專利名稱：多肽、抗體可變結(jié)構(gòu)域和拮抗劑的制作方法
多肽、抗體可變結(jié)構(gòu)域和拮抗齊IJ本發(fā)明涉及免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(dAbs)，例如蛋白酶抗性的dAbs，并且還涉及用于眼遞送的包括此種dAbs的制劑和組合物，及其治療眼疾病和狀況的用途。
背景技術(shù)：
治療眼疾病和狀況的困難是治療試劑遞送至眼的無效率。當(dāng)藥物遞送至眼時，它經(jīng)非?？焖俚貜难劢M織中清除。另外，當(dāng)治療劑局部遞送至眼時，問題是它們可能不到達眼的后段(視網(wǎng)膜、玻璃體和脈絡(luò)膜)。因此，許多后段眼狀況已通過靜脈內(nèi)施用藥物或通過玻璃體內(nèi)施用進行治療。這些疾病中的許多，例如AMD、青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病，不能得到最佳治療。因此，需要提供進一步試劑，其可以適合于眼遞送并且可以治療或預(yù)防眼疾病和狀況。多肽和肽已成為用于作為醫(yī)學(xué)、治療和診斷試劑使用的越來越重要的試劑。然而， 在特定體內(nèi)環(huán)境例如眼和特定生理學(xué)狀態(tài)例如癌癥和炎癥狀態(tài)中，組織、器官或動物中存在的蛋白酶的量可以增加。蛋白酶中的這種增加可以導(dǎo)致內(nèi)源蛋白質(zhì)以及進行施用以治療疾病的治療用肽、多肽和蛋白質(zhì)的加速降解和滅活。因此，具有用于體內(nèi)使用(例如，用于治療、診斷或預(yù)防疾病)的潛力的一些試劑僅具有有限功效，這是因為它們由蛋白酶快速降解且滅活。蛋白酶抗性多肽提供了幾個優(yōu)點。例如，蛋白酶抗性多肽在體內(nèi)保持活性長于蛋白酶敏感性試劑，并且因此保留功能足以產(chǎn)生生物學(xué)作用的時間段。VEGF是由于其初級轉(zhuǎn)錄物的可變剪接以幾種可變形式存在的分泌的、肝素結(jié)合、 同二聚糖蛋白(Leung等人，1989，Science 246:1306)。VEGF也稱為血管通透因子(VPF)， 這是由于其誘導(dǎo)血管滲漏一一在炎癥中重要的過程的能力。在眼中，已知VEGF和VEGF受體刺激脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管的血管發(fā)生且調(diào)節(jié)此種血管的血管通透性。這兩個特征促成視網(wǎng)膜損害和隨之發(fā)生的視敏度退化，這起因于許多視網(wǎng)膜炎癥狀況、血管病變和黃斑病。調(diào)節(jié)VEGF活性或VEGF受體活性的嘗試先前已顯示有效管理動物模型和人疾病中的血管通透性(Gragoudas等人，2004 :N. Engl. J. Med 351 2805)
用目前可用的治療劑靶向VEGF并非在所有患者中都是有效的。因此，需要改良的試劑用于治療由VEGF介導(dǎo)的病理學(xué)狀況，例如血管增殖性疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD))。TNF-α (腫瘤壞死因子-α )是促炎細(xì)胞因子，其已牽涉于許多眼炎癥狀況例如葡萄膜炎和AMD，和其中存在炎癥組分的視網(wǎng)膜血管病變的生成。與年齡相關(guān)性黃斑疾病相關(guān)的脈絡(luò)膜新生血管損傷的生成已證實具有相關(guān)的炎癥組分。這種相關(guān)炎癥組分的有效管理已證實直接影響脈絡(luò)膜新血管生成損害和血管通透性的發(fā)展，這兩者可以影響人疾病。人 AMD患者中的近期證據(jù)已暗示抗TNFa治療劑的使用可以影響患者中的疾病，所述患者對抗 VEGF 治療無反應(yīng)(Theodossiadis 等人，2009 :Am. J. Ophthalmol. 147:825-830)。白細(xì)胞介素1 (IL-I)是免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，其對幾種類型的細(xì)胞具有生物學(xué)作用。白細(xì)胞介素1與2種受體結(jié)合一一白細(xì)胞介素1受體1型(IL-1R1，⑶121a，p80)(其在結(jié)合IL-I后將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi))，和白細(xì)胞介素1受體2型(IL-1R1，CDwl21b)(其在結(jié)合IL-I后不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號且充當(dāng)IL-I的內(nèi)源調(diào)節(jié)劑)。調(diào)節(jié)IL-I與IL-IRl的相互作用的另一種內(nèi)源蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-lra)。IL-Ira結(jié)合IL-1R1，但不激活 IL-IRl以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。在結(jié)合IL-I (例如，IL-I α或IL-1 β )后通過IL-1R1轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號誘導(dǎo)可以是致病性的廣譜生物活性。例如，在結(jié)合IL-I后通過IL-IRl轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號可以導(dǎo)致局部或全身炎癥，以及另外炎癥介質(zhì)(例如，IL-6、11-8、TNF)的確立。因此，IL-1與IL-IRl的相互作用已牽涉于眼疾病的發(fā)病機理。結(jié)合白細(xì)胞介素1受體1型(IL-IRl)且中和其活性的特定試劑(例如，IL-lra)已證明是用于特定炎癥狀況的有效治療試劑。發(fā)明概述
在第一個方面，本發(fā)明提供了包括免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(或dAb)或由免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(或dAb)組成的組合物，所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以例如在遞送部位與所需靶分子(例如VEGF、IL-I或TNF-α )結(jié)合，用于施用于眼。本發(fā)明還提供了包括免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(或dAb )或由免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(或dAb)組成的組合物，所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以與所需靶分子(例如 VEGF.IL-1或TNF-α、TNFR1、TNFR2、IL-Ir)結(jié)合，用于治療、預(yù)防或診斷眼疾病或狀況的用途，例如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性黃斑水腫。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是蛋白酶抗性的，例如對下述一種或多種有抗性絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶制劑、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶 G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶(actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶(s印arase)。在特定實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。此種蛋白酶抗性多肽尤其適合于遞送給體內(nèi)的富蛋白酶環(huán)境例如眼。蛋白酶還可以由生物提取物、生物勻漿或生物制劑提供。在一個實施方案中， 蛋白酶是在眼和/或眼淚中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。在眼中發(fā)現(xiàn)的此種蛋白酶的例子包括胱天蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、解聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM、蛋白體、組織纖溶酶原激活物、分泌酶、組織蛋白酶B和D、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、絲氨酸蛋白酶rassi、泛蛋白蛋白體途徑(UPP)。在一個實施方案中，蛋白酶是非細(xì)菌蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是動物例如哺乳動物例如人蛋白酶。組合物可以遞送給眼的不同區(qū)域，例如眼的表面、角膜、或淚管(tear duct)或淚腺，或可以存在眼內(nèi)遞送(例如，眼前房或后房例如玻璃體液)和遞送給眼結(jié)構(gòu)例如虹膜、睫狀體、淚腺，并且組合物可以在眼的這些部分中與靶分子(例如，VEGF, IL-I或TNF-α )結(jié)合。組合物還可以遞送給眼的眼周區(qū)域。靶分子可以例如是VEGF、IL-I或TNF- α，或它可以是任何其他所需靶，例如在眼中存在的靶分子，例如在眼的表面上、在眼內(nèi)或在淚管或淚腺中，例如靶可以是IL-1、IL_17 或 TNF 受體例如 TNFRl、TGF β、IL-6、IL-8、IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相關(guān)糖蛋白 (MAG)或β淀粉狀蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于施用于眼的蛋白酶抗性免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(或dAb)，例如以滴眼劑的形式或作為凝膠或例如在植入體中。dAb可以例如與眼中存在的靶分子結(jié)合，例如VEGF、IL-I或TNF- α。施用于眼可以例如通過局部施用，例如以滴眼劑的形式；或可替代地，它可以通過注射到眼內(nèi)。使免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域的遞送靶向進入眼的特定區(qū)域內(nèi)可以是有用的， 例如眼的表面、或淚管或淚腺，或可以存在眼內(nèi)遞送(例如，眼前房或后房例如玻璃體液)。 因此，本發(fā)明進一步提供了將組合物直接遞送給眼的方法，其包括通過選自下述的方法將所述組合物施用于眼眼內(nèi)注射、局部遞送、滴眼劑、眼周施用和緩釋制劑(例如聚合納米 (nano)或微?；蚰z)的使用或通過使用利用離子電滲療法的遞送裝置。如果免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域例如通過局部遞送例如作為滴眼劑遞送給眼，連同眼穿透增強劑例如癸酸鈉，或連同粘度增強劑例如羥丙基甲基纖維素(HPMC)，那么這也可以是有用的。因此，本發(fā)明進一步提供了包括下述的組合物(a)與例如眼中的靶分子 (例如VEGF、IL-1或TNF-α )結(jié)合的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，以及(b)眼穿透增強劑和 /或(c)粘度增強劑，例如用于局部遞送給眼。在一個方面，待遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是WO 2008/149146、 WO 2008149147或WO 2008149150中公開的任何一種VEGF dAbs，其與VEGF結(jié)合。例如它可以是由氨基酸序列編碼的多肽，所述氨基酸序列與D0M15-26-593的氨基酸序列(圖Ia中所示SEQ ID NO 1)至少80%等同。在一個實施方案中，同一性百分比是至少70、80、85、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%或100%。在一個實施方案中，蛋白酶抗性多肽可通過本文描述的用于分離蛋白酶抗性多肽的方法獲得。用于遞送給眼的D0M15-26-593還可以進一步包括抗體恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。例如，它可以具有與D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列(圖Ib中所示SEQ ID NO 2)等同的氨基酸序列，或同一性百分比可以是與圖Ib SEQ ID NO 2 中所示的那種至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一個方面，通過與DOMl5-26-593的氨基酸序列至少80%等同的氨基酸序列(例如，通過97%等同或更多的氨基酸序列)編碼的VEGF dAb可以包括在位置6上的纈氨酸和 /或在位置99上的亮氨酸，和/或在位置30上的賴氨酸(Kabat編號)，如WO 2008149150 和WO 2008149147 (其內(nèi)容引入本文作為參考)中所述的。在進一步的方面，待遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是WO 2008/149144 或 WO 2008/149148 中公開的任何一種抗 TNFRl dAbs。在一個實施方案中，與α -TNF-α Rl結(jié)合的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以包括與Dom lh-131-206的氨基酸序列(圖4中所示；SEQ ID NO 6)至少97% (例如98%、99% 或100%等同)等同的氨基酸序列。Dom lh-131-206的制備和選擇在W02008149148中描述。在再進一步的方面，待遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是WO 2008/149149中公開的任何一種抗IL-IRl dAbs。
