包含改進的il-12基因構(gòu)建體的組合物和疫苗、免疫治療劑及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了核酸分子和組合物，其包含：編碼IL-12p35亞單位或其功能片段的核酸序列，和/或編碼IL-12p40亞單位或其功能片段的核酸序列。本發(fā)明還公開了還包含編碼免疫原的核酸序列的核酸分子和組合物。本發(fā)明公開了調(diào)節(jié)免疫應答的方法以及誘導針對免疫原的免疫應答的方法。本發(fā)明還公開了治療性和預防性疫苗接種方法。
【專利說明】包含改進的IL-12基因構(gòu)建體的組合物和疫苗、免疫治療 劑及其使用方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及編碼人IL-12的改進基因構(gòu)建體以及包含所述構(gòu)建體的核酸分子。本 發(fā)明還涉及包含編碼人11-12的核苷酸序列的改進表達載體、疫苗和免疫治療劑，以及涉 及它們的使用方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 免疫治療是指調(diào)節(jié)人的免疫應答從而賦予所需的療效。免疫治療劑是指施用給個 體時調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)，足以最終減輕與不良免疫應答相關的癥狀，或通過增強所需的 免疫應答而最終緩解癥狀的那些組合物。在一些情況下，免疫治療是疫苗接種方案的一部 分，其中向個體施用疫苗，該疫苗將個體暴露于免疫原，進而使該個體產(chǎn)生針對該免疫原的 免疫應答，在此類情況下，免疫治療劑增強免疫應答和/或選擇性增強免疫應答的一部分 (例如細胞應答或體液應答），這是治療或預防特定病癥、感染或疾病所需的。
[0004] 在設計疫苗時，已認識到，在接種疫苗的個體的細胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗可有效 誘導免疫系統(tǒng)的細胞免疫應答。具體地講，減毒活疫苗、采用無毒力載體的重組疫苗以及 DNA疫苗各自能在接種疫苗的個體的細胞中產(chǎn)生抗原，從而導致誘導免疫系統(tǒng)的細胞免疫 應答。另一方面，只包含蛋白的殺死或滅活疫苗和亞單位疫苗不能誘導良好的細胞免疫應 答，雖然它們能誘導有效的體液應答。
[0005] 細胞免疫應答通常是提供抵御病原體感染的保護力和提供治療病原體感染、癌癥 或自身免疫疾病的有效免疫介導療法所必需的。因此，在接種疫苗的個體的細胞中產(chǎn)生靶 抗原的疫苗諸如減毒活疫苗、采用無毒力載體的重組疫苗和DNA疫苗通常是優(yōu)選的。
[0006] 需要可在人體中誘導強T細胞和B細胞免疫的疫苗方法。在一系列其他問題之中， 最近對減毒、疫苗制造復雜性、血清學干擾（如在HIV STEP試驗中所觀察到的）的關注進一 步強調(diào)了這一問題。在非人靈長類模型中以及在人類臨床試驗中，作為疫苗平臺的簡單質(zhì) 粒DNA未能誘導支持商業(yè)開發(fā)工作的令人滿意的免疫原性水平。在面對面的直接比較中， 一些基于裸質(zhì)粒的疫苗未能誘導與其病毒載體對應物（包括常用的腺病毒血清型5 (Ad5) 平臺）所誘導的相當?shù)募毎蝮w液應答。
[0007] 作為獨立疫苗接種方法的DNA疫苗技術(shù)的開發(fā)及其在當前初免平臺中的實用性 將受益于開發(fā)增強其免疫效力的策略。已報道，對密碼子和RNA編碼序列的操縱以及先導 序列的改變可增強質(zhì)粒編碼的免疫原的表達。此外，形成共有免疫原正嘗試著滿足廣泛免 疫覆蓋率以部分考慮病毒多樣性的需求。
[0008] 另外，已采用了其他策略，這些策略關注于通過改進制劑和裝置驅(qū)動的技術(shù)來改 善DNA質(zhì)粒的物理遞送。已報道，在恒河猴中，通過電穿孔（EP)遞送的DNA疫苗在用質(zhì)粒 DNA免疫后增強了抗原特異性干擾素 -γ (IFNY)的產(chǎn)生。
[0009] 共同遞送質(zhì)粒編碼的分子佐劑以增強疫苗誘導的應答是該項專門研究的另一個 重要領域。在非人靈長類動物中得到最好表征的分子佐劑之一是IL-12,這是一種T H1極化 細胞因子，它通過提供初始CD8+T細胞的有效激活和抗原特異性擴增所需的"第三信號"而 驅(qū)動CTL應答。IL-12是包含兩個亞單位p35和p40的異源二聚體。已表明其為最令人印 象深刻的免疫增強細胞因子，尤其是在作為DNA疫苗進行工程改造時用于驅(qū)動CD8T細胞。 在獼猴中，已表明IL-12是擴展靶向多種抗原的DNA疫苗的細胞免疫效力的高度有效的佐 齊[J。在恒河猴以及在人類中，這種DNA疫苗佐劑均可明顯改善由DNA疫苗誘導的免疫應答。 [0010] 以引用方式并入本文的美國專利5, 723, 127公開了作為疫苗佐劑的IL-12。以引 用方式并入本文的PCT申請PCT/US1997/019502和相應的美國專利申請08/956, 865公開 了包含IL-12編碼序列的DNA疫苗和DNA構(gòu)建體。
[0011] 仍需要改進的疫苗和免疫治療劑。需要產(chǎn)生增強的免疫應答的組合物和方法。同 樣，雖然某些免疫治療劑可用于調(diào)節(jié)患者中的免疫應答，但是仍需要改進的免疫治療組合 物和方法。仍需要編碼IL-12并可用作DNA疫苗策略的一部分的改進構(gòu)建體。仍需要編碼 IL-12并可用作免疫治療劑的改進構(gòu)建體。仍需要編碼IL-12并可用于實現(xiàn)高水平IL-12 表達的改進構(gòu)建體。 發(fā)明概要
[0012] 本發(fā)明提供組合物，其包含編碼IL-12P35亞單位或其功能片段的核酸序列，以及 編碼IL-12p40亞單位或其功能片段的核酸序列。編碼IL-12p35亞單位的核酸序列可與SEQ ID N0:1至少98%同源并編碼與SEQ ID N0:2至少98%同源的蛋白。編碼IL-12p35亞單 位的功能片段的核酸序列可以是與SEQ ID N0 :1至少98%同源的核酸序列的片段并編碼 與SEQ ID N0:2的功能片段至少98%同源的蛋白。編碼IL-12p40亞單位的核酸序列可與 SEQ ID N0:3至少98%同源并編碼與SEQ ID N0:4至少98%同源的蛋白。編碼IL-12p40 亞單位的功能片段的核酸序列可以是與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段并 編碼與SEQ ID N0 :4的功能片段至少98%同源的蛋白。組合物還可以包含編碼免疫原的 核酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)免疫應答的方法。該方法包括向個體施用組合物的步驟，該組 合物包含編碼IL-12P35亞單位或其功能片段的核酸序列以及編碼IL-12P40亞單位或其功 能片段的核酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供誘導針對免疫原的免疫應答的方法。該方法包括向個體施用組合物 的步驟，該組合物包含一定量的編碼IL-12P35亞單位或其功能片段的核酸序列以及編碼 IL-12p40亞單位或其功能片段的核酸序列與編碼免疫原的核酸序列的組合。誘導針對免疫 原的免疫應答的方法可以是誘導治療性免疫應答的方法或誘導預防性免疫應答的方法的 一部分。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖 1A 和 1B 顯示了坐標圖，該圖對用 2μ g HuIL12-〇pt 或HuIL12-nonopt(圖 1A) 或4yg HuIL12-〇pt和HuIL12-nonopt (圖1B)轉(zhuǎn)染的細胞中的人IL-12的表達水平進行 比較。
[0017] 圖2顯示了在恒河猴中增強的PSA和PSMA特異性細胞免疫應答。
[0018] 圖3顯示了在恒河猴中增強的HBV核心和表面抗原特異性細胞免疫應答。

【具體實施方式】
[0019] 在本發(fā)明的一個方面，期望的是，改進的IL-12構(gòu)建體能改善轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括具 有以下一者或多者：低GC含量的先導序列以增強轉(zhuǎn)錄;mRNA穩(wěn)定性和密碼子優(yōu)化；在某種 程度上消除可能的順式作用序列基序（即，內(nèi)部TATA盒）。
[0020] 在本發(fā)明的一些方面，期望將改進的IL-12構(gòu)建體結(jié)合到疫苗方案中，作為疫苗 組合物的一部分或作為與疫苗以協(xié)調(diào)方式遞送的單獨組合物，以便生成針對疫苗免疫原的 廣泛免疫。在本發(fā)明的一些方面，期望提供改進的IL-12構(gòu)建體，作為可用于調(diào)節(jié)個體中的 免疫應答的免疫治療劑。在本發(fā)明的一些方面，期望提供改進的IL-12構(gòu)建體以便提供表 達載體，該表達載體可用于獲得高水平的IL-12表達。
[0021] 本文提供了更高效力的IL-12基因佐劑。這些新的佐劑較以前的IL-12分子具有 若干優(yōu)點。本發(fā)明提供了有利于分子分泌并提高核糖體含量的增強的先導序列，從而擴大 這些佐劑的影響并增強表達。對RNA序列的明顯改變進一步移除了與初始IL-12序列的同 源性，從而防止所遞送的佐劑與宿主系統(tǒng)之間的干擾，以及降低宿主IL-12序列和基因遞 送分子之間可能的有害相互作用。此外，新構(gòu)建體的更高效力降低了劑量需要，從而改善與 此類佐劑相關的制造和遞送問題。最后，因為這些分子具有更高的生物活性，因此它們可在 體內(nèi)改善疫苗的性能?？傊鼈兪且呙缫约懊庖忒煼☉玫闹匾男鹿ぞ?。
[0022] 1.定義。
[0023] 本文所用的術(shù)語只是為了描述特定的實施方案，并非旨在進行限制。如在說明書 和所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式"一"、"一個/種"和"該/所述"包括多個指代物，除 非上下文另有明確指出。
[0024] 關于本文中數(shù)字范圍的引述，明確地包括相同精度的介于其間的每個居間數(shù)字。 例如，對于6-9的范圍，除了 6和9以外還包括數(shù)字7和8,對于范圍6. 0-7. 0,明確地包括 數(shù)字 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0025] a.佐劑
[0026] 如本文所用的"佐劑"可意指被添加到DNA質(zhì)粒疫苗或其他疫苗中以增強由所述 DNA質(zhì)粒或疫苗編碼的一種或多種抗原的抗原性的分子（包括編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋 白的核酸分子），以及編碼下文所述的佐劑蛋白的核酸序列。
[0027] b.抗體
[0028] "抗體"可意指類別IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體或其片段或衍生物，包括 Fab、F(ab' ) 2、Fd以及單鏈抗體、雙鏈抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物?？贵w 可以是從哺乳動物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或其混合物，所述 抗體顯示足夠的對所需表位或從其衍生的序列的結(jié)合特異性。
[0029] c.編碼序列
[0030] 如本文所用的"編碼序列"或"編碼核酸"可意指包含編碼蛋白的核苷酸序列的核 酸（RNA或DNA分子）。編碼序列還可以包含可操作地連接到調(diào)節(jié)元件的起始和終止信號， 包括能夠指導個體或哺乳動物細胞（向該個體或哺乳動物施用所述核酸）中的表達的啟動 子和聚腺苷酸化信號。
[0031] d.互補序列
[0032] 如本文所用的"互補序列"或"互補的"意指可進行核酸分子的核苷酸或核苷酸類 似物之間的沃森-克里克（例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對的核酸。
[0033] e.恒定電流
[0034] 如本文所用的"恒定電流"意指由組織或限定所述組織的細胞在被遞送至所述組 織的電脈沖的持續(xù)過程中接收或經(jīng)歷的電流。電脈沖通過本文所述的電穿孔裝置遞送。該 電流在電脈沖的壽命過程中在所述組織中保持恒定的安培數(shù)，因為本文中提供的電穿孔裝 置具有反饋元件，優(yōu)選地具有瞬時反饋。反饋元件可測量整個脈沖持續(xù)過程中組織（或細 胞）的電阻，并使電穿孔裝置改變其電能輸出（例如，升高電壓），這樣相同組織中的電流在 整個電脈沖過程（在微秒級上）以及脈沖之間保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包 括控制器。
[0035] f.電流反饋或反饋
[0036] 如本文所用的"電流反饋"或"反饋"可互換使用并且可意指所提供的電穿孔裝置 的主動反應，這包括測量電極之間的組織中的電流，并且相應地改變通過EP裝置遞送的能 量輸出，以將電流維持在恒定水平。該恒定水平可由使用者在脈沖序列或電治療開始之前 預先設置。反饋可通過電穿孔裝置的電穿孔組件例如控制器來實現(xiàn)，因為其中的電路能夠 連續(xù)監(jiān)測電極之間的組織中的電流并將該監(jiān)測到的電流（或組織內(nèi)的電流）與預設電流相 比較，以及連續(xù)進行能量輸出調(diào)整以將監(jiān)測到的電流維持在預設水平。反饋回路可以是瞬 時的，因為其為模擬閉環(huán)反饋。
[0037] g.分散電流（Decentralized Current)
[0038] 如本文所用的"分散電流"可意指來源于本文所述的電穿孔裝置的各種針電極陣 列的電流模式，其中所述模式最小化或優(yōu)選地消除電穿孔相關熱應激在被電穿孔的組織的 任何區(qū)域上發(fā)生。
[0039] h.電穿孔
[0040] 如在本文中可互換使用的"電穿孔"、"電透化"或"電動增強"（"EP"）可指使用跨 膜電場脈沖在生物膜中誘導極微通道（孔）；其存在使生物分子如質(zhì)粒、寡核苷酸、siRNA、 藥物、離子和水能夠從細胞膜的一側(cè)通向另一側(cè)。
[0041] i.反饋機制
[0042] 如本文所用的"反饋機制"可以指通過軟件或硬件（或固件）進行的過程，該過程 (在能量脈沖遞送之前、期間和/或之后）接收所需組織的阻抗并將其與預設值（優(yōu)選電 流）進行比較，然后調(diào)整遞送的能量脈沖以達到預設值。反饋機制可通過模擬閉環(huán)電路來 實現(xiàn)。
[0043] j.片段
[0044] 如本文所用的"片段"可意指編碼多肽的一個部分或一種核酸，其能夠基本上類似 于共有抗原的非片段在哺乳動物中引起免疫應答。所述片段可以是選自以下的DNA片段： SEQIDN0:1的片段，與SEQIDN0:1至少98%同源并編碼與SEQIDN0 :2至少98%同源 的蛋白功能片段的核酸序列片段；SEQ ID N0 :3的片段，以及與SEQ ID N0 :3至少98%同 源并編碼與SEQ ID N0 :4至少98%同源的蛋白功能片段的核酸序列片段。
