專利名稱：控制水稻株高和粒形基因tud1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種控制水稻 株高和粒形基因71/￡)/ (T^ffll/Z>ww/7)，該基因所編碼的蛋白質及其功 能類似物，以及含有所述7T/Z)/基因核苷酸序列的載體和含有該基因核苷 酸序列或該載體的宿主細胞；另外，本發(fā)明還涉及利用所述載體轉化植物 細胞以改變植株高度和種子大小的方法。
背景技術：
水稻株高是構成水稻株型重要因子。適宜的株高是水稻高產(chǎn)的重要保
證，利用水稻矮稈突變基因——進行育種而引起的"綠色革命"即是
明證(1'2)(本文以阿拉伯數(shù)字表示所引文獻，下同)。我國乃至東南亞各國水
稻主產(chǎn)區(qū)的生態(tài)和生產(chǎn)條件也決定了在今后很長時間內(nèi)培育半高性水稻
品種仍將是提高水稻單產(chǎn)產(chǎn)量的主要目標。而我國水稻單產(chǎn)產(chǎn)量自經(jīng)歷五 六十年代半矮化育種和七八十年代品種間雜種優(yōu)勢利用育種后， 一直未有
真正意義上的突破；同時更令人擔憂的是，我國目前大面積推廣的無論是 純系品種還是雜種組合無一不是帶有基因的衍生系，這些衍生系品種 的遺傳親緣關系十分接近，而雜交各組合的不育系、恢復系彼此間的遺傳 背景也較為相似，眾多品種或組合間生產(chǎn)優(yōu)勢在統(tǒng)計上沒有顯著差別。因
此，挖掘和創(chuàng)制新的有用矮稈種質材料，將打破^z/基因單一供體局面，
擴大多種農(nóng)藝性狀好的水稻材料間的遺傳交流，豐富目前水稻品種的遺傳 背景，進而減少或避免因^^單一供源而被生物侵害的潛在風險，從而有 效提高水稻產(chǎn)量和質量。(2'3)。
已有研究結果表明，許多矮稈和半矮稈水稻品種的矮生性受一個隱性 主基因的控制，并受一些修飾基因的影響。矮稈基因依照其矮化效應不同， 一般分為二類矮稈基因和半矮稈基因。矮稈是指成熟時植株高度等于或低于原正常植株高度一半的矮稈突變系，定名為d (dwarf)系列；半矮稈 則是指株高介于矮稈和正常植株高度之間的類型，定名為sd(semi-dwarf) 系列。目前d系列的矮稈基因己登記的有60多個，sd系列的半矮稈基因 有13個。在矮稈基因中，絕大多數(shù)為無育種或經(jīng)濟價值的矮稈基因，因 為它們對構成水稻產(chǎn)量的穗數(shù)、粒數(shù)和粒重三因子中的某一個或兩個性狀 均產(chǎn)生不良的多效作用，以致于到目前為止，秈型水稻矮稈基因的利用仍 局限于^W。但矮稈基因的表達卻是相當復雜的，可能具有"一因多效" 的特性，即除了具有降低株高和節(jié)間長的作用外，還可能對植株的生長勢、 株型、種子形狀大小等發(fā)生作用，如^/-/基因同時具有促進早分蘗和分蘗 數(shù)的作用(4，5)。正因如此，發(fā)現(xiàn)并對調控水稻株高不同基因分子功能進行一 一研究，不僅有助于闡明調控水稻株高等性狀的基因分子網(wǎng)絡，而且對將 來水稻可能實現(xiàn)的分子設計育種中如何挑選有利種質，搭配合理農(nóng)藝性狀 提供可行性。
最近的分子遺傳研究顯示植物體的內(nèi)源激素，如赤霉素(GAs)和油 菜素內(nèi)酯(BRs)及其受體的合成是決定植株株高的重要因素。前述的水 稻"綠色革命"基因GW)是赤霉素生物合成途徑的一個關鍵酶，水稻突 變體A/S和AJ5也被發(fā)現(xiàn)與GA合成有關(6'9)。通過與GA和BR合成及 其信號傳導相關的一些矮稈基因克隆和功能的研究，水稻矮生性與這兩類 激素合成和信號傳導的分子機理已初現(xiàn)端倪。如通過對赤霉素不敏感突變 體gW7的基因定位克隆分析，發(fā)現(xiàn)GZD7編碼的蛋白是屬于 hormone-sensitive lipase (激素敏感脂肪酶)(HSL)家族一個蛋白，是一 個核定位蛋白，且與DELLA蛋白能發(fā)生相互作用；通過與配體——赤霉 素飽和動力學試驗發(fā)現(xiàn)GID1與有活性的赤霉素是特異結合的，而突變的 G/D/卻不能;g/W矮稈突變體對赤霉素不敏感，在gidl突變體過表達G/D/ 后，對赤霉素反應植株表現(xiàn)比野生型更敏感。因此水稻中可溶性核定位蛋 白GID1被人們認為是水稻赤霉素反應的受體(13'")。對另外一個GA非敏 感型水稻突變體W的研究揭示，顯性等位基因Dl基因編碼異源三聚體G 蛋白的a亞基(Got)并在GA信號轉導中起作用""；而Z)2基因翻譯產(chǎn)物 為BR合成途徑中的細胞色素P450家族的新成員W。 突變體是由編碼 蛋白激酶，即BR受體的基因功能缺失造成(15);而6ra7、 ^vw/7/突變體則都是BR生物合成受阻而導致矮化(7' 1])