在一個實施方案中，與IL-I結(jié)合的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以包括與下述至少97% (例如98%、99%或100%等同)等同的氨基酸序列(a)D0M 4-130-54的氨基酸序列(圖3中所示；SEQ ID NO 5)；或(b) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(圖2中所示；SEQ ID NO 4)。DOM 4-130-54 的制備和選擇在 WO 2007063311 以及 W02008149149 中描述。為了制備Dom 0400，獲得DOM 4-130-54 dAb序列且這樣突變，從而使得在位置80上的半胱氨酸替換DOM 4-130-54中存在的脯氨酸，隨后通過與在dAb的位置80上的游離半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)馬來酰亞胺偶聯(lián)，使這種dAb與40KDa線性PEG分子(得自NOF Corporation,歐洲)附本發(fā)明還提供了包括免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域或由免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域組成的任何組合物在制備用于治療、預(yù)防或診斷眼狀況或疾病的藥物中的用途，例如其中所述眼疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性視網(wǎng)膜病或糖尿病性黃斑水腫。本發(fā)明還提供了包括免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域或由免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域組成的組合物，例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb，用于在治療、預(yù)防或診斷眼狀況或疾病中使用，例如AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性視網(wǎng)膜病或糖尿病性黃斑水腫。在一個可替代實施方案中，用于遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，其不是D0M15-26-593的氨基酸序列(圖Ia中所示；SEQ ID NO 1)或不是 D0M15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列(圖Ib中所示；SEQ ID NO 2)。在另一個可替代實施方案中，用于遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，其不是包括下述申請中公開的任何分子或由下述申請中公開的任何分子組成的分子PCT/GB2008/050399、PCT/GB2008/050400, PCT/GB2008/050406、PCT/GB2008/050405、 PCT/GB2008/050403、PCT/GB2008/050404、PCT/GB2008/050407。在另一個可替代實施方案中，用于遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，其不是如 PCT/GB2008/050400 中公開的 Domlh-131-511、Domlh-131-201、 Domlh-131-202、Domlh-131-203、Domlh-131-204、Domlh-131-205 的氨基酸序列。在另一個可替代實施方案中，用于遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，其不是如PCT/GB2008/050406中公開的Dom4-130_202的氨基酸序列。在另一個可替代實施方案中，用于遞送給眼的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是這樣的，其不是如PCT/GB2008/050405中公開的Domlh-131_206的氨基酸序列。與免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域組合或結(jié)合將其他試劑遞送給眼，也可以是有用的，例如遞送眼穿透增強劑例如癸酸鈉或粘度增強劑例如羥丙基甲基纖維素(HPMC)，可以是有用的。用于眼遞送的單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(dAbs)(例如，與VEGF、IL-l或TNF-α 結(jié)合的那種)可以格式化為具有較大的流體動力學(xué)大小，例如通過附著PEG基團、血清清蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過與抗體結(jié)構(gòu)域綴合。例如，dAb單體(例如，VEGF dAb)可以格式化為抗體的較大抗原結(jié)合片段(例如，格式化為Fab、Fab，、F (ab)2、F (ab，)2、IgG、scFv)。dAb的流體動力學(xué)大小及其血清半衰期也可以通過使其與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體或抗體片段)綴合或連接得到增加，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與增加體內(nèi)半衰期的抗原或表位結(jié)合，如本文描述的(參見，整體引入本文作為參考的 W02006038027的附錄1)。例如，VEGF dAb可以與抗血清清蛋白或抗新生Fc受體抗體或抗體片段綴合或連接，例如抗SA或抗新生Fc受體dAb、Fab、Fab，或scFv，或與抗SA親和體 (affibody)或抗新生Fc受體親和體綴合或連接。用于在本文描述的組合物中使用的例如與VEGF結(jié)合dAbs連接的合適清蛋白、清蛋白片段或清蛋白變體的例子在WO 2005/077042A2和W02006038027中描述，其整體引入本文作為參考。格式化的dAbs (例如由加入聚乙二醇格式化的dAbs)可以具有例如30KDa - 100 KDa例如約50-60 KDa的分子量，并且可以用于遞送給視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜和/或淚液。具有約15 KDa分子量的裸(未格式化的)dAbs可以用于遞送給玻璃體液和/或房水和/或視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜。在本公開內(nèi)容自始至終描述的本發(fā)明的其他實施方案中，代替在本發(fā)明的拮抗劑或配體中使用單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域或“dAb”，預(yù)期技術(shù)人員可以使用包括dAb的 ⑶Rs的結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合例如VEGF、IL-I或TNF-α (例如，嫁接到合適的蛋白質(zhì)支架或骨架上的⑶Rs，例如親和體、SpA支架、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域)，或可以是包括關(guān)于 VEGF, IL-I或TNF-α的結(jié)合位點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如，其中結(jié)構(gòu)域選自親和體、SpA結(jié)構(gòu)域、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域。公開內(nèi)容就整體而言應(yīng)相應(yīng)解釋為提供使用此種結(jié)構(gòu)域代替dAb的拮抗劑、配體和方法的公開內(nèi)容。本文描述的蛋白酶抗性dAbs可以使用WO 2008149143中描述的方法和教導(dǎo)進行選擇，其內(nèi)容引入本文作為參考。在一個方面，本發(fā)明提供了包括例如VEGF、IL-I或TNF-α結(jié)合位點的蛋白酶抗性免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)與下述溫育時對蛋白酶有抗性
(i)在37°C至少10微克/ml蛋白酶的濃度(c)進行至少1小時的時間(t)；或
(ii)在30°C至少40微克/ml蛋白酶的濃度(c’)進行至少1小時的時間(t)。在一個實施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與可變結(jié)構(gòu)域的比(基于摩爾/摩爾)是8，000 - 80，000 蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域，例如當(dāng)C是10微克/ml時，比是800 - 80，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或當(dāng)C或C’是100微克/ml時，比是8，000 - 80，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)與可變結(jié)構(gòu)域的比(基于重量/重量，例如微克/微克)是16，000 - 160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域，例如當(dāng)C是10微克/ml時，比是1，600 -160，000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域；或當(dāng)C或C’是100微克/ml時，比是1，6000 - 160, 000蛋白酶可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，濃度(c或c’)是至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一個實施方案中，濃度(c或c’)是至少100或1000微克/ml蛋白酶。參考當(dāng)與肽或多肽的譜(repertoires)或文庫一起作用時(例如，w/w參數(shù))，用于使用的適合于蛋白酶的蛋白酶解活性條件的本文描述。這些條件可以用于測定特定免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抗性的條件。在一個實施方案中，時間(t)是或是約1、3或24小時或過夜(例如，約 12-16小時)。