[0045] SEQ ID N0 :1的DNA片段即與SEQ ID N0 :1至少98%同源并編碼與SEQ ID N0 :2 至少98%同源的蛋白功能片段的核酸序列片段可編碼SEQ ID NO :2的50個或更多個氨基 酸長、55個或更多個、60個或更多個、65個或更多個、70個或更多個、75個或更多個、80個 或更多個、85個或更多個、90個或更多個、95個或更多個、100個或更多個、105個或更多個、 110個或更多個、115個或更多個、120個或更多個、125個或更多個、130個或更多個、135個 或更多個、140個或更多個、145個或更多個、150個或更多個、155個或更多個、160個或更多 個、165個或更多個、170個或更多個、175個或更多個、180個或更多個、185個或更多個、190 個或更多個、195個或更多個、200個或更多個、205個或更多個、210個或更多個長或215個 或更多個長或與SEQIDNO :2至少98%同源的蛋白。SEQIDNO:l的DNA片段即與SEQID NO :1至少98%同源并編碼蛋白（少于SEQ ID NO :2的53個、少于58個、少于63個、少于 68個、少于73個、少于78個、少于83個、少于88個、少于93個、少于98個、少于103個、少 于108個、少于113個、少于118個、少于123個、少于128個、少于133個、少于138個、少 于143個、少于148個、少于153個、少于158個、少于163個、少于168個、少于173個、少 于178個、少于183個、少于188個、少于193個、少于198個、少于203個、少于208個、少 于213個或少于218個氨基酸長）或為與SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的功能片段的 核酸序列片段。在一些實施方案中，與SEQ ID N0:1至少98%同源的核酸序列的片段編碼 與SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的功能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :1至 少98%同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白的功能片段。在 一些實施方案中，與SEQ ID NO :1至少98%同源的核酸序列的片段編碼SEQ ID NO :2的功 能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :1至少99%同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的功能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :1至少99% 同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白的功能片段。在一些實施 方案中，與SEQ ID NO :1至少99%同源的核酸序列的片段編碼SEQ ID NO :2的功能片段。 在一些實施方案中，所述片段為編碼SEQ ID NO :2的功能片段的SEQ ID NO :1的片段。
[0046] SEQ ID N0 :3的DNA片段即與SEQ ID N0 :3至少98%同源并編碼與SEQ ID N0 :4 至少98%同源的蛋白功能片段的核酸序列片段可編碼SEQ ID NO :4的50個或更多個氨基 酸長、55個或更多個、60個或更多個、65個或更多個、70個或更多個、75個或更多個、80個 或更多個、85個或更多個、90個或更多個、95個或更多個、100個或更多個、105個或更多個、 110個或更多個、115個或更多個、120個或更多個、125個或更多個、130個或更多個、135個 或更多個、140個或更多個、145個或更多個、150個或更多個、155個或更多個、160個或更 多個、165個或更多個、170個或更多個、175個或更多個、180個或更多個、185個或更多個、 190個或更多個、195個或更多個、200個或更多個、205個或更多個、210個或更多個、215個 或更多個、220個或更多個、225個或更多個、230個或更多個、235個或更多個、240個或更 多個、245個或更多個、250個或更多個、255個或更多個、260個或更多個、265個或更多個、 270個或更多個、275個或更多個、280個或更多個、285個或更多個、290個或更多個、295個 或更多個、300個或更多個、305個或更多個、310個或更多個、315個或更多個、320個或更多 個或325個或更多個氨基酸或與SEQ ID N0:4至少98%同源的蛋白。SEQ ID N0:3的DNA 片段和與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列片段可編碼少于SEQ ID NO :4的53個、少 于58個、少于63個、少于68個、少于73個、少于78個、少于83個、少于88個、少于93個、 少于98個、少于103個、少于108個、少于113個、少于118個、少于123個、少于128個、少 于133個、少于138個、少于143個、少于148個、少于153個、少于158個、少于163個、少 于168個、少于173個、少于178個、少于183個、少于188個、少于193個、少于198個、少 于203個、少于208個、少于213個、少于218個、少于223個、少于228個、少于233個、少 于238個、少于243個、少于248個、少于253個、少于258個、少于263個、少于268個、少 于273個、少于278個、少于283個、少于288個、少于293個、少于298個、少于303個、少 于308個、少于313個、少于318個或少于328個氨基酸的功能片段或與SEQ ID NO :4至少 98%同源的蛋白。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段編 碼與SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋白的功能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :3 至少98%同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白的功能片段。在 一些實施方案中，與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段編碼SEQ ID NO :4的功 能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :3至少99%同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋白的功能片段。在一些實施方案中，與SEQ ID NO :3至少99% 同源的核酸序列的片段編碼與SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白的功能片段。在一些實施 方案中，與SEQ ID NO :3至少99%同源的核酸序列的片段編碼SEQ ID NO :4的功能片段。 在一些實施方案中，所述片段為編碼SEQ ID NO :4的功能片段的SEQ ID NO :3的片段。
[0047] DNA片段可不含IL-12信號肽的編碼序列。DNA片段可包含免疫球蛋白信號肽的 編碼序列，諸如IgE或IgG信號肽序列。因此，例如，編碼IL-12p35亞單位的DNA片段不編 碼SEQ ID N0 :2的第1-22位氨基酸，并且在一些此類實施方案中，可包含編碼免疫球蛋白 信號肽的序列，諸如IgE信號肽序列（SEQ ID NO :5)或IgG信號肽序列。
[0048] "片段"還可以指能夠基本上類似于全長多肽發(fā)揮功能的多肽片段。IL_12p35 的片段可以是SEQ ID N0 :2的片段或與SEQ ID N0 :2的片段至少98%同源的多肽片段。 IL-12p35的片段可以是與SEQ ID N0 :2的片段至少99%同源的多肽片段。IL-12p35的片 段可以是如上所述的片段。IL_12p40的片段可以是SEQ ID N0:4的片段或與SEQ ID N0: 4的片段至少98%同源的多肽片段。IL-12p40的片段可以是與SEQ ID NO :4的片段至少 99%同源的多肽片段。IL-12p40的片段可以是如上所述的片段。
[0049] "功能片段"意指可基本上類似于全長p35或p40發(fā)揮功能的短于完整p35和/或 短于完整p40序列的IL-12亞單位的片段。此類基本上相似的功能包括以與全長p35或 P40基本上相同的方式與其他蛋白、亞單位或受體的相互作用，并在以允許形成異源二聚體 的方式遞送時導致與IL-12p35/p40異源二聚體基本上相同的作用。
[0050] k.基因構(gòu)建體
[0051] 如本文所用的術(shù)語"基因構(gòu)建體"是指DNA或RNA分子，該DNA或RNA分子包含編 碼一個或兩個IL-12亞單位或靶蛋白或另一種（非IL-12)免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。該 編碼序列包含可操作地連接到調(diào)節(jié)元件的起始和終止信號，包括能夠指導個體細胞（向該 個體施用所述核酸分子）中的表達的啟動子和聚腺苷酸化信號。
[0052] 1.過度增殖性
[0053] 如本文所用，術(shù)語"過度增殖性疾病"意指以細胞過度增殖為特征的那些疾病和障 礙，并且術(shù)語"過度增殖相關蛋白"意指與過度增殖性疾病相關的蛋白。
[0054] m.同一
[0055] 如本文在兩個或更多個核酸或多肽序列的背景下使用的"同一"或"同一性"可意 指序列具有指定百分比的在指定區(qū)域上相同的殘基?？扇缦掠嬎惆俜直龋鹤罴训貙R兩個 序列，在指定的區(qū)域上比較兩個序列，測定兩個序列中在其上存在相同殘基的位置的數(shù)目 以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以指定區(qū)域中位置的總數(shù)，然后將結(jié)果乘以 100以得到序列同一性的百分比。在其中兩個序列具有不同的長度或比對產(chǎn)生一個或多個 交錯末端以及指定的比較區(qū)域只包括單個序列的情況下，將單個序列的殘基包括在計算的 分母而非分子中。當比較DNA與RNA時，胸腺嘧啶（T)與尿嘧啶（U)可被認為是等同的。可 通過人工或使用計算機序列算法例如BLAST或BLAST 2. 0來計算同一性。
[0056] η·阻抗
[0057] 如本文所用的"阻抗"在論述反饋機制時可以使用，并可根據(jù)歐姆定律轉(zhuǎn)變成電流 值，從而使得能夠與預設電流進行比較。
[0058] 〇·免疫應答
[0059] 如本文所用的"免疫應答"可意指宿主免疫系統(tǒng)例如哺乳動物的免疫系統(tǒng)響應一 種或多種RSV共有抗原的引入（通過所提供的DNA質(zhì)粒疫苗）的激活。免疫應答可以為細 胞或體液應答或兩者的形式。
[0060] Ρ.細胞內(nèi)病原體
[0061] 如本文所用的"細胞內(nèi)病原體"意指病毒或病原性生物體，其復制或生命周期的至 少一部分存在于宿主細胞內(nèi)并在其中產(chǎn)生或?qū)е庐a(chǎn)生病原體蛋白。
[0062] q.核酸
[0063] 如本文所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"可意指共價連接在一起的至少 兩個核苷酸。單鏈的描述也確定了互補鏈的序列。因此，核酸還包括所描述的單鏈的互補 鏈。核酸的許多變體可用于與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還包括基本上同一的核 酸及其互補序列。單鏈提供了可與靶序列在嚴格雜交條件下雜交的探針。因此，核酸還包 括在嚴格雜交條件下雜交的探針。
[0064] 核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA (基 因組DNA和cDNA)、RNA或雜交體，其中核酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以 及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥 嘌呤的堿基的組合。核酸可利用化學合成法或通過重組方法獲得。
[0065] r.可操作地連接
[0066] 如本文所用的"可操作地連接"在指代可操作地連接到啟動子的基因時是指兩個 組件的連接，使得基因的表達處于與其在空間上連接的啟動子的控制之下。啟動子可被置 于處于其控制下的基因的5'(上游）或3'(下游）。啟動子與基因之間的距離可以與啟 動子所源自的基因中啟動子與其控制的基因之間的距離大致相同。如本領域中所已知，該 距離的變化可被容許而不喪失啟動子功能。當指代可操作地連接到蛋白的信號肽時，該術(shù) 語是指具有作為蛋白的一部分而結(jié)合在內(nèi)的信號肽的蛋白，結(jié)合的方式使得其可作為信號 肽發(fā)揮作用。當指代編碼可操作地連接到編碼序列（編碼蛋白）的信號肽的編碼序列時， 該術(shù)語是指這些的編碼序列，其排列方式使得編碼序列的翻譯產(chǎn)生具有作為蛋白的一部分 而結(jié)合在內(nèi)的信號肽的蛋白，結(jié)合的方式使得其可作為信號肽發(fā)揮作用。
[0067] s.啟動子
[0068] 如本文所用的"啟動子"可意指能夠在細胞中賦予核酸的表達、激活或增強所述表 達的合成或天然來源的分子。啟動子可包含一個或多個特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以進一步增強 所述核酸的表達和/或改變其空間表達和/或時間表達。啟動子還可以包含遠端增強子或 抑制子元件，所述元件可位于遠離轉(zhuǎn)錄起始位點多達數(shù)千個堿基對。啟動子可來源于包括 病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和動物的來源。相對于表達發(fā)生所處的細胞、組織或器官，或相 對于表達發(fā)生所處的發(fā)育階段，或響應于外部刺激例如生理應激、病原體、金屬離子或誘導 齊U，啟動子可組成型地或差異地調(diào)控基因組件的表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7 啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、lac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、 SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晚期啟動子和 CMVIE啟動子。
[0069] t.嚴格雜交條件
[0070] 如本文所用的"嚴格雜交條件"可意指第一核酸序列（例如探針）將與第二核酸 序列（例如靶）例如在核酸的復雜混合物中雜交所處的條件。嚴格條件是序列依賴性的并 且在不同的環(huán)境中是不同的。嚴格條件可被選擇為比限定離子強度pH下特定序列的熱解 鏈溫度（T m)低約5-10°C。Tm可以是（在限定的離子強度、pH和核酸濃度下）50%的與靶互 補的探針與靶序列平衡雜交時所處的溫度（當靶序列過量存在時，在T m下，50%的探針被 平衡地占據(jù)）。嚴格條件可以是這樣的條件，其中在pH 7. 0至8. 3下鹽濃度低于約1. 0M鈉 離子，例如約0.01-1. 0M的鈉離子濃度（或其他鹽）并且溫度為至少約30°C (對于短探針， 例如約10-50個核苷酸）和至少約60°C (對于長探針，例如大于約50個核苷酸）。嚴格條 件還可通過加入去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可以為 背景雜交的至少2至10倍。示例性嚴格雜交條件包括下列條件：在42°C下于50%甲酰胺、 5x SSC和1%SDS中溫育，或在65°C下于5x SSC、1%SDS中溫育，和在65°C下于0.2x SSC 和0. 1% SDS中洗滌。
[0071] u.基本上互補的
[0072] 如本文所用的"基本上互補的"可意指第一序列與第二序列的互補序列在8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或兩個序列在嚴格雜交條件下雜 交。
[0073] V.基本上同一的