本發(fā)明從改變我國目前水稻生產(chǎn)上單一利用SW矮源品種現(xiàn)狀，進一 步提高我國水稻育種水平，加深了解水稻株高發(fā)育的分子機理出發(fā)，從我 國兩萬四千多份水稻種質材料篩選出一個與已經(jīng)報道的矮稈水稻不等位 新的矮稈水稻材料。運用圖位克隆技術克隆了該矮稈基因——^W，該基
因編碼一個含有U-box結構域的蛋白，并通過功能互補實驗也已鑒定了該
基因。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面，本發(fā)明提供一種控制水稻株高和種子大小基因n/D7
編碼的蛋白質，其具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列，或者SEQIDN0:2 所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入而獲得的， 仍具有控制水稻株高和種子大小功能的類似物，或與SEQ IDN0:2所示的 氨基酸序列具有至少55%的同源性的功能類似物。在一個實施方案中，所 述蛋白質具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列。
在第二個方面，本發(fā)明提供編碼第一個方面所述蛋白質氨基酸序列的 基因或通過對所述基因所示的核苷酸序列進行取代、插入或缺失一個或多 個核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物，其與上述基因序列具有相同 功能并能達到本發(fā)明目的。在一個實施方案中，所述基因具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。
在第三個方面，本發(fā)明提供一種載體，其包含在第二個方面所述的基 因或其片段。在一個實施方案中，所述載體是植物表達載體。在一個優(yōu)選 實施方案中，所述載體是/ C4MB"/3M。
在第四個方面，本發(fā)明提供一種含有第二個方面所述的基因或其片段 或第三個方面所述的載體的宿主細胞。在一個實施方案中，所述宿主細胞 選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌或植物細胞。
在第五個方面，本發(fā)明提供一種用n/z)/進行高效植物遺傳轉化的方法。
在第六個方面，本發(fā)明提供了一種利用植物表達載體轉化植物細胞以
改變植株高度和種子大小的方法，所述方法包括下列步驟1) 用本發(fā)明第三個方面所述的載體轉化植物細胞；和
2) 將所述轉化的植物細胞培養(yǎng)成植株。
在一個實施方案，所述轉化的方法包括農(nóng)桿菌介導法或基因槍法。在一個 實施方案中，所述植物是水稻。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式步驟如下
一、 水稻矮稈突變體&J7的分離和遺傳分析
本發(fā)明中進行圖位克隆研究的矮稈且粒形小水稻^W-7來自秈型水
稻品種明恢63自發(fā)突變，^W-7和正常水稻品種進行正交和反交，所有 Fl植株均不表現(xiàn)矮稈。而在雜交組合的F2代分離群體中，正常的和矮稈 植株呈典型的3:1分離(x2: 0.077,0.75<P<0.9)。這一結果表明突變 體性狀受單隱性基因控制。
二、 圖位克隆控制水稻株高和粒形的7I/D1基因
為了分離基因，本發(fā)明首先建立了一個大的多態(tài)性高的定位群 體，由tudl與粳稻品種日本晴雜交而形成的F2群體，再通過圖位克隆的 方法，并利用S叫uence-Tagged-Site(STS,序列標簽位點)、Simple Sequence Repeats(SSR,簡單重復序列)分子標記對位點進行初步定位，將其 初步定位在第3染色體的短臂上，并介于RM3131和RM1022兩個公共分 子標記之間 (http:〃www.gramene.org/db/markers/marker—view)， 在此基石出 上，我們設計了 PCR引物s119341和s32861分別以突變體^W-7與粳稻 品種日本晴的基因組DNA為模板進行PCR擴增，將基因初步定位 在STS標記sll9341和s32861之間(見表l，圖2)。
通過己測序的位點區(qū)域的PAC序列，建立PAC克隆重疊群， 發(fā)展8個STS標記和一個SSR標記，如表1所示，將7I/Z)/精確定位于 STS標記P2和P3之間的18.647 kb的范圍之內(nèi)。通過測序分析此區(qū)段的 開放閱讀框(ORF)推測候選基因，并通過其他三個&W等位突變體加以驗 證(圖2)。表l:發(fā)展用于7T/Z)7定位的分子標記