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域在條件(i )下是抗性的，并且濃度(c)是或是約10或100微克/ml蛋白酶，并且時間(t)是1小時。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域在條件(ii)下是抗性的，并且濃度(c’)是或是約40微克/ml蛋白酶，并且時間(t)是或是約 3小時。在一個實施方案中，蛋白酶選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶制劑。在一個實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在痰、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或眼淚或眼中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在眼和/或眼淚中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是非細(xì)菌蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是動物例如哺乳動物例如人蛋白酶。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域?qū)σ鹊鞍酌负?或選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶制劑的至少一種其他蛋白酶有抗性。例如，抗性針對胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和leucozyme ；胰蛋白酶和胰酶制劑；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme ；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰酶制劑；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶制劑和leucozyme ；或胰蛋白酶、胰酶制劑和 leucozyme。在一個實施方案中，當(dāng)在條件(i)或(ii)下例如以IO6- IO13例如IO8- IO12復(fù)制單位(感染性病毒體)的噬菌體文庫大小溫育時，可變結(jié)構(gòu)域展示在噬菌體上。在一個實施方案中，在條件(i)或(ii)下溫育后，可變結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合VEGF、 IL-I或TNF- α，例如使用BiaCore TM或ELISA，例如噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA 評估的。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合A蛋白或L蛋白。在一個實施方案中， 與A或L蛋白特異性結(jié)合在條件(i )或(i i )下溫育后存在。在一個實施方案中，例如在條件(i )或(ii )下溫育后，可變結(jié)構(gòu)域在ELISA例如噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA)中可以具有至少0. 404的OD450讀數(shù)。在一個實施方案中，例如在條件(i)或(ii)下溫育后，可變結(jié)構(gòu)域在凝膠電泳中展示出(基本上)單一條帶。在另一個實施方案中，試劑(dAb)可以經(jīng)由可植入遞送設(shè)備局部施用于眼。因此， 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb的可植入遞送設(shè)備用于眼遞送
在進一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(例如 dAb)，和藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑用于眼遞送。附圖
簡述
圖Ia 描述了 D0M15-26-593的氨基酸序列圖Ib 描述了 D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列圖Ic 描述了抗體Fc的氨基酸序列
圖2 描述了 DOM 0400 PEG (加入聚乙二醇的抗ILl dAb，分子量約52 KDa)的氨基酸
序列
圖3 描述了 D0M4-130-54 (抗ILl dAb)的氨基酸序列圖4 描述了 Dom lh-131-206 (抗TNFa Rl dAb)的氨基酸序列發(fā)明詳述
在本說明書內(nèi)已參考實施方案描述了本發(fā)明，其方式使得能夠書寫清楚和簡明說明書。預(yù)期且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到實施方案可以在不背離本發(fā)明的情況下不同組合或分開。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法(一般參見，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版，John Wiley & Sons, Inc.，其引入本文作為參考)和化學(xué)方法。如本文使用的，術(shù)語“血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的拮抗劑”或“抗VEGF拮抗劑”等指結(jié)合VEGF且可以抑制VEGF的(即一種或多種)功能的試劑(例如，分子、化合物)。如本文使用的，“肽”指經(jīng)由肽鍵連接在一起的約2個到約50個氨基酸。如本文使用的，“多肽”指通過肽鍵連接在一起的至少約50個氨基酸。多肽一般包括三級結(jié)構(gòu)且折疊成功能結(jié)構(gòu)域。如本文使用的，當(dāng)在適合于蛋白酶活性的條件下與蛋白酶溫育時，“對蛋白酶降解有抗性的”肽或多肽(例如，結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))基本上不由蛋白酶降解。當(dāng)在適合于蛋白酶活性的溫度與蛋白酶溫育約1小時后，不超過約25%、不超過約20%、不超過約15%、不超過約14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11%、不超過約10%、不超過約9%、不超過約8 %、不超過約7 %、不超過約6 %、不超過約5 %、不超過約4 %、不超過約3 %、不超過約2 %、不超過約1 %、或基本上無一蛋白質(zhì)由蛋白酶降解時，多肽(例如，dAb )基本上不降解。例如在37或50°C。蛋白質(zhì)降解可以使用任何合適的方法例如通過SDS-PAGE或如本文描述的功能測定(例如配體結(jié)合)進行評估。如本文使用的，“靶配體”指由多肽或肽特異性或選擇性結(jié)合的配體。例如，當(dāng)多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段時，靶配體可以是任何所需抗原或表位。與靶抗原結(jié)合依賴于多肽或肽是功能的。如本文使用的，抗體指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F (ab，)2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象的多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙抗體)，無論是衍生自天然產(chǎn)生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術(shù)生成的；無論是從血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母還是細(xì)菌中分離的。如本文使用的，“抗體形式”指任何合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中可以摻入一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域，以便對結(jié)構(gòu)賦予對于抗原的結(jié)合特異性。多種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、 抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任何一種的抗原結(jié)合片段(例如Fv片段 (例如，單鏈Fv (scFv)、二硫鍵鍵合的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F (ab，)2片段)、單個抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，dAb、VH、VHH、Vl)和前述任何一種的修飾形式(例如通過聚乙二醇或其他合適聚合物的共價附著修飾的或人源化VHH)。短語“免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域”指抗體可變結(jié)構(gòu)域(VinVffinVJ,其不依賴于其他V區(qū)或結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合抗原或表位。免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以以具有其他可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同或異多聚體)存在，其中所述其他區(qū)或結(jié)構(gòu)域不是通過單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合所需的(即，其中免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域不依賴于另外的可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原)?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”與“免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域” 相同，如該術(shù)語在本文中使用的?！皢蝹€抗體可變結(jié)構(gòu)域”與“免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域” 相同，如該術(shù)語在本文中使用的。免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域在一個實施方案中是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但還包括來自其他物種例如嚙齒類動物(例如，如WO 00/29004中公開的，其內(nèi)容整體引入本文作為參考)、護士鯊(nurse shark)和駱駝科物種Vhh dAbs的單個抗體可變結(jié)構(gòu)域。駱駝科物種Vra是免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域多肽，其衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種，其產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。Vhh可以是人源化的?！敖Y(jié)構(gòu)域”是具有不依賴于蛋白質(zhì)的其余的三級結(jié)構(gòu)的折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。一般地， 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的不連續(xù)功能性質(zhì)，并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白質(zhì)，而不喪失蛋白質(zhì)和/或結(jié)構(gòu)域的剩余部分的功能?！皢蝹€抗體可變結(jié)構(gòu)域”是包括抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列的折疊的多肽結(jié)構(gòu)域。