效應(yīng)器功能降 低超過至去糖基化的IgG2的基線設(shè)定以外。
[0100] 3)去糖基化的IgGl和IgG4雜交體，其中CH1得自IgGl或IgG3,而CH2和CH3得 自IgG2或IgG4。IgG4中的297殘基由N297突變?yōu)锳297。
[0101] 4)其中使用CH1結(jié)構(gòu)域替代CH2結(jié)構(gòu)域從而使構(gòu)建體為F(ab) 2-CH1-CH3的抗體。
[0102] 在4)中，在Fab和CH1之間以及CH1和CH2之間加入連接體。最終的構(gòu)建體應(yīng)該 具有以下（或相似的）結(jié)構(gòu)之一：a)Fv-CHl-連接體-CH1-連接體-CH3 ;或b)Fv-CHl-連 接體-CH2-連接體-CH3。CH1為非活性的恒定區(qū)，因此用于形成具有較長半衰期的延長的 Fab。連接體可以多種類型，特別是本領(lǐng)域已知的那些，例如（GGGGS)n。可以通過本領(lǐng)域已 知的任何連接體（例如那些（GGGGS)n)將融合蛋白質(zhì)和/或抗原結(jié)合片段、或任何受體蛋 白質(zhì)多肽固定至CH2-CH3上?？梢杂山Y(jié)構(gòu)a)和b)制備多種修飾和組合，例如改變連接體 在Fv、CHI、CH2和CH3之間的位置。連接體的存在和缺乏可以創(chuàng)建具有較長半衰期的所關(guān) 注的分子。Fc融合將抗體的Fc區(qū)（并由此形成有力的效應(yīng)器功能和藥代動力學(xué)）與受體、 配體或一些其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的靶物結(jié)合區(qū)結(jié)合。由于Fc融合為與抗體具有功 能重疊部分，因此，本發(fā)明包括Fc融合物。
[0103] 對于AP中和抗體而言，特別重要的是介導(dǎo)的Fc應(yīng)答被減小并且Clq結(jié)合被抑制。 我們的目標(biāo)是形成具有降低的Fc和Clq結(jié)合的治療性AP中和抗體，從而作為完全除去Fc 區(qū)的備選方法。目前很多報告顯示Fc區(qū)（CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）內(nèi)的單點或多點突變可以降 低抗體與Fc受體及Clq的結(jié)合，由此將此不理想的效應(yīng)器功能，而不會損害抗體的血清壽 命。具有此類修飾的抗體可以用于研發(fā)靶向AP的任何治療性抗體，該抗體將中和AP而不 會激活CP (通過效應(yīng)器功能）。IgG2的去糖基化從未被描述用于阻止CP激活及抗體的其 他Fc效應(yīng)器功能。這是本發(fā)明的創(chuàng)新。
[0104] 實施例1
[0105] 與目標(biāo)蛋白質(zhì)各解素的結(jié)合親和件
[0106] 野生型IgG2、去糖基化的IgG2以及去糖基化的IgGl/IgG2雜交抗體以高親和 性與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。在常規(guī)測試中，使用處于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中的人類因子 P(Complement Technologies, San Diego, CA)涂敷聚苯乙烯微滴定板，并過夜。在吸出因 子P溶液后，在室溫下使用包括1 %牛血清白蛋白（BSA) (Sigma Chemical Company, St. L〇uis，M〇.)的PBS將各孔封閉2小時。未涂敷因子P的孔作為背景對照。將處于封閉溶 液中的各種濃度的研究抗體的等分液加入到因子P涂敷的孔中，并允許平板靜置1小時，從 而使單克隆抗體與結(jié)合有因子P的基底結(jié)合。使用PBS洗滌平板，并通過加入過氧化物酶 綴合的山羊抗人單克隆抗體（檢測抗體）（American Qualex)(在封閉溶液中以1:2000稀 釋）（允許在室溫下溫育1小時）檢測因子P結(jié)合的單克隆抗體。使用PBS洗滌平板后，加 入 100 μ 1 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底物（Kirkegaard&Perry Laboratories, Gaith ersburg, Md.，Cat. No. A50-65-00)。在 25°C下溫育 10 分鐘后，通過加入 100 μ 1 磷酸使 TMB 的反應(yīng)猝滅，并在微板讀取器上在450nm下讀取平板（例如SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)〇
[0107] 所有3種類型的IgG2抗體（IgG2野生型、具有297突變的IgG2以及具有297突 變的IgGl/IgG2雜交體）分別如圖2、3和4所示以高親和性與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。如圖11 和12中所示，糖基化的IgGl以及具有297突變的去糖基化的IgGl以低皮摩爾的親和性與 目標(biāo)蛋白質(zhì)解備素結(jié)合。
[0108] 實施例2
[0109] 證明各詵激活涂徑（AP)的抑制的牛物測試
[0110] 為了評估本發(fā)明的示例性化合物在類體內(nèi)系統(tǒng)中抑制AP激活的能力，采用紅細(xì) 胞溶血測試。兔紅細(xì)胞（rRBC)與正常人類血清（NHS)在能夠產(chǎn)生AP的緩沖劑中溫育。 rRBC( "外來物體"）的存在優(yōu)選地誘導(dǎo)了 AP的激活，使得C5b-9沉積在紅細(xì)胞上，并最終 導(dǎo)致細(xì)胞溶解?；?00nm光密度下的光散射來檢測細(xì)胞溶解的程度。
[0111] 將兔紅細(xì)胞（rRBC)引入到10%人類血清（具有Mg2+/EGTA)中呈現(xiàn)為引入了外源 細(xì)胞表面，該表面引發(fā)了備選的補體級聯(lián)反應(yīng)。AP的激活導(dǎo)致MAC的形成，這使得外源細(xì) 胞（rRBC)溶解。本發(fā)明所選的抗體會阻止這些紅細(xì)胞溶解。在通過檢測由完整紅細(xì)胞所 導(dǎo)致的光散射后，對上述過程進行定量。