[0074] 如本文所用的"基本上同一的"可意指第一序列與第二序列在8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少60 %、65%、70 %、75%、80%、 85%、90(%、95(%、97(%、98 (%或99(%的同一性，或就核酸而言，如果第一序列與第二序列的 互補序列基本上互補，則第一序列與第二序列基本上同一。
[0075] w.靶蛋白
[0076] 如本文所用的術(shù)語"靶蛋白"意指作為疫苗的一部分或由DNA疫苗的基因構(gòu)建體 編碼的肽和蛋白，該肽和蛋白在免疫應答中起靶蛋白的作用。術(shù)語"靶蛋白"和"免疫原"可 互換使用，并指可以引起免疫應答的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，它與病原體的蛋白或不 利細胞類型（例如癌細胞）的蛋白或需要引起免疫應答的自身免疫疾病中所涉及的細胞的 蛋白共有至少一個表位。針對靶蛋白的免疫應答將保護個體抵御和/或治療該個體的與該 靶蛋白相關的特定感染或疾病。
[0077] X.變體
[0078] 如本文相對于核酸所用的"變體"可意指：⑴參照核酸序列的部分或片段；（ii) 參照核苷酸序列或其部分的互補序列；（iii)與參照核酸或其互補序列基本上同一的核 酸；或（iv)在嚴格條件下與參照核酸、其互補序列或與其基本上同一的序列雜交的核酸。
[0079] 相對于肽或多肽的"變體"在氨基酸序列上的差異在于氨基酸的插入、缺失或保守 置換但保持至少一種生物活性。變體還可以意指其氨基酸序列與參考蛋白的氨基酸序列 基本上同一的蛋白，其保持至少一種生物活性。氨基酸的保守置換，即用具有相似性質(zhì)（例 如，親水性、帶電荷區(qū)域的程度和分布）的不同氨基酸替代氨基酸，在本領域被認為通常涉 及微小的變化。這些微小的變化可部分地通過考慮氨基酸的親疏水性指數(shù)來鑒定，如本領 域中所理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的親疏水性指數(shù)基于 其疏水性和電荷的考慮。在本領域中已知的是，具有相似親疏水性指數(shù)的氨基酸可被置換 并且仍然保留蛋白功能。在一個方面，具有±2的親疏水性指數(shù)的氨基酸被置換。氨基酸 的親水性還可用于揭示將產(chǎn)生保留生物功能的蛋白的置換。在肽的背景下對氨基酸的親水 性的考慮允許計算該肽的最大局部平均親水性，這一有用的指標已報道與抗原性和免疫原 性相關。美國專利4, 554, 101，以引用的方式整體并入本文。具有相似親水性值的氨基酸 的置換可產(chǎn)生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本領域中所理解?？衫糜H水性值在彼 此±2內(nèi)的氨基酸進行置換。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值受該氨基酸的特定側(cè)鏈影 響。與該觀察一致，應理解與生物功能相容的氨基酸置換依賴于氨基酸的相似性，尤其是那 些氨基酸的側(cè)鏈的相似性，如通過疏水性、親水性、電荷、大小和其他性質(zhì)所揭示。
[0080] y.載體
[0081] 本文所用的"載體"可意指包含復制起始位點的核酸序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌 體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自主復 制的染色體外載體，或整合進宿主基因組的載體。
[0082] 2. IL-12
[0083] 本文提供了編碼人IL_12p35(a亞單位）和ρ40(β亞單位）的合成構(gòu)建體。人 IL-12p35亞單位（SEQ ID NO :2)為219個氨基酸的蛋白，其包含在第1-22位氨基酸的信號 肽和在第23-219位的成熟蛋白序列。人IL-12p40亞單位（SEQ ID N0:4)為328個氨基酸 的蛋白，其包含在第1-22位氨基酸的信號肽和在第23-328位的成熟蛋白序列。人IL-12p40 亞單位的第40-90位氨基酸稱為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；人IL-12p40亞單位的第125-217位氨 基酸稱為細胞因子白介素_12p40C端結(jié)構(gòu)域。
[0084] 在一些實施方案中，IL_12p35亞單位由在一個質(zhì)粒上包含編碼序列的構(gòu)建體編 碼，而IL-12p40亞單位由在不同質(zhì)粒上包含編碼序列的構(gòu)建體編碼。在一些實施方案中， 包含IL-12p35亞單位編碼序列的構(gòu)建體和包含IL-12p40亞單位編碼序列的構(gòu)建體在相同 的質(zhì)粒上但各構(gòu)建體具有其自身的啟動子。在一些實施方案中，包含IL-12p35亞單位編碼 序列的構(gòu)建體和包含IL-12p40亞單位編碼序列的構(gòu)建體在相同的質(zhì)粒上并處于單個啟動 子的控制下且由IRES序列分開。在一些實施方案中，包含IL-12p35亞單位編碼序列的構(gòu) 建體和包含IL_12p40亞單位編碼序列的構(gòu)建體在相同的質(zhì)粒上并處于單個啟動子的控制 下且由蛋白水解裂解位點的編碼序列分開。在一些實施方案中，包含IL-12p35亞單位編碼 序列的構(gòu)建體和包含IL_12p40亞單位編碼序列的構(gòu)建體在相同的質(zhì)粒上并處于單個啟動 子的控制下并且所述亞單位由使得它們可作為單鏈蛋白而具有活性的接頭分開。
[0085] HuIL12-〇pt序列是編碼人IL-12亞單位的優(yōu)化序列。該序列具有與宿主基因組較 低的同源性，以改變RNA結(jié)構(gòu)并避免隱秘的調(diào)控序列。所述序列提供改善的mRNA穩(wěn)定性和 表達。
[0086] 作為編碼人IL-12p35亞單位的編碼序列的HuIL12-〇pt序列在SEQ ID N0 :1中 公開。作為因而編碼的219個氨基酸的IL-12p35亞單位氨基酸序列的HuIL12-〇pt序列以 SEQ ID N0. 2公開。第1-22位氨基酸對應于信號肽。第23-219位氨基酸對應于成熟蛋白 區(qū)域。
[0087] 作為編碼人IL-12p40亞單位的編碼序列的HuIL12-〇pt序列以SEQ ID N0 :3公開。 作為因而編碼的328個氨基酸的IL-12p40亞單位氨基酸序列的HuIL12-〇pt序列以SEQ ID NO. 4公開。第1-22位氨基酸對應于IL-12信號肽而第23-328位氨基酸構(gòu)成成熟蛋白。獼 猴IL-12的類似序列為RhIL12-〇pt序列，其為編碼獼猴IL-12亞單位的優(yōu)化序列。
[0088] 在一些實施方案中，IL-12p35或p40亞單位或兩者的IL-12信號肽可被不同的信 號肽諸如另一種免疫球蛋白信號肽例如IgG或IgE(SEQ ID N0:5)替代。編碼IL-12p35 或p40亞單位或兩者的IL-12信號肽的編碼序列可被不同的信號肽諸如另一種免疫球蛋白 信號肽例如IgG或IgE (其為編碼SEQ ID N0 :5的編碼序列）替代。在一些實施方案中， IL-12p35信號肽可被不同的信號肽諸如另一種免疫球蛋白信號肽例如IgG或IgE(SEQ ID NO :5)替代。SEQ ID NO. 2的功能片段可不含IL-12p35信號肽序列。在一些實施方案中，編 碼IL-12p35信號肽的編碼序列可被不同信號肽的編碼序列諸如另一種免疫球蛋白信號肽 的編碼序列例如IgG或IgE信號肽的編碼序列（即編碼SEQ ID N0 :5的編碼序列）替代。 為SEQIDN0:l的片段的核酸序列可不含IL-12p35信號肽的編碼序列。SEQIDN0.4的功 能片段可不含IL_12p40信號肽序列。在一些實施方案中，編碼IL-12p40信號肽的編碼序 列可被不同信號肽的編碼序列諸如另一種免疫球蛋白信號肽的編碼序列例如IgG或IgE信 號肽的編碼序列（即編碼SEQ ID N0 :5的編碼序列）替代。為SEQ ID N0 :3的片段的核酸 序列可不含IL-12p40信號肽的編碼序列。分別計算在不編碼IL-12p35信號肽或IL-12p40 信號肽的編碼序列中與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的同源性時，該計算基于排除以下部 分的SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :3的比較：編碼IL-12p35信號肽的SEQ ID N0 :1的部分， 或編碼IL-12p40信號肽的SEQ ID N0 :3的部分。
[0089] 3.質(zhì)粒
[0090] 本文提供了能夠以有效地調(diào)節(jié)哺乳動物中的免疫應答的量在哺乳動物的細胞中 表達IL-12構(gòu)建體的載體。各載體可包含編碼所述一個或多個亞單位的異源核酸。載體可 以是質(zhì)粒。質(zhì)粒可用于通過編碼11-12的核酸對細胞進行轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)化后的宿主細胞進行 培養(yǎng)，并維持在其中發(fā)生IL-12的表達的條件下。
[0091] 質(zhì)?？梢园幋a一種或多種抗原的核酸。質(zhì)粒還可以包含起始密碼子，其可以 位于編碼序列的上游，以及終止密碼子，其可以為與編碼序列的下游。起始和終止密碼子可 與編碼序列在一個框內(nèi)。
[0092] 質(zhì)粒還可以包含可操作地連接到編碼序列的啟動子。可操作地連接到編碼序列的 啟動子可以是來自猿猴病毒40 (SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV)啟動子、人免疫缺 陷病毒（HIV)啟動子例如牛免疫缺陷病毒（BIV)長末端重復（LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟 動子、禽類白血病病毒（ALV)啟動子、巨細胞病毒（CMV)啟動子例如CMV立即早期啟動子、 EB病毒（EBV)啟動子或勞斯肉瘤病毒（RSV)啟動子。啟動子還可以是來自人基因例如人肌 動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白的啟動子。啟動子還可以是 組織特異性啟動子，例如肌肉或皮膚特異性啟動子，天然或合成的。此類啟動子的實例在美 國專利申請公布US20040175727中有所描述，將其內(nèi)容以引用方式整體并入本文。
[0093] 質(zhì)粒還可包含多聚腺苷酸化信號，其可位于編碼序列的下游。多聚腺苷酸化信號 可以是SV40多聚腺苷酸化信號、LTR多聚腺苷酸化信號、牛生長激素（bGH)多聚腺苷酸化 信號、人生長激素（hGH)多聚腺苷酸化信號或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信號。SV40多聚 腺苷酸化信號可以是來自PCEP4質(zhì)粒的多聚腺苷酸化信號（Invitrogen，San Diego，CA)。
[0094] 質(zhì)粒還可以包含位于編碼序列的上游的增強子。增強子可以是人肌動蛋白、人肌 球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強子例如來自CMV、FMDV、RSV或EBV的一種。在 美國專利5, 593, 972、5, 962, 428和W094/016737(每一者的內(nèi)容均以引用方式整體并入本 文）中描述了多核苷酸功能增強。
[0095] 質(zhì)粒還可包含哺乳動物復制起點以便在細胞中使質(zhì)粒保持于染色體外并且產(chǎn)生 多個質(zhì)粒的拷貝。質(zhì)?？梢允堑米訧nvitrogen(San Diego，CA)的pVAXl、pCEP4或pREP4， 其可以包含EB病毒復制起點和核抗原EBNA-1編碼區(qū)，其可產(chǎn)生高拷貝游離型復制而不整 合。質(zhì)粒的主鏈可以是PAV0242。質(zhì)?？梢允菑椭迫毕菪拖俨《?型（Ad5)質(zhì)粒。
[0096] 質(zhì)粒還可以包含可非常適合在施用質(zhì)粒的細胞中的基因表達的調(diào)控序列。編碼序 列可包含可允許在宿主細胞中更高效地轉(zhuǎn)錄編碼序列的密碼子。
[0097] 編碼序列還可以包含Ig先導序列。先導序列可以在編碼序列的5'。由該序列編 碼的共有抗原可包含N端Ig先導序列，隨后為共有抗原蛋白。N端Ig先導序列可以是IgE 或 IgG。
[0098] 質(zhì)粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在大腸桿菌 Escherichia coli(E.coli)中產(chǎn)生蛋白。質(zhì)粒還可以是 pYES2(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在酵母的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)株系中產(chǎn)生蛋白。質(zhì) 粒還可以具有MAXBAC?完全桿狀病毒表達系統(tǒng)（Invitrogen，San Diego, Calif·)，其可 用于在昆蟲細胞中產(chǎn)生蛋白。質(zhì)粒還可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢（CH0)細胞中產(chǎn)生蛋白。
[00"] 4.疫苗
[0100] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，將編碼IL-12或其功能片段的核酸序列與編碼免疫 原的核酸序列相結(jié)合遞送到個體將增強針對該免疫原的免疫應答。當編碼免疫原和IL-12 的核酸分子被個體的細胞吸收時，免疫原和IL-12在細胞中表達并因而將蛋白遞送到個 體。本發(fā)明的多個方面提供在單個核酸分子上遞送免疫原和IL-12的編碼序列的方法，在 不同核酸分子上遞送免疫原和IL-12的編碼序列的方法，以及作為重組疫苗的一部分和作 為減毒活疫苗的一部分遞送蛋白的編碼序列的方法。
[0101] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供對個體進行預防性和/或治療性免疫以抵御病原體 或異常、疾病相關細胞的組合物和方法。該疫苗可以是任何類型的疫苗，諸如減毒活疫苗、 重組疫苗或者核酸或DNA疫苗。通過遞送編碼免疫原和IL-12或其功能片段的核酸分子， 可調(diào)節(jié)由疫苗誘導的免疫應答。IL-12構(gòu)建體尤其可用于與編碼免疫原的核酸分子組合遞 送的情況，諸如作為重組載體或減毒活病原體或細胞的質(zhì)粒或基因組的一部分。IL-12構(gòu)建 體可預防性用于疫苗以便在未感染或無疾病的個體中誘導保護性免疫應答。IL-12構(gòu)建體 尤其可用于為在人體中誘導保護性免疫應答而遞送的情況。IL-12構(gòu)建體可治療性用于疫 苗以便在感染或患病個體中誘導免疫應答。IL-12構(gòu)建體尤其可用于為在人體中誘導治療 性免疫應答而遞送的情況。在一些實施方案中，包含IL-12構(gòu)建體的核酸分子在無細胞的 組合物中遞送。在一些實施方案中，包含IL-12構(gòu)建體的核酸分子在無癌細胞的組合物中 遞送。在一些實施方案中，包含IL-12構(gòu)建體的核酸分子在無任何其他細胞因子的情況下 施用。
[0102] 本文提供能夠在哺乳動物中生成針對以下方面的免疫應答的疫苗：病原體、在疾 病相關細胞上表達的免疫原以及需要引起針對其的免疫應答的其他免疫原。疫苗可包含如 上所述的各質(zhì)粒。疫苗可包含多種質(zhì)?；蚱浣M合?？商峁┮呙缫哉T導治療性或預防性免疫 應答。