它因此包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域，例如其中一個或多個環(huán)已由并非抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列替換，或已截短或包括N或C末端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及保留至少全長結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。如本文使用的，術(shù)語“劑量”指一次(單位劑量)全部或經(jīng)過限定時間間隔以2次或更多次施用施用于受試者的配體的量。例如，劑量可以指在1天(24小時)(日劑量)、2天、1 周、2周、3周或一個或多個月(例如，通過單次施用，或通過2次或更多次施用)的過程期間施用于受試者的配體(例如，包括結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域的配體)的量。 劑量之間的時間間隔可以是任何所需時間量。短語“半衰期”指配體(例如，dAb、多肽或拮抗劑)的血清濃度在體內(nèi)減少50%花費的時間，例如由于配體的降解和/或配體通過天然機制的清除或隔離。本發(fā)明的配體可以在體內(nèi)穩(wěn)定并且其半衰期通過與分子結(jié)合得到增加，所述分子抵抗降解和/或清除或整合。一般地，此種分子是天然存在的蛋白質(zhì)，其自身具有長體內(nèi)半衰期。配體的半衰期增加， 如果其功能活性在體內(nèi)持續(xù)長于相似配體的時間段的話，所述相似配體對于半衰期增加分子不是特異性的。例如，對于人血清清蛋白(HSA)特異的配體和靶分子與相同配體比較，在所述相同配體中不存在對于HSA的特異性，即不結(jié)合HSA但結(jié)合另一種分子。例如，它可以結(jié)合細(xì)胞上的第三種靶。一般地，半衰期增加10%、20%、30%、40%、50%或更多。半衰期 2乂、31、4乂、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^或更多范圍中的增加是可能的?？商娲鼗蛄硗獾?，半衰期最高達30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x范圍中的增加是可能的。如本文使用的，“流體動力學(xué)大小”指基于分子通過水溶液的擴散，分子(例如蛋白質(zhì)分子、配體)的表觀大小?？梢蕴幚淼鞍踪|(zhì)通過溶液的擴散或運動，以得到蛋白質(zhì)的表觀大小，其中大小由蛋白質(zhì)粒子的“斯托克斯(Stokes)半徑”或“流體動力學(xué)半徑”給出。蛋白質(zhì)的“流體動力學(xué)大小”依賴于質(zhì)量和形狀(構(gòu)象)，從而使得基于蛋白質(zhì)的總體構(gòu)象，具有相同分子量的2種蛋白質(zhì)可以具有不同的流體動力學(xué)大小。如本文提及的，術(shù)語“競爭”意指第一種靶與其關(guān)連靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合在第二種結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在下被抑制，所述第二種結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谒鲫P(guān)連靶特異。例如，結(jié)合可以在立體上被抑制，例如通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域的物理封閉或通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)或環(huán)境的改變，從而使得其對于靶的親和力或抗體親抗原性減少。關(guān)于如何執(zhí)行競爭ELISA和競爭 BiaCore實驗，以測定第一種和第二種結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的競爭的細(xì)節(jié)，參見W02006038027。如下執(zhí)行2個序列之間的“同源性”或“同一性”或“相似性”(該術(shù)語在本文中可互換使用)的計算。序列就最佳比較目的進行比對(例如，缺口可以引入第一個和第二個氨基酸或核酸序列的一個或兩個中用于最佳比對，并且非同源序列為了比較目的可以被忽視)。在一個實施方案中，就比較目的比對的參考序列的長度是參考序列長度的至少30%、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、80 %、90 %、100 %。隨后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位置由與第二個序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在那個位置上是等同的(如本文使用的，氨基酸或核酸“同源性”等價于氨基酸或核酸“同一性”)。2個序列之間的百分比同一性是由序列共享的等同位置數(shù)目的函數(shù)，其中考慮缺口數(shù)目和每個缺口的長度，這需要引入用于2個序列的最佳比對。如本文定義的，氨基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性可以使用算法BLAST 2 Sequences進行制備且測定，其中使用缺省參數(shù)(Tatusova， Τ. Α.等k, FEMS Microbiol Lett, 174·ΛΚΙ-Υ視(1999)。蛋白酶抗性
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及已通過用于蛋白酶抗性dAbs的選擇方法進行選擇的 dAbs，例如抗VEGF dAbs,TNFRl dAbs,IL-I dAbs，用于遞送給眼，其具有所需生物活性例如與VEGF、TNFRl或IL-I結(jié)合。2種選擇壓力在方法中用于產(chǎn)生用于選擇多肽的有效過程， 所述多肽是高度穩(wěn)定的且對蛋白酶降解有抗性，并且具有所需生物活性。如本文描述的，蛋白酶抗性肽和多肽一般保留生物活性。相比之下，蛋白酶敏感肽和多肽在本文描述的方法中被蛋白酶切割或降解，并且因此喪失其生物活性。因此，蛋白酶抗性肽或多肽一般基于其生物活性例如結(jié)合活性進行選擇。眼環(huán)境是富含蛋白酶的環(huán)境，并且因此如本文描述的蛋白酶抗性dAbs用于眼遞送的用途提供了幾個優(yōu)點。例如，就對于通過一種蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的蛋白酶解降解的抗性選擇的可變結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^其他蛋白酶(例如，彈性蛋白酶、leucozyme)的降解也是有抗性的。蛋白酶抗性可以與肽或多肽的較高解鏈溫度(Tm)相關(guān)。較高解鏈溫度指示更穩(wěn)定的可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、肽和多肽。對蛋白酶降解的抗性還可以與對于靶配體的高親和力結(jié)合有關(guān)。因此，本文描述和提及的方法(在WO 2008149143中)提供了選擇、分離和/ 或回收dAbs的有效方法，所述dAbs具有所需生物活性，并且充分適合于體內(nèi)治療和/或診斷眼用途，因為它們是蛋白酶抗性和穩(wěn)定的。在一個實施方案中，蛋白酶抗性可以與改善的 PK相關(guān)，例如改善超過并非蛋白酶抗性的可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、肽或多肽。改善的PK可以是改善的AUC (曲線下面積)和/或改善的半衰期。蛋白酶抗性還可以與可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、肽或多肽對于剪切和/或熱應(yīng)激改善的穩(wěn)定性和/或在霧化過程中減少的聚集傾向相關(guān)，例如改善超過并非蛋白酶抗性的可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與改善的貯存穩(wěn)定性相關(guān)，例如改善超過并非蛋白酶抗性的可變結(jié)構(gòu)域、拮抗劑、 肽或多肽。在一個方面，提供了一個、兩個、三個、四個或所有優(yōu)點，所述優(yōu)點是對于蛋白酶降解的抗性、較高的Tm和與靶配體的高親和力結(jié)合。本文描述且提及的方法(在WO 2008/149143中)可以用作分離蛋白酶抗性肽或多肽例如dAbs的程序的部分，若需要則其可以包括其他合適的選擇方法。在這些情況下，本文描述的方法可以在程序的任何所需點上采用，例如在其他選擇方法使用之前或之后。在特定實施方案中，用于眼遞送的dAb就針對通過胰蛋白酶、彈性蛋白酶或 leucozyme的降解的抗性進行選擇，并且特異性結(jié)合VEGF。在這些實施方案中，提供了包括dAbs的文庫或譜，并且在適合于蛋白酶解消化的條件下，與胰蛋白酶、彈性蛋白酶或 leucozyme (或包括胰蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿)組合。選擇結(jié)合VEGF的胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme抗性dAbs。例如，當(dāng)在37°C在0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中溫育至少約2小時的時間段時，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一個例子中，當(dāng)在37°C在 0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中溫育至少約3小時的時間段時，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。 在另一個例子中，當(dāng)在37°C在0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中溫育至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約10小時、至少約11 小時或至少約12小時的時間段時，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一個方面，提供了產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽(例如dAbs)的譜的方法。該方法包括提供肽或多肽的譜；在適合于蛋白酶活性的條件下，使肽或多肽的譜和蛋白酶組合； 和回收特異性結(jié)合VEGF的多種肽或多肽，由此產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽的譜。相對于其他方法，在本文中描述了蛋白酶、展示系統(tǒng)、用于蛋白酶活性的條件、和用于選擇適合于用于在方法中使用的肽或多肽的方法。在一些實施方案中，使用包括肽或多肽譜的展示系統(tǒng)(例如，使核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽或多肽的功能特征連接的展示系統(tǒng))，并且該方法進一步包括擴增或增加編碼多種所選擇的肽或多肽的核酸拷貝數(shù)。核酸可以使用任何合適方法進行擴增，例如通過噬菌體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈反應(yīng)。在特定實施方案中，提供了產(chǎn)生包括抗VEGF dAbs的蛋白酶抗性多肽的譜的方法。該方法包括提供包括抗VEGF dAbs的多肽的譜；在適合于蛋白酶活性的合適條件下， 使肽或多肽的譜和蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)組合；和回收包括對于 VEGF具有結(jié)合特異性的dAbs的多種多肽。該方法可以用于產(chǎn)生首次用于實驗的譜，或朝所需結(jié)合特異性偏倚的譜，例如基于對于VEGF具有結(jié)合特異性的親本dAb的親和力成熟譜。選擇/分離/回收