分子標記 PCR擴增產(chǎn) 正向引物序列(5'-3')
物大小(bp)
S119341 259 GGACATCGGTACTACCATAGTC
A
s155769 131 GAACCGGCAAATGAACATAAG
PI
P2
P3
P4
P5
180 AAGCTACGGTTGCCTCCTC
120 GGTAGCGTCATGGTGTGC
171 CAGTGAGATCCACATGCCA
147 AGCGGCAACGGCATAACAC
162 CCATGTTCTCTCCAGTTCCC
s99245 113 GGGAATAGCAATCAACTGAAA
s32861 270 CAGTGTAAGTCAGACATTTCCG
反向引物序列(5'-3，)
CTCTCGCAATGTCGA TCCA
CGGCTAATATGGTGAT ATGGAC
GTTGGATGGGCAGAG GCT
GAACATAAGCCTATTA TCACGA
CAGTAGGACCCATAT GTAACACA CCGCAGCCCCTCCTT CCTC
TGCGGGTAATAGAAG AGGAA
GAAGTTGTACAGCCT GTCCG
CTGGACTGGTAATGG TTCTAGG
R/D/基因的鑒定和功能分析
利用pCAMBIA1300質粒構建互補載體(圖5)，通過轉基因技術，進 行功能互補的轉基因研究，結果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復正常功能 的轉基因水稻(圖6)，證明了本發(fā)明正確克隆了H7Z)7基因，明確7I/Z)/基因 的DNA序歹U(圖4)，氨基酸序列分析表明TUDl基因編碼含有U-box結構域 的蛋白(圖6)。
本發(fā)明通過圖位克隆方法克隆水稻中一個控制株高和粒形大小的基因……71//)/，利用該基因的功能特性，在水稻中進行分子設計育種，選 育適宜的水稻株高和種子大小的品種具有很強的可操作性。


下面將結合附圖對本發(fā)明進行進一步詳細描述。 圖1矮稈水稻與其野生型的表型比較，
圖1A水稻成熟期植株高度比較， 左為野生型，右為
圖1B水稻地上部各節(jié)間長度比較， 左為野生型，右為
圖1C水稻糙米大小比較， 左1為野生型，其余四為化W，
標尺l厘米。
圖2 71/￡)7基因的定位及候選基因確定。 圖3 基因的DNA序列。
圖4 7I/D/基因編碼的氨基酸序列。 圖5 7T/Z^基因功能互補載體圖譜。 圖6 基因功能互補實驗驗證。 圖左7T/Z)7野生型水稻抽穗期植株。
圖中rt/D/基因轉入/"W-3突變體背景的TQ代抽穗期植株。 圖右m^-3突變體抽穗期植株。
圖7:野生型7Z/"厶^W-3突變體、轉n/"7基因植株的TUDl蛋白表達， 其中箭頭所示為GST—TUD1蛋白大小位置。
實施例
以下本文將通過具體的實施例來描述發(fā)明，但是所述實施例僅是為了 舉例說明，而并非對本發(fā)明的限定。
實施例l:水稻7T/Z)/候選基因的獲得 1、水稻材料
用于定位的矮稈且粒形小的水稻(0;;^ M0'ra ssp.)為單隱性自發(fā)突變 體，其原始野生型為秈型品種——明恢63(IR36/圭630)，其余三個等位 的單隱性自發(fā)突變體^W-"W/-J,to7J分別來自育種材料D506 (明恢63/紫恢100)， H7788 (特特普)，ZH3(密陽23)，這三個品系也是秈型水 稻背景(圖1)
2、 分析和定位群體
純合的矮稈秈稻品系/w"7和粳稻品種日本晴(Nipponbare)進行雜交，F(xiàn), 代自交，共得到7500個F2個體，并從中選出1,680個個體作為定位群體。 在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。
3、 通過SSR， STS標記定位7T/Z>/基因
采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位 的基因組DNA。取大約100mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小 研缽中磨成粉狀，轉移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶 解于lOOpl超純水中。每一個SSR、 STS分子標記引物反應用1^1 DNA 樣品。反應體系為20pl體系，內(nèi)含10xPCR緩沖液2jil， 2.5mMdNTP mix 1.6fil， 5MM的上游引物和下游引物(見表一)各l.Ojil， TAQ酶 (15U/pl) O.lpl。