[0112] 已經(jīng)良好的建立的是兔紅細(xì)胞會特異性地激活A(yù)P，并通過C5b_9 (MAC)復(fù)合物使 得rRBC最終溶解。在700nm下測量光散射的程序性降低（由于完整細(xì)胞溶解所導(dǎo)致）， 其在溫度控制的ELISA平板讀取器中作為時間的函數(shù)。使用SpectraMax 190平板讀取器 和SoftMax Pro軟件記錄和分析數(shù)據(jù)。使用MicroCal Origin軟件繪制結(jié)果。如圖6和7 所示，去糖基化的抗體（具有297突變的IgG2)和去糖基化的雜交抗體（具有297突變的 IgGl/IgG2)會抑制AP的激活。如圖13和14所示，糖基化的IgGl及具有297突變的去糖 基化的IgGl會以相似的效力抑制備選的激活途徑。
[0113] 實施例3
[0114] 去糖某化的抗體不會抑制或激活經(jīng)A的涂徑
[0115] 根據(jù)已知的文獻，已知IgG2(未改變的）會激活補體途徑-參見圖1。為了檢驗抗 體對CP的作用，將抗體致敏的綿羊紅細(xì)胞（sRBC)與1%正常人類血清在CP緩沖劑（Ca2+/ Mg2+)中溫育。這些sRBC會激活CP，這會誘導(dǎo)細(xì)胞膜的溶解。細(xì)胞膜溶解導(dǎo)致細(xì)胞散射 的光逐漸降低。當(dāng)在37°C下將本發(fā)明備選途徑的特異性抗體與sRBC在具有緩沖劑（包括 Ca2+和Mg2+) ( "CP緩沖劑"）的1% NHS中溫育時，在溶血開始至以最大溶血為結(jié)束的時 間段內(nèi)，未觀察到溶血作用。這表明備選途徑的中和IgG2抗體在NHS中不會影響CP溶血 活性（數(shù)據(jù)未示出）。在700nm下測量光散射（由于完整細(xì)胞溶解所導(dǎo)致），其為時間的函 數(shù)。經(jīng)典途徑的激活不會升至100%對照水平以上，表明去糖基化的抗體及去糖基化的雜交 IgGl/IgG2抗體都不會激活經(jīng)典途徑。相反，已知IgGl本身會激活經(jīng)典途徑。
[0116] 實施例4
[0117] 與補體Cla的結(jié)合親和件
[0118] Clq與抗體結(jié)合作為抗體的效應(yīng)器功能開始了經(jīng)典的補體激活途徑。Clq結(jié)合的 程度隨著抗體的類型而改變，并且發(fā)現(xiàn)與IgGl同種型結(jié)合的程度比與IgG2同種型結(jié)合的 程度更高。此外，補體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC)也是通過Clq結(jié)合介導(dǎo)的。因此，抗體與Clq 結(jié)合的越多，CP激活和CDC活性越高。同樣，Clq結(jié)合的缺乏與CDC活性的缺乏直接相關(guān)。使 用結(jié)合測試來評價所有查詢抗體的結(jié)合情況。在4°C下，使用處于PBS中的2μ g/mL抗體過 夜涂敷結(jié)合有培養(yǎng)基的96孔板。在與磷酸鹽緩沖鹽水pH7. 4溫育的各步驟之后洗滌平板， 并在室溫下進行溫育。涂敷后，使用200 μ 1/孔的封閉溶液（1 % BSA處于PBS中）將平板封 閉1小時，并與各種濃度的正常人類血清溫育1小時，其中所述的血清包括內(nèi)源水平的Clq。 溫育并洗漆后，使用HRP綴合的山羊抗人Clq抗體（Complement Technology，Tyler，TX)及 TMB(Kirkegaard&Perry)作為底物，檢測結(jié)合的Clq。通過加入ΙΟΟμΙ 1M %504溶液終止 反應(yīng)。通過450nm下的吸光值來測量最終的信號（Spectramax 190and250)。
[0119] 如圖15所示，Avastin與Clq極其強烈地結(jié)合，這是由于這樣的事實：Avastin的 Fc結(jié)構(gòu)域被設(shè)計成以增強的⑶C活性與Clq結(jié)合。此夕卜，Humira還證明了顯著的Clq結(jié) 合。Humira的Fc區(qū)是未改變的。糖基化的IgGl還證明會與Clq結(jié)合。然而，去糖基化的 IgGl不與Clq結(jié)合，因此不會表現(xiàn)出⑶C活性。
[0120] 實施例5
[0121] 與Fc. Y.RI及Fc. Y.RIII蛋白質(zhì)的結(jié)合親和件
[0122] Fc效應(yīng)器功能對于細(xì)胞功能和細(xì)胞激活是重要的。就治療性抗體而言，重要的是 這些抗體不會導(dǎo)致細(xì)胞激活和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。已知IgGl同種型顯示以高的結(jié)合 親和性激活FcyRI受體。這種特定的同種型與FcyRII和RIII的結(jié)合親和性低于與FcyRI 的結(jié)合親和性。IgG2同種型對這些Fcy受體通常顯示低的結(jié)合親和性，如圖1所示。通 過制備IgGl和IgG2的去糖基化的亞型，ADCC活性可以被進一步降低。圖16顯示，去糖 基化的IgGl表現(xiàn)為對測試的FcyRI和FcyRIII受體不結(jié)合。在4°C下，使用Fc γ肽過夜 涂敷由Costar得到的結(jié)合有培養(yǎng)基的96孔板。在與磷酸鹽緩沖鹽水pH7. 4溫育的各步 驟之后洗滌平板，并在室溫下進行溫育。涂敷后，使用200 μ 1/孔的封閉溶液（1 % BSA處 于PBS中）將平板封閉1小時，并與各種濃度的抗體（處于封閉溶液中）溫育1小時。溫 育并洗漆后，使用HRP綴合的山羊抗人Clq抗體（Complement Technology, Tyler, TX)及 TMB(Kirkegaard&Perry)作為底物，檢測結(jié)合的抗體。通過加入ΙΟΟμΙ 1Μ !12304溶液終止 反應(yīng)。通過450nm下的吸光值來測量最終的信號（Spectramaxl90and250)。