使用任何合適的方法可以從譜或文庫(例如，在展示系統(tǒng)中)中選擇、分離和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽(例如，蛋白酶抗性多肽的群體)。在一個實施方案中，基于可選擇的特征 (例如，物理特征、化學(xué)特征、功能特征)，選擇或分離蛋白酶抗性多肽。合適的可選擇功能特征包括譜中肽或多肽的生物活性，例如與一般配體(例如超抗原)結(jié)合、與靶配體(例如，抗原、表位、底物)結(jié)合、與抗體結(jié)合(例如通過肽或多肽上表達的表位)、和催化活性。(參見例如，Tomlinson 等人，WO 99/20749 ；WO 01/57065 ；WO 99/58655)。在一個實施方案中，選擇基于與VEGF的特異性結(jié)合。在另一個實施方案中，選擇基于選擇的功能特征，以產(chǎn)生其中成員是蛋白酶抗性的第二個譜，隨后從第二個譜中選擇特異性結(jié)合VEGF的成員。在一些實施方案中，從肽或多肽的文庫或譜中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共享共同的可選擇特征。例如，蛋白酶抗性肽或多肽可以選自文庫或譜，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽結(jié)合共同一般配體，結(jié)合共同靶配體，結(jié)合共同抗體(或由之結(jié)合)，或具有共同催化活性。這類選擇特別用于制備蛋白酶抗性肽或多肽的譜，其基于具有所需生物活性的親本肽或多肽，例如當(dāng)執(zhí)行免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域的親和力成熟時?；谂c共同一般配體的結(jié)合的選擇可以獲得包含所有或基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽集合或群體，所述肽或多肽是原始文庫或譜的組分。例如，通過淘選或使用合適的親和基質(zhì)，可以選擇、分離和/或回收結(jié)合靶配體或一般配體的肽或多肽，例如 A蛋白、L蛋白或抗體。淘選可以這樣完成通過將配體(例如，一般配體、靶配體)溶液添加到合適容器(例如，管、培養(yǎng)皿)，并且允許配體沉積或包被到容器的壁上?？梢韵吹暨^量配體，并且可以將肽或多肽(例如，已與蛋白酶溫育的譜)添加到容器中，并且使容器維持在適合于肽或多肽結(jié)合固定化配體的條件下。可以洗掉未結(jié)合的肽或多肽，并且使用任何合適的方法例如刮取或降低PH，可以回收結(jié)合的肽或多肽。合適的配體親和基質(zhì)一般包含配體與之共價或非共價附著的固體支持體或珠(例如，瓊脂糖)。在適合于肽或多肽與基質(zhì)上的配體結(jié)合的條件下，使用分批過程、柱過程或任何其他合適過程，親和基質(zhì)可以與肽或多肽(例如，已與蛋白酶溫育的譜)組合?？梢韵吹舨唤Y(jié)合親和基質(zhì)的肽或多肽，并且可以使用任何合適方法洗脫且回收結(jié)合的肽或多肽，例如用較低PH的緩沖液洗脫、用溫和的變性劑(例如，尿素)、或用與配體競爭結(jié)合的肽。在一個例子中，在適合于譜中的肽或多肽結(jié)合靶配體(VEGF)的條件下，使生物素化的靶配體與譜組合。使用固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(例如，在珠上)回收結(jié)合的肽或多肽。在一些實施方案中，一般配體是抗體或其抗原結(jié)合片段。結(jié)合肽或多肽的結(jié)構(gòu)特征的抗體或抗原結(jié)合片段作為一般配體是特別有用的，所述結(jié)構(gòu)特征在文庫或譜的肽或多肽中基本上保守的。適合于用作配體用于分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽的抗體和抗原結(jié)合片段可以是單克隆或多克隆的，并且可以使用任何合適的方法進行制備。用于產(chǎn)生蛋白酶抗性多肽的核酸、宿主細(xì)胞和方法
通過本文描述的方法選擇的蛋白酶抗性肽或多肽還可以在合適的體外表達系統(tǒng)中，例如大腸桿菌(E. coli)或畢赤氏酵母屬(Pichia)物種例如巴斯德畢赤氏酵母(P. pastoris)，通過化學(xué)合成或通過任何其他合適方法產(chǎn)生。多肽、dAbs和拮抗劑
如本文描述的，蛋白酶抗性dAbs —般以高親和力結(jié)合其靶配體。例如，VEGFdAb 可以以 300 nM - 1 pM (即 3 χ 10"- 5 χ I(T12M)的親和力(KD ； KD=Koff (kd)/K。n (ka)，如通過表面等離振子共振測定的)結(jié)合VEGF，例如50 nM - 1 pM、 例如5 nM - 1 pM和例如1 nM - 1 pM ；例如1 χ IO"7 M或更少、例如1 χ IO"8 M或更少、 例如1 χ 10_9 M或更少、例如1 χ ICTki M或更少和例如1 χ 10_" M或更少的Kd ；和/或5 χ IO"1 S-1 - 1 χ IO"7 s人例如 1 χ IO"2 S-1 - 1 χ IO"6 s人例如 5 χ IO"3 s"1 - 1 χ 1(Γ5 s入例如5 χ ICT1 或更少、例如1 χ 1(T2 或更少、例如1 χ 1(Γ3 或更少、例如1 χ 10_4 s—1或更少、例如1 χ 10_5 s—1或更少、和例如1 χ 10_6 s—1或更少的K。ff速率常數(shù)，如通過表面等離振子共振測定的。盡管我們不受任何具體理論束縛，但對蛋白酶抗性的肽和多肽被認(rèn)為具有較低的熵和/或較高的穩(wěn)定能量。因此，蛋白酶抗性和高親和力結(jié)合之間的關(guān)聯(lián)可以涉及肽和多肽表面與通過本文描述的方法選擇的dAbs的緊密性和穩(wěn)定性。在一個實施方案中，VEGF dAb以約1 μ M或更少、約500 nM或更少、約100 nM或更少、約75 nM或更少、約50 nM或更少、約10 nM或更少或約1 nM或更少的IC50的濃度 50 (IC50)抑制VEGF的結(jié)合。在特定實施方案中，VEGF dAb特異性結(jié)合VEGF，例如人VEGF，并且以300 nM -ΙρΜ、或 300nM - 5pM、或 50ηΜ - ΙρΜ、或 50nM - 5pM、或 50nM - 20 pM、或約 10 pM、或約 15pM、或約20pM的解離常數(shù)(Kd)與人VEGF解離，如通過表面等離振子共振測定的。在特定實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性結(jié)合VEGF，例如人VEGF，并且以5 χ 10—1 s—1 - 1 χ 10-78-1、例如1 χ 1(Γ2 s"1 - 1 χ 1(Γ6 s人例如 5 χ 1(Γ3 s"1 - 1 χ 1(Γ5 s人例如 5 χ IO"1 s—1或更少、例如1 χ 10_2 s—1或更少、例如1 χ 10_3 s—1或更少、例如1 χ 10_4 s—1或更少、 例如1 χ 10_5 s—1或更少、和例如1 χ 10_6 s—1或更少的K。ff速率常數(shù)與人VEGF解離，如通過表面等離振子共振測定的。在特定實施方案中，VEGFdAb 以 IxliT3 M^1S-1 - 1x10" IT1S入或 IxliT3 M^1S-1 -IxlO-6 Μ、—1、或約 IxlO-4 Μ—1 S—1、或約 IxlO-5 Μ、—1 的Κ。η特異性結(jié)合VEGF，例如人 VEGF。在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性結(jié)合VEGF，例如人VEGF，并且以如這個段落中限定的解離常數(shù)(Kd)和K。ff與人VEGF解離。在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性結(jié)合VEGF，例如人VEGF，并且以如這個段落中限定的解離常數(shù)(Kd)和K。n與人VEGF解離。在一些實施方案中，多肽或dAb以如這個段落中所述的Kd和/或K。ff和/或K。n特異性結(jié)合VEGF (例如人VEGF)，并且包括與dAb的氨基酸序列至少或至少約80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的氨基酸序列，所述 dAb 具有 DOMl5_26_593 的氨基酸序列。dAb可以在大腸桿菌或畢赤氏酵母屬物種(例如巴斯德畢赤氏酵母)中表達。在一個實施方案中，當(dāng)在大腸桿菌或畢赤氏酵母屬物種(例如巴斯德畢赤氏酵母)中表達時，配體或dAb單體以至少約0.5 mg/L的量分泌。盡管當(dāng)在大腸桿菌或畢赤氏酵母屬物種(例如巴斯德畢赤氏酵母)中表達時，本文描述的配體和dAb單體可以是可分泌的，但它們可以使用不采用大腸桿菌或畢赤氏酵母屬物種的任何合適方法產(chǎn)生，例如合成化學(xué)方法或生物生產(chǎn)方法。在一些實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑不包括駱駝科動物免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，或由駱駝科動物種系抗體基因區(qū)段編碼的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域獨特的一個或多個構(gòu)架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。VEGF的拮抗劑可以是單價或多價的。在一些實施方案中，拮抗劑是單價的，并且包含與VEGF相互作用的一個結(jié)合位點，所述結(jié)合位點由本發(fā)明的多肽或dAb提供。多價拮抗劑結(jié)合一個VEGF，并且可以不誘導(dǎo)VEGF在細(xì)胞表面上的交聯(lián)或聚簇，這可以導(dǎo)致受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？商娲兀琕EGF的拮抗劑是多價的。VEGF的多價拮抗劑可以包含關(guān)于VEGF的特定結(jié)合位點的2個或更多個拷貝，或包含結(jié)合VEGF的2種或更多種不同結(jié)合位點，至少一種結(jié)合位點由本發(fā)明的dAb提供。例如，如本文描述的，VEGF的拮抗劑可以是包括結(jié)合VEGF 的dAb的2個或更多個拷貝，或結(jié)合VEGF的2種或更多種不同dAbs的二聚體、三聚體或多聚體。在其他實施方案中，dAb以本文描述的Kd特異性結(jié)合VEGF，并且在標(biāo)準(zhǔn)鼠異種移植物模型中抑制腫瘤生長(例如，與合適對照相比較，使腫瘤生長抑制至少約10%)。在一個實施方案中，當(dāng)以約1 mg/kg或更多例如約5或10 mg/kg施用時，與標(biāo)準(zhǔn)鼠異種移植物模型中的合適對照相比較，多肽、dAb或拮抗劑使腫瘤生長抑制至少約10%或至少約25%、或至少約50%。在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑結(jié)合VEGF，并且在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測定中以< 100 nM的ND50拮抗VEGF的活性。