[0103] 基因構(gòu)建體可以包含編碼可操作地連接到基因表達所需的調(diào)節(jié)元件的靶蛋白或 免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，提供了基因構(gòu)建體的組合，其包括：含有編碼靶 蛋白的可表達形式的核苷酸序列的一個構(gòu)建體，以及含有編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的可表達形式 的核苷酸序列的一個構(gòu)建體。將含有基因構(gòu)建體的組合的DNA或RNA分子遞送進活細胞可 導致該DNA或RNA的表達，并產(chǎn)生靶蛋白以及一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)果是增強了針 對該靶蛋白的免疫應答。
[0104] 可采用本發(fā)明來使個體對病原體例如病毒、原核生物和致病性真核生物（諸如單 細胞致病生物和多細胞寄生蟲）免疫。本發(fā)明特別可用于使個體對感染細胞和無衣殼的那 些病原體（例如病毒和原核生物，諸如淋球菌、李斯特菌屬和志賀菌屬）免疫。此外，本發(fā) 明還可用于使個體對原生動物病原體免疫，所述原生動物病原體在其生命周期中的某一階 段為胞內(nèi)病原體。表1提供了可制備其根據(jù)本發(fā)明的疫苗的一些病毒科和屬的列表。疫苗 中可采用含有編碼肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述肽含有至少一個與例如表中所列的那 些病原體抗原所展示的表位相同的或基本上相似的表位。此外，本發(fā)明還可用于使個體對 其他病原體免疫，包括如表2所列的那些原核病原體和真核原生動物病原體以及多細胞寄 生蟲。
[0105] 表1-病毒
[0106] 小RNA病毒科
[0107] 屬：
[0108] 鼻病毒屬：（醫(yī)學）引起約-50 %的普通感冒病例。
[0109] 腸病毒（Etheroviruses):(醫(yī)學）包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和 人腸道病毒，諸如甲肝病毒。
[0110] 口瘡病毒（Apthoviruses):(獸醫(yī)）這些是口蹄疫病毒。
[0111] 靶抗原：VP1、VP2、VP3、VP4、VPG
[0112] 杯狀病毒科
[0113] 屬：
[0114] 諾瓦克群病毒屬：（醫(yī)學）這些病毒是流行性胃腸炎的重要病原體。
[0115] 披膜病毒科
[0116] 屬：
[0117] α病毒屬：（醫(yī)學和獸醫(yī)）實例包括Sindbis病毒、羅斯河病毒（RossRiver virus)以及東方和西方馬腦炎病毒。
[0118] 呼腸孤病毒屬：（醫(yī)學）風疹病毒。
[0119] 黃病毒科
[0120] 實例包括：（醫(yī)學）登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒和虱 傳腦炎病毒。西尼羅病毒（Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、 AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、 AF260967、AF206518 和 AF202541)
[0121] 代表性靶抗原：E NS5C
[0122] 丙肝病毒：（醫(yī)學）這些病毒不屬于任何科，但據(jù)信是披膜病毒或黃病毒。大部分 類似于披膜病毒科。
[0123] 冠狀病毒科：（醫(yī)學和獸醫(yī)）
[0124] 傳染性支氣管炎病毒（禽類）
[0125] 豬可傳播性胃腸炎病毒（豬）
[0126] 豬凝血性腦脊髓炎病毒（豬）
[0127] 貓傳染性腹膜炎病毒（貓）
[0128] 貓小腸冠狀病毒（貓）
[0129] 狗冠狀病毒（狗）
[0130] SARS相關冠狀病毒
[0131] 人呼吸道冠狀病毒引起約40%的普通感冒病例。EX. 224E，0C43。注意-冠狀病 毒可引起非甲型、非乙型和非丙型肝炎。
[0132] 靶抗原：E1-也稱為Μ蛋白或基質(zhì)蛋白，E2-也稱為S蛋白或刺突蛋白，E3-也稱為 BE或血凝素-elterose糖蛋白（并不存在于所有冠狀病毒中）Ν-核衣殼
[0133] 棒狀病毒科
[0134] 屬：
[0135] 水疤病毒（Vesiculovirus)、狂犬病病毒：（醫(yī)學和獸醫(yī)）狂犬病
[0136] 靶抗原：G蛋白、N蛋白
[0137] 線狀病毒科：（醫(yī)學）
[0138] 出血熱病毒，例如馬堡病毒和埃博拉病毒
[0139] 副粘病毒科：
[0140] 屬：
[0141] 副粘病毒屬：（醫(yī)學和獸醫(yī)）腮腺炎病毒、新城疫病毒（雞中的重要致病原）
[0142] 麻疹病毒屬：（醫(yī)學和獸醫(yī)）麻疹病毒、狗瘟熱
[0143] 肺病毒：（醫(yī)學或獸醫(yī)）呼吸道合胞病毒
[0144] 正粘液病毒科（醫(yī)學）流感病毒
[0145] 布尼亞病毒（Bunyavirus)科
[0146] 屬：
[0147] 布尼亞病毒屬：（醫(yī)學）加利福尼亞腦炎、La Crosse
[0148] 白嶺熱病毒屬：（醫(yī)學）里夫特山谷熱病
[0149] 漢坦病毒屬：Puremala是一種hemahagin熱病毒
[0150] 內(nèi)羅畢病毒屬（獸醫(yī)）內(nèi)羅畢綿羊病
[0151] 還有許多未分類的布尼亞病毒屬
[0152] 砂粒病毒科（醫(yī)學）LCM、拉沙熱病毒
[0153] 呼腸孤病毒科
[0154] 屬：
[0155] 呼腸孤病毒屬：潛在的人病原體
[0156] 輪狀病毒：兒童急性胃腸道炎
[0157] 環(huán)狀病毒屬：（醫(yī)學和獸醫(yī)）科羅拉多虱傳熱病毒、
[0158] 菜邦博病毒（Lebombo)(人）馬腦炎病毒、藍舌病毒
[0159] 逆轉(zhuǎn)錄病毒科
[0160] 亞科：
[0161] 致癌病毒亞科（Oncorivirinal):(獸醫(yī)）（醫(yī)學）貓白血病病毒、HTLVI和HTL VII
[0162] 慢病毒亞科：（醫(yī)學和獸醫(yī)）HIV、貓免疫缺陷病毒、馬傳染性病毒、貧血病毒
[0163] 泡沫病毒亞科（Spumavirinal)乳多空病毒（Papovavirus)科
[0164] 亞科：
[0165] 多瘤病毒亞科：（醫(yī)學）BKU和J⑶病毒
[0166] 亞科：
[0167] 乳頭瘤病毒亞科：（醫(yī)學）與癌癥或乳頭瘤的惡性進展有關的許多種病毒
[0168] 腺病毒（醫(yī)學）EXAD7、ARD.、0·Β·-引起呼吸道疾病-某些腺病毒（諸如275)引 起腸炎
[0169] 細小病毒科（獸醫(yī)）
[0170] 貓細小病毒：引起貓腸炎
[0171] 貓傳染性粒細胞缺乏病毒（Feline panleucopeniavirus)
[0172] 狗細小病毒
[0173] 豬細小病毒
[0174] 皰疹病毒科
[0175] 亞科：
[0176] α皰疹病毒亞科
[0177] 屬：
[0178] 單純皰疹病毒屬（醫(yī)學）
[0179] HSVI(Genbank X14112, NC001806),
[0180] HSVII(NC001798)
[0181] 水痘病毒屬：（醫(yī)學和獸醫(yī)）
[0182] 假性狂犬病
[0183] 水痘帶狀疤疹
[0184] 亞科
[0185] β皰疹病毒亞科
[0186] 屬：
[0187] 巨細胞病毒屬（醫(yī)學）
[0188] HCMV
[0189] 鼠巨細胞病毒屬（Muromegalovirus)
[0190] 亞科
[0191] Y痛疫病毒亞科
[0192] 屬：
[0193] 淋巴隱病毒屬（醫(yī)學）
[0194] EBV-(伯基特淋巴瘤）
[0195] 痘病毒科
[0196] 亞科：
[0197] 帶狀痘病毒亞科（醫(yī)學-獸醫(yī)）
[0198] 屬：
[0199] 天花（痘瘡）
[0200] 痘疹（牛痘）
[0201] 副痘病毒屬-獸醫(yī)
[0202] 禽痘病毒（Auipoxvirus)-獸醫(yī)
[0203] 山羊痘病毒屬（Capripoxvirus)
[0204] 兔痘病毒屬（Leporipoxvirus)
[0205] 豬痘病毒屬（Suipoxviru' s)
[0206] 亞科：
[0207] 昆蟲痘病毒亞科（Entemopoxviridue)
[0208] 嗜肝DNA病毒科
[0209] 乙型肝炎病毒
[0210] 未分類的丁型肝炎病毒
[0211] 表 2
[0212] 細菌病原體
[0213] 病原性革蘭陽性球菌包括：肺炎球菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬。
[0214] 病原性革蘭陰性球菌包括：腦膜炎球菌屬和淋球菌屬。
[0215] 病原性革蘭陰性腸道桿菌包括：腸桿菌科、假單胞菌屬、不動桿菌屬和艾肯菌屬、 類鼻疽、沙門菌屬、志賀菌屬、嗜血桿菌屬、軟性下瘡、布魯菌屬、土拉菌屬、耶爾森菌屬（巴 斯德菌屬）、念珠狀鏈桿菌（streptobacillus mortiliformis)和螺菌屬、單核細胞增生李 斯特菌、豬紅斑丹毒絲菌、白喉（diphtheria)、霍亂、炭疽（anthrax)、杜諾萬菌（性病性肉 芽腫）和巴爾通氏體?。╞artonellosis)。
[0216] 病原性厭氧菌包括：破傷風（tetanus)、肉毒桿菌（botulism)、其他梭菌屬、結(jié)核 (tuberculosis)、麻風（leprosy)和其他分枝桿菌屬。
[0217] 病原性螺旋體病包括：梅毒、密螺旋體病、熱帶肉芽腫（yaws)、品他?。╬inta)和 地方流行性梅毒和鉤端螺旋體病。
[0218] 由較高級病原菌和病原性真菌引起的其他感染包括：放線菌病、諾卡菌病、隱球菌 病、酵母病、組織胞漿菌病和球孢子菌病、念珠菌病、曲霉病、和毛霉菌病、孢子絲菌病、副球 抱子菌?。╬aracoccidiodomycosis)、霉樣真菌?。╬etriellidiosis)、球擬酵母菌病、足 分枝菌病和著色真菌?。╟hromomycosis)以及皮膚真菌病。
[0219] 立克次體感染包括立克次體屬微生物（rickettsial)和立克次體病。
[0220] 支原體和衣原體感染的實例包括：支原體肺炎、性病性淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和圍產(chǎn) 期衣原體感染。
[0221] 病原性真核細胞
[0222] 病原性原蟲和蠕蟲以及由此的感染包括：阿米巴病、瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓 形體病、卡氏肺囊蟲病、巴貝蟲病、賈第鞭毛蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血吸蟲病、線蟲病、蛭 (trematodes)、吸蟲病和絳蟲（cestode)(帶蟲（tapeworm))感染。
[0223] 為制備基因疫苗以提供對病原體的保護力，必須在基因構(gòu)建體中作為靶的編碼序 列而包含編碼免疫原性蛋白的遺傳物質(zhì)，以引發(fā)對其的保護性免疫應答。因為DNA和RNA 均較小，而制備相對容易，因此本發(fā)明提供了可采用多種病原體抗原進行疫苗接種的另外 優(yōu)點。用于基因疫苗的基因構(gòu)建體可包含編碼多種病原體抗原的遺傳物質(zhì)。例如，一個構(gòu) 建體中可包含數(shù)種病毒基因，從而提供多種靶。
[0224] 表1和表2包括一些致病因子和生物體的列表，可以制備它們的基因疫苗以保護 個體免遭其感染。
[0225] 在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與在均以引用方式并入本文的以下專 利文獻中所示的一種或多種DNA疫苗構(gòu)建體的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的 IL-12與PCT申請PCT/US07/74769和相應的美國專利申請?zhí)?2/375, 518中所公開的（人 免疫缺陷病毒）HIV疫苗、（丙型肝炎病毒）HCV疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV)疫苗、流感疫苗或 hTERT靶向癌癥疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與PCT申請PCT/ US08/83281和相應的美國專利申請?zhí)?2/269, 824或PCT申請PCT/US11/22642和相應的 美國專利申請?zhí)?2/694, 238中所公開的流感疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu) 化的IL-12與PCT申請PCT/US08/081627和相應的美國專利申請13/127,008中所公開的 HCV疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與PCT申請PCT/US10/21869 和相應的美國專利申請?zhí)?2/691，588或美國臨時專利申請?zhí)?1/442, 162中所公開的HPV 疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與PCT申請PCT/US09/045420和 相應的美國專利申請?zhí)?2/473634中所公開的天花疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗 包含優(yōu)化的IL-12與PCT申請PCT/US09/039656和相應的美國專利申請?zhí)?2/936, 186中 所公開的基孔肯雅病疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與PCT申 請PCT/US10/55187中所公開的口蹄疫病毒（FMDV)疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗 包含優(yōu)化的IL-12與美國臨時專利申請?zhí)?1/386, 973中所公開的瘧疾疫苗的組合。在一 些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與美國臨時專利申請?zhí)?1/413, 176或美國臨時專 利申請?zhí)?1/417, 817中所公開的前列腺癌疫苗的組合。在一些實施方案中，疫苗包含優(yōu) 化的IL-12與美國臨時專利申請?zhí)?1/438,089中所公開的人巨細胞病毒（CMV)疫苗。在 一些實施方案中，疫苗包含優(yōu)化的IL-12與以下專利中所公開的耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus) (MRSA)疫苗：2011 年 12 月 12 日提交的名稱為 "PROTEINS COMPRISING MRSA PBP2MND FRAGMENTS THEREOF,NUCLEIC ACIDS ENCODING THE SAME,AND COMPOSITIONS AND THEIR USE TO PREVENT AND TREAT MRSA INFECTIONS" 的美國臨時專 利申請?zhí)?1/569, 727和指定的代理人案卷號133172. 04000 (X5709)及其相應的PCT申請， 其要求與此提交的專利申請同日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/569, 727的優(yōu)先權(quán)，它們 均以引用方式整體并入本文。本文所公開的所有專利和專利申請均以引用方式整體并入本 文。
[0226] 本發(fā)明另一方面提供了向抵御過度增殖性疾病特征性的過度增殖性細胞賦予保 護性免疫應答的方法，以及治療患過度增殖性疾病個體的方法。過度增殖性疾病的實例包 括所有形式的癌癥和銀屑病。