[0123] 如圖16和17所示，去糖基化的抗體顯示未與Fc受體結(jié)合。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于降低與治療性中和抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、抗體介導(dǎo)的經(jīng)典激 活途徑和炎癥的方法，該方法包括：向受試對象給藥改造形式的抗體，該抗體包括具有第一 部分和第二部分的改造重鏈恒定區(qū)，其中所述的第一部分衍生自4種已知同種型（由IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4組成的一組同種型）的任意一種的一個或多個抗體，而所述的第二部分 衍生自一種或多種人類抗體，該抗體選自由IgGl、IgG2和IgG3組成的一組同種型，其中至 少一部分所述的給藥抗體得自除了 IgGl以外的抗體。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的給藥抗體是去糖基化的。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的去糖基化是通過使位置297處的天冬氨酸（N) 突變?yōu)楸彼幔ˋ)或谷氨酰胺（Q)而實現(xiàn)的。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的可變區(qū)衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型 的抗體，而所述的第一恒定區(qū)（CH1)衍生自同種型的抗體，該同種型不同于所述的第一恒 定區(qū)所衍生的同種型。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的CH2和CH3并非衍生自IgG4。
6. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗體與所述的人類補體系統(tǒng)的成分蛋白質(zhì)結(jié) 合。
7. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的抗體與所述的經(jīng)典途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的抗體與所述的備選途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
9. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的通過去糖基化的Fc改造會降低ADCC和CDC的 活性。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合。
11. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗體與生長因子結(jié)合。
12. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗體與趨化因子或趨化因子受體結(jié)合。
13. 權(quán)利要求7、8、9、11、12或13所述的方法，其中所述的抗體與可溶的或分泌蛋白質(zhì) 結(jié)合。
14. 權(quán)利要求7、8、9、11、12或13所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞表面的分子結(jié)合。
15. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的給藥抗體包括取自以下序列組中的一條序列 的結(jié)合區(qū)，其中所述的序列組由 SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10 組成。
16. -種用于降低與治療性中和抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、抗體介導(dǎo)的經(jīng)典 激活途徑和炎癥的方法，該方法包括：向受試對象給藥改造形式的抗體，該抗體包括：可變 區(qū)；由IgGl、IgG3或IgG4抗體得到的恒定區(qū)的一部分；以及由一種或多種人類IgG2抗體 衍生得到的經(jīng)改造的CH2和CH3區(qū)。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的給藥抗體是去糖基化的。
18. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的去糖基化是通過使位置297處的天冬氨酸 (N)突變?yōu)楸彼幔ˋ)或谷氨酰胺（Q)而實現(xiàn)的。
19. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的可變區(qū)衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種 型的抗體，而所述的第一恒定區(qū)（CH1)衍生自同種型的抗體，該同種型不同于所述的第一 恒定區(qū)所衍生的同種型。
20. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的CH2或CH3衍生自IgG2,但并非CH2和CH3 同時衍生自IgG2。
21. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗體與所述的人類補體系統(tǒng)的成分蛋白質(zhì)結(jié) 合。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的抗體與所述的經(jīng)典途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
23. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的抗體與所述的備選途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
24. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的通過去糖基化的Fc改造會降低ADCC和CDC 的活性。
25. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合。
26. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗體與生長因子結(jié)合。
27. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗體與趨化因子或趨化因子受體結(jié)合。
28. 權(quán)利要求21、22、23、25、26或27所述的方法，其中所述的抗體與可溶的或分泌蛋白 質(zhì)結(jié)合。
29. 權(quán)利要求21、22、23、25、26或27所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞表面的分子結(jié) 合。
30. -種用于降低與治療性中和抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、抗體介導(dǎo)的經(jīng)典激 活途徑和炎癥的方法，該方法包括：給藥改造形式的抗體，該抗體包括：可變區(qū)；由IgGl或 IgG2得到的恒定區(qū)的一部分；以及由一種或多種人類IgG4抗體衍生得到的去糖基化的CH2 和CH3區(qū)。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的給藥抗體的IgG4部分是去糖基化的。
32. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的去糖基化是通過使位置297處的天冬氨酸 (N)突變?yōu)楸彼幔ˋ)或谷氨酰胺（Q)而實現(xiàn)的。
33. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的可變區(qū)可以衍生自抗體IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4同種型。
34. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的可變區(qū)衍生自IgGl或IgG2同種型的抗體，而 所述的第一恒定區(qū)（CH1)衍生自同種型的抗體，該同種型不同于所述的第一恒定區(qū)所衍生 的同種型。
35. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的CH2或CH3衍生自IgG4,但并非CH2和CH3 同時衍生自IgG2。
36. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的抗體與所述的人類補體系統(tǒng)的成分蛋白質(zhì)結(jié) 合。
37. 權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的抗體與所述的經(jīng)典途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
38. 權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的抗體與所述的備選途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
39. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的通過去糖基化的Fc改造會降低ADCC和⑶C 的活性。
40. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合。
41. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的抗體與生長因子結(jié)合。
42. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的抗體與趨化因子或趨化因子受體結(jié)合。
43. 權(quán)利要求36、37、38、40、41或42所述的方法，其中所述的抗體與可溶的或分泌蛋白 質(zhì)結(jié)合。
44. 權(quán)利要求36、37、38、40、41或42所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞表面的分子結(jié) 合。
45. -種用于降低與治療性中和抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、抗體介導(dǎo)的經(jīng)典激 活途徑和炎癥的方法，該方法包括：向有需要的哺乳動物給藥改造形式的去糖基化的IgG2 抗體，以預(yù)防炎癥。
46. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的給藥IgG2抗體是通過位置297處的天冬氨酸 (N)突變?yōu)楸彼幔ˋ)或谷氨酰胺（Q)而去糖基化的。
47. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的抗體與所述的人類補體系統(tǒng)的成分蛋白質(zhì)結(jié) 合。
48. 權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的抗體與所述的經(jīng)典途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
49. 權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的抗體與所述的備選途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
50. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的通過去糖基化的Fc改造會降低ADCC和CDC 的活性。
51. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合。
52. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的抗體與生長因子結(jié)合。
53. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的抗體與趨化因子或趨化因子受體結(jié)合。
54. 權(quán)利要求47、48、49、51、52或53所述的方法，其中所述的抗體與可溶的或分泌蛋白 質(zhì)結(jié)合。
55. 權(quán)利要求47、48、49、51、52或53所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞表面的分子結(jié) 合。
56. -種用于降低與治療性抗體有關(guān)的、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞激活、經(jīng)典激活途徑和炎癥事 件的方法，其中所述的抗體特異性地靶向備選途徑的成分蛋白質(zhì)，所述的方法包括給藥改 造形式的所述的抗體，其中所述的給藥抗體的第一部分衍生自同種型IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4的一種或多種抗體，而第二部分衍生自選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4中的一種或多種 抗體。
57. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的去糖基化是通過位置297處的天冬氨酸（N) 突變?yōu)楸彼幔ˋ)或谷氨酰胺（Q)而實現(xiàn)的。
58. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的第二部分并非衍生自IgG4抗體。
59. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與所述的人類補體系統(tǒng)的成分蛋白質(zhì)結(jié) 合。
60. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與所述的經(jīng)典途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
61. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與所述的備選途徑的成分蛋白質(zhì)結(jié)合。
62. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的通過去糖基化的Fc改造會降低ADCC和CDC 的活性。
63. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合。
64. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與生長因子結(jié)合。
65. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的抗體與趨化因子或趨化因子受體結(jié)合。
66. 權(quán)利要求59、60、61、63、64或65所述的方法，其中所述的抗體與可溶的或分泌蛋白 質(zhì)結(jié)合。
67. 權(quán)利要求59、60、61、63、64或65所述的方法，其中所述的抗體與細(xì)胞表面的分子結(jié) 合。
68. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的給藥抗體的第一部分衍生自IgG2同種型，而 所述的第二部分衍生自IgG4同種型。
69. 權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的給藥抗體在所述的Fc區(qū)是去糖基化的。
70. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的給藥抗體包括取自以下一組序列之一的結(jié)合 區(qū)：SEQ ID#1, SEQ ID#2, SEQ ID#3, SEQ ID#4, SEQ ID#5, SEQ ID#6, SEQ ID#7, SEQ ID#8, SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
71. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的給藥抗體包括取自以下一組序列之一的結(jié)合 區(qū)：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
72. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的給藥抗體包括取自以下一組序列之一的結(jié)合 區(qū)：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
73. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的給藥抗體包括取自以下一組序列之一的結(jié)合 區(qū)：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
【文檔編號】C07K16/22GK104114187SQ201280069501
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月28日
【發(fā)明者】R·班賽爾 申請人:諾沃姆德治療公司