在特定實施方案中，當(dāng)施用有效量時，dAbs在眼疾病的動物模型中是有效的。一般地，有效量是約1 mg/kg -約10 mg/kg (例如約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg 或約 10 mg/kg)。dAb 可以以例如每天一次或兩次、每周一次或兩次、每月一次或兩次的給藥頻率施用。一般地，dAbs將以純化形式連同用于眼遞送的藥理學(xué)上合適的載體一起利用。一般地，這些載體可以包括水或醇/水溶液、乳狀液或懸浮液、包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)的任何一種。維持懸浮液中的多肽復(fù)合物所需的合適的生理學(xué)上可接受的佐劑，可以選自增稠劑例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體 (Mack(\^2)Remington fs Pharmaceutical Sciences，第 16 版)?？梢允褂枚喾N合適制劑， 包括延長釋放制劑。這些可以包括植入體、凝膠、納米顆粒(nanoparticle)和微粒。藥物裝載的PLA納米顆粒和微粒已用于在制劑的結(jié)膜下遞送后將藥物遞送給眼的后段(Kompella 等人IOVS 2003 44 (3) 1192-1201)。具體地，小球體保留在遞送部位，并且與可以更快速清除的納米顆粒相比較，看起來更適合于視網(wǎng)膜藥物遞送(Amrite等人ARVO摘要#5067/ B391 2003)。本發(fā)明的配體(例如，拮抗劑)可以作為分開施用的組合物或與其他試劑一起使用。這些可以包括用于眼遞送給眼的各種藥物和/或眼穿透增強劑和/或粘度增強劑。藥物組合物可以包括與本發(fā)明的配體一起的各種其他試劑的“混合物 (cocktails)”，或甚至具有不同特異性的根據(jù)本發(fā)明的配體的組合，例如使用不同靶抗原或表位選擇的配體，無論它們是否在施用前合并。dAbs對于眼的施用的精確劑量和頻率將依賴于患者的年齡、性別和狀況，其他藥物的同時施用，禁忌癥和由臨床醫(yī)生考慮的其他參數(shù)。本發(fā)明的dAbs可以凍干用于貯存且在使用前在合適載體中重構(gòu)。這種技術(shù)已顯示對于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，并且可以采用領(lǐng)域已知的凍干和重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到凍干和重構(gòu)可以導(dǎo)致不同程度的抗體活性喪失(例如對于常規(guī)免疫球蛋白， IgM抗體趨于具有比IgG抗體更大的活性喪失)，并且使用水平可能必須向上調(diào)整以補償。包含本文的dAbs或其混合物的組合物可以施用用于預(yù)防和/或治療處理。在特定治療應(yīng)用中，實現(xiàn)所選細(xì)胞群體的至少部分抑制、阻抑、調(diào)節(jié)、殺死或一些其他可測量參數(shù)的足夠量可以被定義為“治療有效劑量”。達到這個劑量所需的量將依賴于疾病的嚴(yán)重程度和患者的自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生將能夠確定治療、阻抑或預(yù)防疾病的合適給藥時間間隔。如果相對于治療前存在的此種癥狀，或相對于未用此種組合物治療的個體(人或模型動物)中的此種癥狀或其他合適對照，一種或多種癥狀減少(例如，在臨床評估規(guī)模上至少10%或至少1個點)，那么使用本文描述的組合物進行的治療或療法被視為“有效的”。 癥狀將明顯依賴于靶向的疾病或病癥而改變，但可以通過普通有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生或技術(shù)員進行測量。例如通過監(jiān)控疾病或病癥的一種或多種生物化學(xué)指示劑的水平(例如，與疾病相關(guān)的酶或代謝物的水平、受累細(xì)胞數(shù)目等)，通過監(jiān)控物理表現(xiàn)或通過公認(rèn)的臨床評估量表，可以測量此種癥狀。類似地，如果相對于未用此種組合物治療的相似個體(人或模型動物)中的此種癥狀，一種或多種癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重程度延遲、減少或取消，那么使用如本文描述的組合物執(zhí)行的預(yù)防是“有效的”。在一個實施方案中，本發(fā)明是用于治療、阻抑或預(yù)防眼疾病或狀況的方法，所述眼疾病或狀況選自例如癌癥(例如實體瘤)、炎性疾病、自身免疫性疾病、血管增殖性疾病(例如AMD (年齡相關(guān)性黃斑變性))，所述方法包括給有此需要的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、與VEGF結(jié)合的dAb或VEGF的拮抗劑，或IL-1、或TNF- α或 TNF-QR0此種眼疾病或狀況的例子包括AMD、葡萄膜炎、干眼病、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性黃斑水腫。形式
增加的半衰期在免疫球蛋白的體內(nèi)應(yīng)用中是有用的，特別是抗體且最特別是小尺寸的抗體片段。此種片段(Fvs、二硫鍵鍵合的FVS、FabS、SCFVS、dAbS)可以遭受從身體快速清除的缺點；因此，雖然它們能夠快速到達身體的大多數(shù)部分，并且快速生產(chǎn)且更易于處理，但它們的體內(nèi)應(yīng)用已受其在體內(nèi)的僅短暫持續(xù)限制。因此，本文描述的dAbs可以進行修飾， 以提供增加的體內(nèi)半衰期和因此體內(nèi)更長的持續(xù)時間。用于藥物代謝動力學(xué)分析和配體半衰期測定的方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。 細(xì)節(jié)可以在如仰< 仇義 .-Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Zfeier1S^yLPharmacokinetic analysis :A Practical ApproachC 1996) 中找至LU 還參考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker，2nd Rev. ex edition (1982)，其描述了藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，例如t α和 β半衰期和曲線下面積(AUC)。半衰期(伐α和伐β )和AUC可以由配體血清濃度針對時間的曲線進行測定。 WinNonlin 分析包(可從 Pharsight Corp. ,Mountain View，CA94040，USA 獲得)可以例如用于給曲線建模。在第一個相(α相)中，配體經(jīng)歷在患者中的主要分布，伴隨一些消除。第二個相(β相)是終末相，那時配體已分布且血清濃度隨著配體從患者中清除而減少。ta 半衰期是第一個相的半衰期，并且t β半衰期是第二個相的半衰期。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了配體或包括根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物，所述配體具有在15分鐘或更多的范圍中的t α半衰期。在一個實施方案中，范圍的下端是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。此外或可替代地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有在最高達且包括12小時的范圍中的t α半衰期。在一個實施方案中，范圍的上端是11、10、9、8、7、6或5小時。合適范圍的例子是1 - 6小時、2 -5小時或3 - 4小時。在一個實施方案中，dAb或包括根據(jù)本發(fā)明的dAb的組合物具有在30分鐘或更多的范圍中的ti3半衰期。在一個實施方案中，范圍的下端是45分鐘、1小時、2小時、3小時、 4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。此外或可替代地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物具有在最高達且包括21天的范圍中的t β半衰期。在一個實施方案中，范圍的上端是12小時、24小時、2天、3天、5天、10天、15天或20天。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有在12 - 60小時的范圍中的ti3半衰期。在進一步的實施方案中，它將在12 - 48小時的范圍中。在再一個進一步的實施方案中，它將在12 - 26小時的范圍中。
對于上述標(biāo)準(zhǔn)另外或可替代地，本發(fā)明提供了 dAb或包括根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物，所述配體具有在1 mg.分鐘/ml或更多的范圍中的AUC值(曲線下面積)。在一個實施方案中，范圍的下端是5、10、15、20、30、100、200或300 mg.分鐘/ml。此外或可替代地， 根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物具有在最高達600 mg.分鐘/ml的范圍中的AUC。在一個實施方案中，范圍的上端是500、400、300、200、150、100、75或50 mg.分鐘/ml。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體將具有在選自下述的范圍中的AUC :15 - 150 mg.分鐘/ml、15 -100 mg.分鐘/ml、15 - 75 mg.分鐘/ml、和 15 - 50mg.分鐘/ml。本發(fā)明的dAbs可以格式化為具有較大的流體動力學(xué)大小，例如通過附著PEG基團、血清清蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過與抗體結(jié)構(gòu)域綴合。例如，dAbs可以格式化為抗體的較大抗原結(jié)合片段或抗體(例如，格式化為Fab、Fab，、F (ab)2、F (ab，)2、IgG、scFv)。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的dAbs 可以格式化為具有另一種多肽或肽的融合物或綴合物。本發(fā)明的配體(例如，dAb單體和多聚體)的流體動力學(xué)大小可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進行測定。例如，凝膠過濾層析可以用于測定配體的流體動力學(xué)大小。用于測定配體的流體動力學(xué)大小的合適凝膠過濾基質(zhì)例如交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)是眾所周知且可容易獲得的。配體即dAb形式的大小(例如，與dAb單體附著的PEG部分的大小)可以依賴于所需應(yīng)用而改變，例如如果需要dAb保留在體循環(huán)中更長時間段，那么可以例如通過格式化為Ig樣蛋白質(zhì)來增加大小。通丄寸靶向 曾力口體內(nèi)半衰其月的抗JC或表位的半衰其月延長
配體的流體動力學(xué)大小及其血清半衰期還可以通過使dAb與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體或抗體片段)綴合或結(jié)合得到增加，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合增加體內(nèi)半衰期的抗原或表位，如本文描述的。例如，VEGF dAb可以與抗血清清蛋白或抗新生Fc受體抗體或抗體片段綴合或連接，例如抗SA或抗新生Fc受體dAb、Fab、Fab，或scFv，或與抗SA親和體或抗新生Fc受體親和體或抗SA avimer、或抗SA結(jié)合結(jié)構(gòu)域綴合或連接，其包括選自但優(yōu)選不限于下述的支架CTLA-4、脂質(zhì)運載蛋白(lipocallin)、SpA、親和體、avimer、GroEl和纖連蛋白(關(guān)于這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域的公開內(nèi)容，參見于2008年2月8日提交的PCT/GB2008/000453，所述結(jié)構(gòu)域及其序列引入本文作為參考且構(gòu)成本文正文的公開內(nèi)容的部分)。綴合指包括與結(jié)合結(jié)構(gòu)域鍵合(共價或非共價)的本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合血清清蛋白。增強體內(nèi)血清半衰期的合適多肽包括例如運鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥物試劑融合蛋白質(zhì)(參見美國專利號5，977，307，其教導(dǎo)引入本文作為參考)、腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體(例如，可溶性運鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長因子1 (IGF 1)受體、胰島素樣生長因子2 (IGF 2)受體、胰島素受體、凝血因子X、α 1-抗胰蛋白酶和HNF Ia。增強血清半衰期的合適多肽還包括α-1糖蛋白(血清類粘蛋白；AAG)、 α -1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α -1微球蛋白(蛋白質(zhì)HC ；AIM)、抗凝血酶IIKAT III)、脫脂載脂蛋白A-I (Apo A-1)、脫脂載脂蛋白B (Apo B)、血漿銅藍蛋白(Cp)、補體成分C3 (C3)、 補體成分C4 (C4)、Cl酯酶抑制劑(Cl INH)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、鐵蛋白(FER)、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)、脂蛋白(a) (Lp (a))、甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前清蛋白(運甲狀腺素蛋白；PAL)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和類風(fēng)濕因子(RF)。