[0227] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包含編碼免疫原性"過度增殖細胞"相關蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu) 建體引入個體細胞能導致在個體的疫苗接種細胞內(nèi)產(chǎn)生這些蛋白。為了對過度增殖性疾病 免疫，可向個體施用包含編碼過度增殖性疾病相關蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體。
[0228] 為使過度增殖相關蛋白成為有效的免疫原性靶標，其必須是只在過度增殖細胞內(nèi) 產(chǎn)生，或在過度增殖細胞內(nèi)產(chǎn)生的水平高于正常細胞的蛋白。靶抗原包括此類蛋白、其片段 和肽，它們包含存在于此類蛋白上的至少一個表位。在一些情況下，過度增殖相關蛋白是編 碼蛋白的基團的突變產(chǎn)物。除了以下方面外，突變基因編碼的蛋白與正常蛋白幾乎相同：其 氨基酸序列略有不同因而產(chǎn)生正常蛋白上沒有的不同表位。此類靶蛋白包括由諸如myb、 myc、fyn的原癌基因和轉(zhuǎn)座基因 bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF編碼的那些蛋 白。除了作為靶抗原的原癌基因產(chǎn)物外，用于抗癌治療和保護性方案的靶蛋白還包含B細 胞淋巴瘤所產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區(qū)，在一些實施方案 中，它們也可用作自身免疫疾病的靶抗原。可采用其他腫瘤相關蛋白作為靶蛋白，諸如以較 高的水平存在于腫瘤細胞中的蛋白，包括單克隆抗體17-IA所識別的蛋白和葉酸結(jié)合蛋白 或 PSA。
[0229] 雖然可采用本發(fā)明使個體對若干癌癥形式中的一種或多種免疫，但是本發(fā)明尤其 可用于預防性免疫接種易患某種特定癌癥或曾患癌癥因而易復發(fā)的個體。遺傳學和技術(shù)以 及流行病學的發(fā)展已能測定和評估個體發(fā)生癌癥的幾率和風險?？衫没蚝Y檢和/或家 族健康史來預測某特定個體患若干癌癥中任何一種的可能性。
[0230] 類似地，那些曾患癌癥和已接受治療移除癌癥或處于緩解中的個體尤其易復發(fā)。 作為治療方案的一部分，可對此類個體針對已明確診斷的癌癥進行免疫接種以抵御復發(fā)。 因此，一旦得知個體曾患有某種類型的癌癥并有復發(fā)危險時，即可對他們進行免疫接種，以 便使其免疫系統(tǒng)作好準備以抵御該癌癥的任何將來出現(xiàn)。
[0231] 本發(fā)明提供治療患過度增殖性疾病個體的方法。在此類方法中，引入的基因構(gòu)建 體用作免疫治療劑，從而指導和促進個體的免疫系統(tǒng)抵御產(chǎn)生靶蛋白的過度增殖細胞。在 治療或者預防癌中，不含細胞的實施方案是尤其有用的。
[0232] 本發(fā)明通過賦予對抗自身免疫相關靶（包括細胞受體和產(chǎn)生針對"自身抗原"的 抗體的細胞）的廣泛保護性免疫應答而提供治療患自身免疫疾病和障礙的個體的方法。
[0233] T細胞介導的自身免疫疾病包括類風濕關節(jié)炎（RA)、多發(fā)性硬化癥（MS)、斯耶格 倫綜合征、肉樣瘤病、胰島素依賴性糖尿?。↖DDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應性關節(jié)炎、強直 性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病、克羅恩病和潰瘍性 結(jié)腸炎。上述各種疾病的特征在于結(jié)合內(nèi)源性抗原并引起自身免疫疾病相關的炎性級聯(lián)反 應的T細胞受體。針對T細胞可變區(qū)的疫苗接種將引起包括CTL的免疫應答從而消除那些 T細胞。
[0234] 在RA中，已表征了在該疾病中涉及的Τ細胞受體（TCR)的幾個特異性可變區(qū)。這 些TCR包括νβ-3、νβ-14、2〇νβ-17和Va-17。因此，用編碼這些蛋白中至少一種的DNA 構(gòu)建體進行疫苗接種將引起免疫應答，該免疫應答靶向RA中涉及的Τ細胞。參見：H〇Well， M.D.等人，1991Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 :10921-10925 ;Piliard，X.等人，1991Science 253 :325-329 ;Williams，W. V.等人，1992J Clin. Invest. 90 :326-333 ;這些文獻的每一者 以引用方式并入本文。在MS中，已表征了在該疾病中涉及的TCR的幾個特異性可變區(qū)。這 些TCR包括V β -7和V α -10。因此，用編碼這些蛋白中至少一種的DNA構(gòu)建體進行疫苗接 種將引起免疫應答，該免疫應答靶向MS中涉及的Τ細胞。參見jucherpfennigj.W.等人， 1990Science 248 :1016-1019 ;0ksenberg，J.R.等人，1990Nature 345:344-346;這些文獻 的每一者以引用方式并入本文。
[0235] 在硬皮病中，已表征了在該疾病中涉及的TCR的幾個特異性可變區(qū)。這些TCR包 括：V β _6、V β _8、V β -14 和 V α -16、V a _3C、V α _7、V α -14、V α -15、V α -16、V α -28 和 V α-12。因此，用編碼這些蛋白中至少一種的DNA構(gòu)建體進行疫苗接種將引起免疫應答，該 免疫應答靶向硬皮病中涉及的Τ細胞。
[0236] 為治療Τ細胞介導的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可變區(qū)尚未表征的那些疾病， 可以進行滑膜活檢?？刹杉嬖讦臣毎臉悠?，并用標準技術(shù)鑒定那些TCR的可變區(qū)?？?利用這些信息制備基因疫苗。
[0237] Β細胞介導的自身免疫疾病包括狼瘡（SLE)、格雷夫斯病、重癥肌無力、自身免疫 溶血性貧血、自身免疫血小板減少癥、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽道硬化癥和惡性貧血。 這些疾病各自的特征在于結(jié)合到內(nèi)源性抗原并引發(fā)與自身免疫疾病相關的炎性級聯(lián)反應 的抗體。針對抗體的可變區(qū)的疫苗接種將引發(fā)包括CTL的免疫應答以消除產(chǎn)生這種抗體的 Β細胞。
[0238] 為治療Β細胞介導的自身免疫疾病患者，必須鑒定自身免疫活動中涉及的抗體的 可變區(qū)。可進行活檢，并可采集在炎癥部位存在的抗體樣品?？捎脴藴始夹g(shù)鑒定那些抗體 的可變區(qū)?？衫眠@些信息制備基因疫苗。
[0239] 就SLE而言，據(jù)信一種抗原為DNA。因此，可以篩檢待免疫接種以抵御SLE的患者 血清中的抗DNA抗體，并可制備包含DNA構(gòu)建體的疫苗，所述DNA構(gòu)建體編碼存在于所述血 清中的此類抗DNA抗體的可變區(qū)。
[0240] TCR和抗體可變區(qū)之中的共同結(jié)構(gòu)特征是熟知的。通?？砂凑找韵率熘姆椒òl(fā) 現(xiàn)編碼特定TCR或抗體的DNA序列，例如以引用方式并入本文的以下文獻中所述的方法： Kabat 等人 1987Sequence of Proteins of Immunological Interest U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda Md.。此外，克隆抗體的功能性可變區(qū)的一般方法 可見于以引用方式并入本文的文獻：Chaudhary，V.K.等人，1990Proc. Natl. Acad Sci. USA 87 ：1066〇
[0241] 除了使用可表達形式的免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列來改進基因疫苗外，本發(fā)明還涉 及改進的減毒活疫苗以及使用重組載體以遞送編碼抗原的外源基因的改進疫苗。減毒 活疫苗和那些使用重組載體以遞送外源基因的疫苗的實例見述于美國專利：4, 722, 848、 5, 017, 487、5, 077, 044、5, 110, 587、5, 112, 749、5, 174, 993、5, 223, 424、5, 225, 336、 5, 240, 703、5, 242, 829、5, 294, 441、5, 294, 548、5, 310, 668、5, 387, 744、5, 389, 368、 5, 424, 065、5, 451，499、5, 453, 364、5, 462, 734、5, 470, 734 和 5, 482, 713,它們均以引用方 式并入本文。本發(fā)明提供基因構(gòu)建體，其包含IL-12構(gòu)建體或其功能片段的核苷酸序列， 其中所述核苷酸序列可操作地連接到調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列可在疫苗中起到實現(xiàn)表達的作 用。將基因構(gòu)建體并入減毒活疫苗和重組疫苗中以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的改進疫苗。
[0242] 疫苗還可以包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是作為媒介 物、佐劑、載體或稀釋劑的功能分子。藥學上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進劑，其可包含 表面活性劑例如免疫刺激復合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物（包括單磷酰脂 質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物、小囊泡例如角g烯和角g烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、 病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆?；蚱渌阎霓D(zhuǎn)染促進劑。
[0243] 轉(zhuǎn)染促進劑為聚陰離子、聚陽離子，包括多聚L-谷氨酸（LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進劑 為多聚L-谷氨酸，并且更優(yōu)選地，多聚L-谷氨酸以低于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn) 染促進劑還可以包括表面活性劑例如免疫刺激復合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐劑、LPS類 似物（包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物、小囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，并且也可將 透明質(zhì)酸與基因構(gòu)建體一同施用。在一些實施方案中，DNA質(zhì)粒疫苗還可以包含轉(zhuǎn)染促進 劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體，包括作為DNA-脂質(zhì)體混合物的卵磷脂脂質(zhì)體或其他本領域已知的脂 質(zhì)體（參見例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆?；蚱渌?知的轉(zhuǎn)染促進劑。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染促進劑為聚陰離子、聚陽離子，包括多聚L谷氨酸（LGS)或 脂質(zhì)。疫苗中轉(zhuǎn)染劑的濃度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0· 750mg/ml、低于 0· 500mg/ml、低于 0· 250mg/ml、低于 0· 100mg/ml、低于 0· 050mg/ml 或低于 0· 010mg/ml。
[0244] 藥學上可接受的賦形劑可以是一種或多種另外的佐劑。佐劑可以是從相同的質(zhì)粒 或從替代質(zhì)粒表達的其他基因，或作為蛋白與疫苗中的上述質(zhì)粒組合地遞送。所述一種或 多種佐劑可以是蛋白和/或編碼選自以下蛋白的核酸分子：α -干擾素（IFN- α )、β -干擾 素（IFN- β )、γ -干擾素、血小板衍生生長因子（TOGF)、TNF a、TNF β、GM-CSF、表皮生長因 子（EGF)、皮膚Τ細胞虜獲趨化因子（CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子（TECK)、粘膜相關上皮 趨化因子（MEC)、IL-15(包括這樣的IL-15,其信號序列或編碼信號序列的編碼序列缺失， 且任選地包含不同的信號肽（例如來自IgE的信號肽）或編碼不同信號肽（例如來自IgE 的信號肽）的編碼序列）、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、 IL-18、MCP-1、ΜΙΡ-1 α、ΜΙΡ-1 β、IL-8、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、 GlyCAM-1、MadCAM-l、LFA-l、VLA-l、Mac-1、ρ150. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、 LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突變體形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因 子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、 TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、 卩〇8、。-加11、5?-1、六？-14?-2、？38、？651^1、]\^088、1狀1(、了狀卩6、11^、失活肌1(、5六？1(、5六？-1、 JNK、干擾素應答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、 RANK、RANK 配體、0x40、0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、 TAPI、TAP2及其功能片段或其組合。在一些實施方案中，另外的佐劑可以是一種或多種蛋 白和/或編碼選自IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES的蛋白的核酸分子。IL-15 構(gòu)建體和序列的實例在PCT申請PCT/US04/18962和相應的美國專利申請10/560, 650、以 及在PCT申請PCT/US07/00886和相應的美國專利申請12/160, 766、以及在PCT申請PCT/ US10/048827中有所公開。IL-28構(gòu)建體和序列的實例在PCT申請PCT/US09/039648和相應 的美國專利申請12/936, 192中有所公開。RANTES以及其他構(gòu)建體和序列在PCT申請PCT/ US1999/004332和相應的美國專利申請09/622452中有所公開。RANTES構(gòu)建體和序列的其 他實例在PCT申請PCT/US11/024098中有所公開。RANTES以及其他構(gòu)建體和序列的實例 在PCT申請PCT/US1999/004332和相應的美國專利申請09/622452中有所公開。RANTES 構(gòu)建體和序列的其他實例在PCT申請PCT/US11/024098中有所公開。趨化因子CTACK、 TECK和MEC構(gòu)建體和序列的實例在PCT申請PCT/US2005/042231和相應的美國專利申請 11/719, 646中有所公開。0X40和其他免疫調(diào)節(jié)劑的實例在美國專利申請10/560, 653中有 所公開。DR5和其他免疫調(diào)節(jié)劑的實例在美國專利申請09/622452中有所公開。