來自細(xì)胞外基質(zhì)的合適蛋白質(zhì)包括例如膠原、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白和纖連蛋白。 膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)。約15種類型的膠原分子是目前已知的，在身體的不同部分中發(fā)現(xiàn)，例如在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)的I型膠原(占90%的身體膠原)，或在軟骨、脊椎盤、脊索和眼的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)的Π型膠原。來自血液的合適蛋白質(zhì)包括例如血漿蛋白質(zhì)(例如，血纖蛋白、α-2巨球蛋白、血清清蛋白、纖維蛋白原(例如，纖維蛋白原Α、纖維蛋白原B)、血清淀粉狀蛋白A蛋白、觸珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白)、酶和酶抑制劑(例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)例如免疫球蛋白蛋白質(zhì)(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈(κ/λ ))、轉(zhuǎn)運蛋白(例如，視黃醇結(jié)合蛋白、α-1微球蛋白)、防衛(wèi)素(例如，β -防衛(wèi)素1、嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1、嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素2和嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素3)等。在血腦屏障處或在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白質(zhì)包括例如黑皮質(zhì)素受體、髓磷脂、抗壞血酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白等。增強體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括定位至腎的蛋白質(zhì)(例如，多囊蛋白、IV 型膠原、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白Kl、Heymarm氏抗原)、定位至肝的蛋白質(zhì)(例如，醇脫氫酶、 G250)、定位至肺的蛋白質(zhì)(例如，分泌成分，其結(jié)合IgA)、定位至心臟的蛋白質(zhì)(例如，HSP 27，其與擴張型心肌病相關(guān))、定位至皮膚的蛋白質(zhì)(例如，角蛋白)、骨特異性蛋白質(zhì)例如形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMPs)，其是顯示生骨活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化生長因子β超家族亞群(例如， ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8)、腫瘤特異性蛋白質(zhì)(例如，滋養(yǎng)層抗原、赫賽汀(here印tin)受體、雌激素受體、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B，其可以在肝和脾中發(fā)現(xiàn)))。合適的疾病特異性蛋白質(zhì)包括例如僅在活化T細(xì)胞上表達的抗原，包括LAG_3(淋巴細(xì)胞活化基因)、護骨蛋白配體(0PGL ；參見^Vatore 402,304-309 (1999)),0X40 (TNF受體家族成員，在活化T細(xì)胞上表達且在人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)生產(chǎn)細(xì)胞中特異性上調(diào)；參見/廁卯^. 165 (1) :263-70 (2000))。合適的疾病特異性蛋白質(zhì)還包括例如金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括CG6512果蠅、人截癱蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠 ftsH;和生血管生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF α)、 腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、血管生成素、白細(xì)胞介素-3 (IL_3)、白細(xì)胞介素_8 (IL_8)、 血小板衍生內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB (PDGF)JP CXXXC 趨化因子(fractalkine)。增強體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括應(yīng)激蛋白質(zhì)例如熱休克蛋白(HSPs)。HSPs 通常在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。當(dāng)它們在細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)時，它是細(xì)胞已死亡且溢出其內(nèi)容物的指示劑。當(dāng)由于創(chuàng)傷、疾病或損傷，細(xì)胞外HSI^s觸發(fā)來自免疫系統(tǒng)的應(yīng)答時，這種非程序性細(xì)胞死亡 (壞死)發(fā)生。與細(xì)胞外HSP結(jié)合可以導(dǎo)致本發(fā)明的組合物定位至疾病部位。與及Fc轉(zhuǎn)運有關(guān)的合適蛋白質(zhì)包括例如Brambell受體(也稱為FcRB)。這種Fc 受體具有2種功能，這兩者對于遞送都潛在有用。功能是(DIgG從母親跨越胎盤轉(zhuǎn)運到孩子，(2)保護IgG不受降解，從而延長其血清半衰期。認(rèn)為受體使來自內(nèi)體的IgG再循環(huán)。(參見，Holliger 等人，Sio iecAflo/ 15 (7):632-6 (1997)·) 結(jié)合血清清蛋白的dAbs
在一個實施方案中，本發(fā)明與眼靶分子例如VEGF、IL-I或TNF-α結(jié)合的第一種dAb， 和結(jié)合血清清蛋白(SA)的第二種dAb，如通過表面等離振子共振測定的，所述第二種dAb以 InM - 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μ M(即 χ 1(Γ9 - 5 χ 1(Γ4)，或 100 ηΜ - 10 μ Μ，或 1 - 5 μ Μ，或 3 - 70 ηΜ，或 IOnM - 1、2、3、4 或 5μ M 的 Kd結(jié)合SA。例如，如通過表面等離振子共振測定的30 - 70 ηΜ。在一個實施方案中，如通過表面等離振子共振測定的，第一種dAb (或dAb單體)以約1、50、70、100、150、200、300 ηΜ 或1、2或3 μ M的Kd結(jié)合SA (例如HSA)。在一個實施方案中，對于包括第一種抗SA dAb 和針對VEGF的第二種dAb的雙重特異性配體，第二種dAb對于其靶的親和力(例如，如通過表面等離振子共振測量的Kd和/或K。ff，例如使用BiaCore)是第一種dAb對于SA的親和力的 1 - 100000 倍(例如 100 - 100000、或 1000 - 100000、或 10000 - 100000 倍)。在一個實施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。例如，第一種dAb以約10 μΜ的親和力結(jié)合SA，而第二種dAb以100 pM的親和力結(jié)合其靶。在一個實施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。在一個實施方案中，第一種dAb以約50，例如70、100、150或200 ηΜ的 Kd結(jié)合SA (例如HSA)。雙重特異性配體的細(xì)節(jié)在W0030(^609、W004003019和W004058821 中找到。在一個實施方案中，本發(fā)明的dAbs可以包括dAb，如通過表面等離振子共振測定的，所述 dAb 以 InM- 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μ M (即 χ 10-9 - 5 χ 10-4)，或 100 nM - 10 μ Μ，或 1 - 5 μ Μ，或 3 - 70 ηΜ，或 IOnM -1、2、3、4或5μ M的Kd結(jié)合血清清蛋白(SA)。例如，如通過表面等離振子共振測定的30 -70 ηΜ。在一個實施方案中，如通過表面等離振子共振測定的，第一種dAb (或dAb單體)以約 1、50、70、100、150、200、300 ηΜ 或 1、2 或 3 μ M 的 Kd 結(jié)合 SA (例如 HSA)。在一個實施方案中，第一種和第二種dAbs通過接頭連接，例如1-4個氨基酸或1-3個氨基酸，或超過3 個氨基酸或超過4、5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸的接頭。在一個實施方案中，較長接頭 (超過3個氨基酸)用于增強效價(拮抗劑中的一種或兩種dAbs的KD)。在特定實施方案中，dAb結(jié)合人血清清蛋白且與選自下述的dAb競爭與清蛋白的
結(jié)合
MSA-16、MSA-26(關(guān)于這些序列的公開內(nèi)容參見W004003019，所述序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構(gòu)成本文正文的公開內(nèi)容的部分)，(關(guān)于這些序列的公開內(nèi)容參見W02007080392，所述序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構(gòu)成本文正文的公開內(nèi)容的部分；這個段落中的SEQ ID No，s是W02007080392中出現(xiàn)的那些)，
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包括與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，用于眼遞送。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍酌赣锌剐裕?其中所述蛋白酶選自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、解聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM、蛋白體、組織纖溶酶原激活物、分泌酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶d、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、絲氨酸蛋白酶rassi、和泛蛋白蛋白體途徑(UPP)，用于眼遞送。
3.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的組合物，其包括與選自下述的靶分子結(jié)合的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域VEGF、TNFa、TNF a R、IL-1、IL_lr、TNF a Rl、TGF β、IL-6、IL-8 IL-17、 IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和β淀粉狀蛋白，用于眼遞送。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中與VEGF結(jié)合的所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與下述至少97%等同的氨基酸序列(a)D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(b)D0M15-26-593-Fc 的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括在位置6上的纈氨酸，其中編號根據(jù)Kabat。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括在位置99上的亮氨酸，其中編號根據(jù)Kabat。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括在位置30上的賴氨酸，其中編號根據(jù)Kabat。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與選自下述的序列等同的氨基酸序列(a)D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，(b) D0M15-26-593-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中與IL-I結(jié)合的所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與下述至少97%等同的氨基酸序列(a) DOM 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示)；或(b)DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中與IL-I結(jié)合的所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與下述等同的氨基酸序列(a) DOM 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示)，或 (b)DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中與a-TNF-aRl結(jié)合的所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中與α-TNF-αRl結(jié)合的所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域包括與Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)等同的氨基酸序列。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其進一步包括抗體恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體恒定區(qū)是抗體Fc區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述抗體Fc區(qū)具有SEQID NO 3中所示的氨基酸 Fc序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域作為具有Fc的融合物存在，并且具有與D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)等同的氨基酸序列。
16.一種組合物，其包括裸免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，其與靶分子結(jié)合用于遞送至選自下述的一個或多個眼區(qū)域玻璃體液、房水、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中所述靶分子選自VEGF、VEGF拮抗劑、TNFα ,TNFa 受體、IL-I、a -TNF- a Rl、IL-6、IL-8、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo_a、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG) 和β淀粉狀蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍酌赣锌剐?，其中所述蛋白酶選自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、解聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM、蛋白體、組織纖溶酶原激活物、分泌酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、絲氨酸蛋白酶 I3RSS1、和泛蛋白蛋白體途徑(UPP )。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域選自(a) 與VEGF結(jié)合且包括與下述至少97 %等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(i ) D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(ii) D0M15-26-593_Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)，(b)與IL-I結(jié)合且包括與下述至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(i)D0M 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示);或(ii) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示);(c)與α-TNF-α Rl結(jié)合且包括與Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域。
20.一種組合物，其包括格式化的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，其與靶分子結(jié)合用于遞送至選自下述的一個或多個眼區(qū)域視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和淚液。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述靶分子選自VEGF、VEGF拮抗劑、TNFa、 TNFa 受體、IL-I、a-TNF-a Rl、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo_a、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和 β 淀粉狀蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍酌赣锌剐?，其中所述蛋白酶選自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、解聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM、蛋白體、組織纖溶酶原激活物、分泌酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、絲氨酸蛋白酶 I3RSS1、和泛蛋白蛋白體途徑(UPP )。
23.根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域選自(a) 與VEGF結(jié)合且包括與下述至少97 %等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(i ) D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(ii) D0M15-26-593_Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)，(b)與IL-I結(jié)合且包括與下述至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(i)D0M 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示);或(ii) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示);(c)與α-TNF-α Rl結(jié)合且包括與Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域具有約50 KDa的分子量。
25.根據(jù)權(quán)利要求20-24的組合物，其中所述免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域通過加入聚乙二醇或與抗體Fc融合進行格式化。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其進一步包括選自下述的一種或多種增強劑眼穿透增強劑和粘度增強劑。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其進一步包括藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
28.一種將根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項的組合物直接遞送給眼的方法，其包括通過選自下述的方法將所述組合物施用于所述眼例如通過滴眼劑或眼內(nèi)注射局部遞送給眼、眼周施用或通過緩釋制劑。
29.一種用于治療、預(yù)防或診斷眼狀況的方法，其包括通過選自下述的方法將根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項的組合物直接施用于眼眼內(nèi)注射、玻璃體內(nèi)注射、例如通過滴眼劑局部遞送給眼、或通過眼周施用和緩釋制劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法，其中所述組合物施用于選自下述的一個或多個眼區(qū)域眼的表面、淚管、淚腺、眼內(nèi)區(qū)域、前房、后房和玻璃體液。
31.一種將根據(jù)權(quán)利要求16-19和26-27的組合物遞送給選自下述的一個或多個眼區(qū)域的方法玻璃體液、房水、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，所述方法包括通過局部遞送例如通過使用滴眼劑將所述組合物施用于所述眼。
32.—種將根據(jù)權(quán)利要求20-27的組合物遞送給選自下述的一個或多個眼區(qū)域的方法視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和淚液，所述方法包括通過局部遞送例如通過使用滴眼劑將所述組合物施用于所述眼。
33.一種用于產(chǎn)生藥物組合物的方法，其包括(a)使權(quán)利要求1-27中任一項的組合物與(b)藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述藥物組合物用于治療、預(yù)防或診斷眼狀況或疾病。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述眼狀況或疾病選自AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫和葡萄膜炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域(dAbs)，例如其為蛋白酶抗性的dAbs，并且還涉及用于眼遞送的包括此種dAbs的制劑和組合物，及其治療眼疾病和狀況的用途。
文檔編號C07K16/22GK102224169SQ200980146999
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者F·庫克, G·W·高夫, I·R·凱奇波爾, L·耶斯佩斯, M·斯圖爾德 申請人:葛蘭素集團有限公司