[0245] 疫苗還可以包含1994年4月1日提交的美國專利021,579(其以引用方式整體并 入本文）中描述的基因疫苗促進劑。
[0246] 疫苗可按如下的量包含共有抗原和質(zhì)粒；約1納克至100毫克；約1微克至約10 毫克；或優(yōu)選約〇. 1微克至約10毫克；或更優(yōu)選約1毫克至約2毫克。在一些優(yōu)選的實施 方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克的DNA。在一些優(yōu)選的實施 方案中，藥物組合物包含約10納克至約800微克的DNA。在一些優(yōu)選的實施方案中，藥物組 合物包含約0. 1至約500微克的DNA。在一些優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含約1至約 350微克的DNA。在一些優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克、約100至 約200微克、約1納克至100暈克、約1微克至約10暈克、約0. 1微克至約10暈克、約1暈 克至約2毫克、約5納克至約1000微克、約10納克至約800微克、約0. 1至約500微克、約 1至約350微克、約25至約250微克、約100至約200微克的共有抗原或其質(zhì)粒。
[0247] 可根據(jù)待使用的施用模式來配制疫苗。注射用疫苗藥物組合物可以是無菌、無熱 原以及無顆粒的?？墒褂玫葷B制劑或溶液。等滲添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山 梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收縮劑。等滲溶液可包括磷酸緩沖鹽水。疫苗還可以包含穩(wěn) 定劑，包括明膠和白蛋白。穩(wěn)定化可使得制劑在室溫或環(huán)境溫度下長期穩(wěn)定，例如將LGS或 聚陽離子或聚陰離子加入疫苗制劑。
[0248] 5.遞送疫苗的方法
[0249] 本文提供了用于遞送包含IL-12構(gòu)建體的疫苗以針對疫苗免疫原有效產(chǎn)生免疫 應答的方法。可提供遞送疫苗或接種的方法以誘導治療性和預防性免疫應答。接種過程 可在哺乳動物中產(chǎn)生抗免疫原免疫應答?？上騻€體遞送疫苗以調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫系統(tǒng) 的活動以及增強免疫應答。疫苗的遞送可以是轉(zhuǎn)染在一個或多個核酸分子上編碼免疫原和 IL-12構(gòu)建體的序列。該編碼序列在細胞中表達并遞送到細胞表面，在其上免疫系統(tǒng)加以識 別并誘導細胞、體液或細胞和體液應答。疫苗的遞送可用于通過向哺乳動物施用如上所述 的疫苗來誘導或引發(fā)哺乳動物中針對免疫原的免疫應答。包含IL-12構(gòu)建體導致更有效的 免疫應答。
[0250] 在將疫苗和質(zhì)粒遞送進哺乳動物細胞后，轉(zhuǎn)染的細胞將表達和分泌由通過疫苗注 射的質(zhì)粒所編碼的免疫原和IL-12。這些免疫原將被免疫系統(tǒng)識別為外來物并將產(chǎn)生針對 它們的抗體。這些抗體將被免疫系統(tǒng)維持并能對后續(xù)感染產(chǎn)生有效的應答。存在由IL-12 構(gòu)建體編碼的IL-12導致更強的免疫應答。
[0251] 可向哺乳動物施用疫苗以引起哺乳動物的免疫應答。哺乳動物可以為人、靈長類 動物、非人靈長類動物、母牛、牛、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科動物、鹿、刺猬、 象、胳馬、羊§它、小鼠、大鼠和雞。
[0252] a.聯(lián)合治療
[0253] 可將IL-12構(gòu)建體與其他蛋白和/或編碼以下一者或多者的基因組合施用： α -干擾素 、Y -干擾素、血小板衍生生長因子（PDGF)、TNF a、TNF β、GM_CSF、表皮生長因子 (EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子（CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子（TECK)、粘膜相關上皮趨 化因子（MEC)、IL-15 (包括信號序列缺失的并任選地包含來自IgE的信號肽的IL-15)、MHC、 CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-28、MCP-1、MIP-1α、ΜΙΡ-1β、 IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、Ρ-選擇蛋白、Ε-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、 VLA-1、Mac-1、ρ150· 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、 IL-18的突變體形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因 子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF 受體、Flt、Ap〇-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Ap〇-3、AIR、LARD、 NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、 八口-2、？38、？651^1、]\^088、1狀1(、1狀?6、11^、失活肌1(、34?1(、34?-1、見1(、干擾素應答基因、 NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、 0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片 段或其組合。
[0254] 可通過不同的途徑施用疫苗，包括經(jīng)口、胃腸外、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)直腸、經(jīng)粘膜、局 部、通過吸入、通過頰面施用、胸膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、鞘內(nèi)以及關 節(jié)內(nèi)或其組合。對于獸醫(yī)學用途，可按正常獸醫(yī)學實踐將組合物作為適當?shù)乜山邮艿闹苿?施用。獸醫(yī)可容易地確定最適合于特定動物的給藥方案和施用途徑?？衫贸Ｒ?guī)注射器、 無針注射裝置、"微粒轟擊基因槍"或其他物理方法諸如電穿孔（"EP"）、"水動力學法"或 超聲施用疫苗。
[0255] 可通過若干熟知的技術(shù)將疫苗的質(zhì)粒遞送至哺乳動物，所述技術(shù)包括利用和不利 用體內(nèi)電穿孔的DNA注射（也稱為DNA接種）、脂質(zhì)體介導的、納米顆粒促進的重組載體例 如重組腺病毒、重組腺病毒相關病毒和重組疫苗。共有抗原可通過DNA注射結(jié)合體內(nèi)電穿 孔來遞送。
[0256] b.電穿孔
[0257] 可使用電穿孔裝置來實現(xiàn)通過疫苗質(zhì)粒的電穿孔而施用疫苗，所述電穿孔裝置可 被構(gòu)造成將有效引起可逆的孔在細胞膜中形成的能量脈沖遞送至哺乳動物的所需組織，并 且優(yōu)選的是，能量脈沖是與由使用者預設的電流輸入相似的恒定電流。電穿孔裝置包括 電穿孔組件、電極組合件或柄部組合件。電穿孔組件可以包括并納入電穿孔裝置的各種 元件（包括控制器、電流波形發(fā)生器、阻抗測試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態(tài)報告元件、 通訊端口、存儲器組件、電源和電源開關）的一種或多種。電穿孔可使用體內(nèi)電穿孔裝置 例如 CELLECTRA EP 系統(tǒng)（Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)或 Eigen 電穿孔儀 (Genetronics，San Diego, CA)來實現(xiàn)以有利于質(zhì)粒對細胞的轉(zhuǎn)染。
[0258] 電穿孔組件可用作電穿孔裝置的一個元件，而其他元件是與電穿孔組件相連的單 獨元件（或組件）。電穿孔組件可以用作電穿孔裝置的不止一個元件，這些元件可以與電 穿孔組件分開的電穿孔裝置的另外其他元件相連。作為一個機電或機械裝置的部件存在的 電穿孔裝置的元件可以不受限制，因為所述元件可用作一個裝置或用作彼此連通的單獨元 件。電穿孔組件能夠遞送能量脈沖并包括反饋機制，該能量脈沖在所需的組織中產(chǎn)生恒定 電流。電極組合件可包括具有空間排布的多個電極的電極陣列，其中電極組合件接收來自 電穿孔組件的能量脈沖并通過電極將該能量脈沖遞送至所需的組織。所述多個電極中的至 少一個在能量脈沖的遞送中是中性的，并測量所需組織中的阻抗，且將該阻抗傳至電穿孔 組件。反饋機制可以接收測得的阻抗，并可調(diào)節(jié)電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒定電 流。
[0259] 多個電極可以按分散的形式遞送能量脈沖。所述多個電極可以通過電極的控制按 程序化的序列以分散形式遞送能量脈沖，并且所述程序化的序列由使用者輸入到電穿孔組 件。程序化的序列可包括按序列遞送的多個脈沖，其中所述多個脈沖的每個脈沖由至少兩 個活性電極遞送，其中一個是測量阻抗的中性電極，并且其中所述多個脈沖的后續(xù)脈沖由 不同于至少兩個活性電極（其中一個是測量阻抗的中性電極）的電極遞送。
[0260] 反饋機制由硬件或軟件執(zhí)行。反饋機制由模擬閉環(huán)電路執(zhí)行。該反饋每50ys、 20 μ s、10 μ s或1 μ s發(fā)生一次，但優(yōu)選地為實時反饋或瞬時反饋（S卩，通過測定響應時間的 可用技術(shù)測定時基本上為瞬時的）。中性電極可測量所需組織中的阻抗并將該阻抗傳至反 饋機制，并且反饋機制響應該阻抗且調(diào)節(jié)能量脈沖以將恒定電流維持在與預設電流相似的 值。在能量脈沖的遞送過程中，反饋機制連續(xù)且瞬時地維持恒定電流。
[0261] 可促進本發(fā)明的DNA疫苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的實例包括在 Draghia-Akli等人的美國專利7, 245, 963、Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630 中所述的那些，這些專利的內(nèi)容均以引用方式整體并入本文?？捎糜诖龠MDNA疫苗遞送的 其他電穿孔裝置和電穿孔方法包括在2007年10月17日提交的共同未決和共同擁有的美 國專利申請11/874072中所提供的那些，所述美國專利申請根據(jù)35USC 119(e)要求2006 年10月17日提交的美國臨時專利申請60/852, 149和2007年10月10日提交的60/978, 982 的權(quán)益，將這些專利申請均以引用方式整體并入本文。
[0262] Draghia-Akli等人的美國專利7, 245, 963描述了模塊化電極系統(tǒng)及其在促進將 生物分子引入體內(nèi)或植物的選定組織的細胞中的用途。該模塊化電極系統(tǒng)可包括多個針電 極；皮下針；提供從可編程恒定電流脈沖控制器向所述多個針電極的導電性連接的電連接 器；和電源。操作員可握住安裝在承載結(jié)構(gòu)上的所述多個針電極并將它們牢牢插入體內(nèi)或 植物的選定組織。然后生物分子經(jīng)由皮下針遞送至選定的組織。激活可編程恒定電流脈沖 控制器并將恒定電流電脈沖施加到所述多個針電極。施加的恒定電流電脈沖促進生物分子 引入所述多個電極之間的細胞。美國專利7, 245, 963的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0263] Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630描述了可用于有效促進將生物分 子引入體內(nèi)或植物的選定組織的細胞中的電穿孔裝置。所述電穿孔裝置包括由軟件或固件 規(guī)定其操作的電動裝置（"EKD裝置"）。EKD裝置基于使用者控制和脈沖參數(shù)的輸入在電 極之間產(chǎn)生一系列可編程恒定電流脈沖模式，并允許存儲和獲得電流波形數(shù)據(jù)。該電穿孔 裝置還包括具有針電極陣列的可更換電極盤、用于注射針的中心注射通道，以及可移除的 導向盤。將美國專利公布2005/0052630的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0264] 美國專利7, 245, 963和美國專利公布2005/0052630中所述的電極陣列和方法不 僅可適用于深層穿入諸如肌肉的組織，而且還可適用于深層穿入其他組織或器官。由于電 極陣列的構(gòu)造，注射針（用于遞送所選生物分子）也被完全插入靶器官，并在由電極所預描 繪的區(qū)域垂直于所述靶組織進行注射。美國專利7, 245, 963和美國專利公布2005/005263 中所述的電極優(yōu)選為20mm長和21號。
[0265] 此外，在一些實施方案中設想了包括電穿孔裝置及其用途，在這些實施方案中存 在以下專利中所述的那些電穿孔裝置：1993年12月28日公布的美國專利5, 273, 525、2000 年8月29日公布的美國專利6, 110, 16U2001年7月17日公布的6, 261，281和2005年10 月25日公布的6, 958, 060以及2005年9月6日公布的美國專利6, 939, 862。此外，本文設 想了涵蓋2004年2月24日公布的美國專利6, 697, 669 (涉及使用多種裝置中的任一種遞 送DNA)以及2008年2月5日公布的美國專利7, 328, 064中所提供的適于DNA注射方法的 主題的專利。將上述專利以引用方式整體并入本文。
[0266] c.制備DNA質(zhì)粒的方法
[0267] 本文提供了用于制備構(gòu)成本文所述的DNA構(gòu)建體和疫苗的DNA質(zhì)粒的方法。在最 終亞克隆進哺乳動物表達質(zhì)粒的步驟后，可使用本領域已知的方法將DNA質(zhì)粒用于在大規(guī) 模發(fā)酵罐中接種細胞培養(yǎng)物。
[0268] 可使用已知的裝置和技術(shù)的組合來配制或制備與本發(fā)明的EP裝置一起使用的 DNA質(zhì)粒，但優(yōu)選地使用在2007年5月23日提交的許可、共同未決的美國臨時專利申請美 國60/939,792中所述的優(yōu)化質(zhì)粒制備技術(shù)來制造質(zhì)粒。在一些實例中，可以大于或等于 10mg/mL的濃度配制這些研究中使用的DNA質(zhì)粒。除了美國專利60/939792中所述的裝置 和方案（包括2007年7月3日發(fā)布的許可美國專利7, 238, 522中所述的裝置和方案）夕卜， 制造技術(shù)還包括或結(jié)合對于本領域普通技術(shù)人員而言通常已知的各種裝置和方案。將上述 申請和專利（分別為美國專利60/939, 792和美國專利7, 238, 522)整體并入本文。
[0269] 6.免疫調(diào)節(jié)組合物和方法
[0270] 在一些實施方案中，在不添加編碼免疫原的核酸序列的情況下遞送編碼IL-12亞 單位的核酸序列。在此類方法中，將編碼IL-12亞單位的核酸序列用作免疫治療劑，其在表 達以產(chǎn)生功能性IL-12時，為個體賦予所需的免疫調(diào)節(jié)作用。除了不包括編碼免疫原的核 酸序列外，均如上所述提供并遞送編碼IL-12亞單位的核酸序列。在此類方法中，可將編碼 IL-12亞單位的核酸序列單獨地或與其他免疫調(diào)節(jié)蛋白（諸如在標題為"聯(lián)合治療"章節(jié)中 所述的那些）相結(jié)合用作免疫治療劑。
[0271] 實施例
[0272] 在以下實施例中進一步對本發(fā)明進行闡述。應當理解，這些實施例雖然表示本發(fā) 明的優(yōu)選實施方案，但僅以舉例說明的方式給出。根據(jù)上文中的論述和這些實施例，本領域 技術(shù)人員可確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明進 行各種改變和變動以使之適合于各種用法和條件。因此，根據(jù)上述說明，除了本文中顯示和 描述的變動外的本發(fā)明的各種變動對于本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的。此類變動也旨 在落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0273] 實施例1
[0274] 比較 phuIL12_opt 與 phuIL12_nonopt 的表達水平。
[0275] 對phuIL12_opt與phuIL12_nonopt的表達水平進行了比較，表明重要的密碼子/ RNA優(yōu)化策略可增強設計的合成IL-12的表達水平/佐劑效應。
[0276] 使用 FuGene6 轉(zhuǎn)染試劑（Roche Applied Science，Indianapolis，IN)根據(jù)制 造商的說明將293T細胞（7.5X105個）在6孔板中分別用2或4yg huIL12-〇pt或 huIL12-nonopt 轉(zhuǎn)染。將 DNA 和 FuGene6 轉(zhuǎn)染試劑以 1 μ g DNA : 3 μ 1 FuGene6 試劑 的DNA : FuGene6比率按順序加入無血清的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基的體積通過制備等于 200 μ 1的整個混合物總體積所需的量而確定。將混合物加入細胞的各孔中并在37°C下在 5% C02環(huán)境中溫育48小時。在溫育結(jié)束時，采集上清液樣品進行ELISA測定。
[0277] 將高蛋白結(jié)合板（Nunc，Rochester，NY)用100 μ 1/孔的得自人IL-12ELISA試劑 盒（Mabtech，Mariemont，0Η)的單克隆抗體ΜΤ86/221包被并在4°C下溫育過夜。在溫育 后，將板用PBST(含0.1% Tween 20的DPBS)洗滌兩次，并用補充了 0.05% Tween 20和 0. 1% BSA的200 μ 1/孔的DPBS溶液封閉1小時。隨后將板用PBST洗滌。使用制造商的 說明，由hIL-12p70(Mabtech，Mariemont，0Η)制備了陽性標準品。將陽性標準品和上清液 以1 : 50、1 : 150、1 : 450、1 : 1350和1 : 4050的稀釋度按100 μ 1/孔的體積加入平 行孔。使用上述封閉液將樣品和陽性標準品稀釋。然后將板在4°C下溫育過夜。之后，將板 用 PBST 洗滌，并用 100 μ 1/ 孔的 mAB MT618-生物素（Mabtech，Mariemont，0H)溫育 1 小 時。在溫育后，將板再次洗滌，并用1〇〇μ1/孔的以1 : 1000在封閉緩沖液中稀釋的鏈霉 親和素-HRP溫育1小時。然后將板用PBST再次洗漆，并用ΤΜΒ和2Ν H2S04顯色。使用分 光光度計在450nm處讀取板。
[0278] 如圖1A和1B所示，huIL12_opt質(zhì)粒與huIL12_nonopt相比表現(xiàn)出更高的IL-12 表達水平。明顯的是，密碼子/RNA優(yōu)化策略改善了 IL-12的表達。
[0279] 實施例2
[0280] 通過pMacIL12-〇pt接種引起的增強PSA和PSMA特異性細胞免疫應答。
[0281] 將恒河猴用lmg PSA和PSMA與0. 04mg pMacIL-12-opt的組合經(jīng)肌內(nèi)免疫，然后 用得自Inovio Pharmaceuticals的Cellectra裝置電穿孔。各免疫兩周后，米集恒河猴血 樣，并分離PBMC以進行PSA和PSMA特異性IFN- γ ELISpot測定。接受pMacIL12-〇pt的動 物組與未接受pMacIL12-〇pt的動物組相比顯示出峰值應答的約3倍增加（圖2)。
[0282] 實施例3
[0283] 通過pMacIL12-〇pt接種引起的增強HBV核心和表面抗原特異性細胞免疫應答。
[0284] 將恒河猴用lmg核心和表面抗原與0. 04mg pMacIL-12-opt的組合經(jīng)肌內(nèi)免疫，然 后用得自Inovio Pharmaceuticals的Cellectra裝置電穿孔。各免疫兩周后，采集恒河猴 血樣，并分離PBMC以進行核心和表面抗原特異性IFN- γ ELISpot測定。接受pMacIL12-〇pt 的動物組與未接受pMacIL12-〇pt的動物組相比顯示出細胞應答的幅度和廣度的增加（圖 3)。
【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，所述組合物包含a)編碼IL-12P35亞單位或其功能片段的核酸序列，以 及b)編碼IL-12p40亞單位或其功能片段的核酸序列，其中 編碼IL-12p35亞單位或其功能片段的所述核酸序列與SEQ ID NO :1至少98%同源并 編碼與SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白，或編碼與SEQ ID NO :1至少98%同源的核酸序 列的功能片段以及編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同源的蛋白；并且 編碼IL-12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列與SEQ ID N0:3至少98%同源并 編碼與SEQ ID NO :4至少98 %同源的蛋白，或編碼與SEQ ID NO :3至少98 %同源的核酸序 列的功能片段以及編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列與SEQ ID N0:1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白；并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列與SEQ ID N0:1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白；并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼SEQ ID NO :2 ;并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列與SEQIDN0:3至少98%同源并編碼SEQID NO :4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列與SEQ ID N0:1至少99%同源并編碼與SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白；并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列與SEQ ID N0:3至少99%同源并編碼與SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列與SEQ ID NO :1至少99%同源并編碼SEQ ID NO :2 ;并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列與SEQ ID N0:3至少99%同源并編碼SEQ ID NO :4。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，包含： 編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列為SEQ ID N0:1，并且 編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列為SEQ ID NO :3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，所述組合物被配制成使用電穿孔遞送給個體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序列 位于與編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列不同的核酸分子上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12P35亞單位的所述核酸序 列位于質(zhì)粒上，并且編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列位于不同的質(zhì)粒上。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序 列和編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序 列和編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列位于相同的質(zhì)粒上。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序 列和編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上并可操作地連接到不同 的啟動子。
15. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中編碼IL-12p35亞單位的所述核酸序 列和編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列位于相同的質(zhì)粒上并可操作地連接到不同的啟 動子。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，還包含編碼免疫原的核酸序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，還包含編碼來自病原體的免疫原的核酸 序列，所述病原體選自：111￥、即￥、!1(^、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、瘧疾、人巨細胞 病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。
18. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，其中將編碼IL-12p35亞單位的所述核酸 序列和編碼IL-12p40亞單位的所述核酸序列摻入病毒顆粒中。
19. 根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的組合物，還包含編碼選自IL-15和IL-28的一種或 多種蛋白的核酸序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98% 同源的蛋白的核酸序列，和/或b)編碼IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是 與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的 核酸序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少99% 同源的蛋白的核酸序列，和/或b)編碼IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是 與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少99%同源的蛋白的 核酸序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列， 所述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼SEQ ID NO :2的功能片段的核酸序 列，和/或b)編碼IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是與SEQ ID N0:3至少 98 %同源并編碼SEQ ID NO :4的功能片段的核酸序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列， 所述核酸序列是與SEQ ID NO: 1至少99 %同源并編碼SEQ ID NO :2的功能片段的核酸序 列，和/或b)編碼IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是與SEQ ID NO :3至少 99 %同源并編碼SEQ ID NO :4的功能片段的核酸序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼SEQ ID NO :2的功能片段的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)編碼SEQ ID NO :4的功能片段的SEQ ID NO :3的片段。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)不含IL-12p35亞單位信號肽的編碼序列 的SEQ ID NO : 1的片段，和/或b)不含IL-12p40亞單位信號肽的編碼序列的SEQ ID NO : 3的片段。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，包含a)不含IL-12p35亞單位信號肽的編碼序列 并連接有編碼信號肽的核酸序列的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)不含IL-12p40亞單位 信號肽的編碼序列并連接有編碼信號肽的核酸序列的SEQ ID NO :3的片段。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)不含IL-12p35亞單位信號肽的編碼序列 并連接著編碼SEQ ID NO :5的核酸序列的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)不含IL-12p40 亞單位信號肽的編碼序列并連接著編碼SEQ ID NO :5的核酸序列的SEQ ID NO :3的片段。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID NO : 1的片段，和/或b)編碼SEQ ID NO :4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO : 3的片段。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，包含a)編碼SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID NO : 1的片段，其連接著編碼信號肽的核酸序列，和/或b)編碼SEQ ID NO :4的 第23-328位氨基酸的SEQ ID NO :3的片段，其連接著編碼信號肽的核酸序列。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，包含a)編碼SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID N0:1的片段，其連接著編碼SEQ ID N0:5的核酸序列，和/或b)編碼SEQ ID NO :4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO :3的片段，其連接著編碼SEQ ID NO :5的核酸序 列。
31. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同 源的蛋白的核酸序列，其不含IL_12p35亞單位信號肽的編碼序列，和/或b)編碼IL-12p40 的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列，其不含IL-12p40亞單位信號肽的編碼 序列。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同 源的蛋白的核酸序列，其可操作地連接到編碼信號肽的編碼序列，和/或b)編碼IL-12p40 的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列，其可操作地連接到編碼信號肽的編碼 序列。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，包含a)編碼IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98% 同源的蛋白的核酸序列，其可操作地連接到編碼SEQ ID NO :5的編碼序列，和/或b)編碼 IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是與SEQ ID N0:3至少98%同源并編碼與 SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列，其可操作地連接到編碼SEQ ID NO : 5的編碼序列。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的 所述核酸序列位于與編碼IL-12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列不同的核酸分子 上。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的所 述核酸序列位于與編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列不同的質(zhì)粒上。
36. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的所 述核酸序列是與編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列相同的核酸分子。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的所 述核酸序列是與編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列相同的質(zhì)粒。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的所 述核酸序列和編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列位于相同的質(zhì)粒上并可 操作地連接到不同的啟動子。
39. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含編碼免疫原的核酸序列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含編碼來自病原體的免疫原的核酸序列，所述 病原體選自：111￥、即￥、!1(^、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、瘧疾、人巨細胞病毒、人呼 吸道合胞病毒和MRSA。
41. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中將編碼所述IL-12p35亞單位或其功能片段的 所述核酸序列和編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的所述核酸序列摻入病毒顆粒中。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含編碼選自IL-15和IL-28的一種或多種蛋白 的核酸序列。
43. -種誘導針對免疫原的免疫應答的方法，包括以有效誘導個體中的免疫應答的量 向所述個體施用權(quán)利要求1的組合物與編碼免疫原的核酸序列的組合。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中權(quán)利要求1所述的組合物還包含編碼免疫原的 核酸序列。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中免疫應答為治療性的。
46. 根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中免疫應答為預防性的。
47. -種核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位或其功能片段的核酸序列，其中編碼 IL-12p35亞單位的核酸序列與SEQ ID ΝΟ:1至少98%同源并編碼與SEQ ID NO:2至少98% 同源的蛋白，并且其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的核酸序列是作為與SEQ ID ΝΟ:1 至少98%同源的核酸序列的片段并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同源的蛋白 的核酸序列；和/或編碼IL_12p40亞單位或其功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞 單位的核酸序列與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼與SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋 白，并且其中編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸序列是作為與SEQ ID N0:3至少98% 同源的核酸序列的片段并編碼與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序 列。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與 SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的核酸序列；和/或與SEQ ID NO :3至少98%同源并編 碼與SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋白的核酸序列。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼與 SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白的核酸序列；和/或與SEQ ID NO :3至少98%同源并編 碼與SEQ ID NO :4至少99 %同源的蛋白的核酸序列。
50. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：與SEQ ID NO :1至少98%同源并編碼SEQ ID NO :2的核酸序列；和/或與SEQ ID NO :3至少98%同源并編碼SEQ ID NO :4的核酸序 列。
51. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：與SEQ ID NO :1至少99%同源并編碼與 SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白的核酸序列；和/或與SEQ ID NO :1至少99%同源并編 碼與SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白的核酸序列。
52. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：與SEQ ID NO :1至少99%同源并編碼SEQ ID NO :2的核酸序列；和/或與SEQ ID NO :1至少99%同源并編碼SEQ ID NO :2的核酸序 列。
53. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:3。
54. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID N0:1至少 98%同源的核酸序列的片段并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同源的蛋白的核 酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞單位的 功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段并編碼 與SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列。
55. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID N0:1至少 98%同源的核酸序列的片段并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少99%同源的蛋白的核 酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞單位的 功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段并編碼 與SEQ ID NO :4的功能片段至少99%同源的蛋白的核酸序列。
56. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID NO :1至少 98%同源的核酸序列的片段并編碼SEQ ID N0:2的核酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位 的功能片段的核酸序列，其中編碼IL_12p40亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與 SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段并編碼SEQ ID NO :4的核酸序列。
57. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID N0:1至少 99%同源的核酸序列的片段并編碼與SEQ ID NO :2的功能片段至少99%同源的蛋白的核 酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞單位的 功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID NO :3至少99%同源的核酸序列的片段并編碼 與SEQ ID NO :4的功能片段至少99%同源的蛋白的核酸序列。
58. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與SEQ ID N0:1至少 99%同源的核酸序列的片段并編碼SEQ ID NO :2的核酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位 的功能片段的核酸序列，其中編碼IL_12p40亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為與 SEQ ID NO :3至少99%同源的核酸序列的片段并編碼SEQ ID NO :4的核酸序列。
59. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為SEQ ID N0:1的片段并 編碼SEQ ID N0:2的功能片段的核酸序列；和/或編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p40亞單位的功能片段的所述核酸序列是作為SEQ ID N0:3的片段并 編碼SEQ ID NO :4的功能片段的核酸序列。
60. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列不含編碼SEQ ID N0:2的第 1-22位氨基酸的編碼序列；和/或編碼IL-12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼 IL-12p40亞單位的功能片段的所述核酸序列不含編碼SEQ ID NO :4的第1-22位氨基酸的 編碼序列。
61. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列還包含編碼信號肽的編碼序 列；和/或編碼IL_12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞單位的功能 片段的所述核酸序列還包含編碼信號肽的編碼序列。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的核酸分子，包含：編碼IL-12p35亞單位的功能片段的核酸 序列，其中編碼IL_12p35亞單位的功能片段的所述核酸序列還包含編碼SEQ ID N0:5的編 碼序列；和/或編碼IL_12p40亞單位的功能片段的核酸序列，其中編碼IL-12p40亞單位的 功能片段的所述核酸序列還包含編碼SEQ ID NO :5的編碼序列。
63. 根據(jù)權(quán)利要求47-62任一項所述的核酸分子，所述核酸分子被配制成使用電穿孔 遞送給個體。
64. 根據(jù)權(quán)利要求47-62任一項所述的核酸分子，其中所述核酸分子為質(zhì)粒。
65. 根據(jù)權(quán)利要求47-62任一項所述的核酸分子，還包含編碼免疫原的核酸序列。
66. 根據(jù)權(quán)利要求47-62任一項所述的核酸分子，還包含編碼來自病原體的免疫原的 核酸序列，所述病原體選自：111￥、即￥、!1(^、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、瘧疾、人巨 細胞病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。
67. 根據(jù)權(quán)利要求47-62任一項所述的核酸分子，其中將所述核酸分子摻入病毒顆粒。
【文檔編號】C07H15/24GK104245719SQ201280069473
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】D·B·韋納, M·P·莫羅, 嚴健 申請人:賓夕法尼亞大學托管會