在PE9600或9700或MJ PCR儀上擴增94。C預變性 3min， 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C lmin，共計35個循環(huán)；72。C延伸 10min。分別以定位的ft^7-/和日本晴兩個親本基因組DNA為模板進行 PCR擴增獲得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)3-5。/。瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB) 染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性。
初定位研究發(fā)現(xiàn)，基因被定位于第3染色體的短臂上的 28.2-36.9cM之間，即在SSR公共分子標記(http:〃www.gramene.org/): RM3131和RM1022之間。在此基礎上，我們進一步設計了多態(tài)性引物 W/9M7和"256/ (引物序列見表一)，將7T/D/基因初步定位在兩個STS 標記之間。
為了將7T/D/定位在一個PAC克隆上，我們用己公布的水稻品種 Nipponbare的PAC文庫(http:〃rgp.dna.affrc.go.jp)序列構建了 位點 附近的重疊群，設計PCR引物sl55769,Pl,P2,P3,P4,P5,s99245(見表一)分 別以7和日本晴的基因組DNA為模板在PE9600 PCR儀上擴增94 。C預變性3min， 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C lmin，共計35個循環(huán)； 72。C延伸10min經(jīng)3-5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢 測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性。以此發(fā)展了 STS、 SSR標記，并用于群體精細定位，最終將其定位在一個PAC克隆^C703卵/上(圖2)。
4、 rc/D/基因的精細定位
根據(jù)公布的PAC克隆」C705卵7的序列(http:Vrgp.dna.affrc.go.jp)，發(fā) 展了 P1,P2,P4，P5等4個STS標記和一個SSR標記P3，最后通過連鎖分析 將7I/D/定位在SSR標記尸2與尸3之間18.674kb的范圍之內(nèi)(圖2)。
5、 7T/"7候選基因的獲得與功能的預測
首先對18.674kb的全長基因組序列用GENSCAN軟件 (http:〃genes.mit.edu/GENSCAN.html)預測可能的編碼區(qū)(ORF)，發(fā)現(xiàn)這個 區(qū)間共有3個ORF。我們分別在和野生型植株同時利用9(C預變性 3min，94。C lmin，58。C lmin，72。C lmin，共計35個循環(huán)；72。C延伸10min PCR程序擴增這三個基因，并進行測序比較，發(fā)現(xiàn)其中一個含有U-box 結構域ORF序列在突變體背景多出一個堿基G,隨后我們接著在另外 三個沒有做定位但經(jīng)典遺傳證明是與^/7-7等位的^/7-"W/-3，m^-4材 料擴增該基因，分別發(fā)現(xiàn)在這個ORF上有堿基替換和大片段缺失突變。 據(jù)此我們認為該基因就是2T/Z)/候選基因。(圖2)擴大序列范圍預測，并 將基因產(chǎn)物用blastX軟件預測(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/BLAST),同 時用DNAStar軟件(Lasergene) MegAlign程序中的ClustalW方法進行蛋白 質序列比較和進化樹分析,結果認為該基因編碼的蛋白含有U-box結構 域，對植株生長和種子發(fā)育起著重要作用(圖4)。
實施例2 : 7T/Z)/基因的功能互補驗證
用Smal和Sail兩個限制性內(nèi)切酶從WC克隆6^Wi5a(W^/Z^S(購自 上海南方基因中心)切下帶有7!/Z)7部分全長的4,662kb大小的片段，再用 Sall、 Pstl作為酶接頭特異引物擴增1，773kb的DNA片段，將它們連接成 一個6,429kb片段，包含起始密碼子ATG上游的3,169個堿基和終止密碼 子TGA后的1,880個堿基的全長序列，克隆到雙元載體pC4M萬"/3W(購 自CAMBIA公司)中，獲得了用于轉化的質粒pC4MS"〃6^-7I/Z)7 (圖 5)(克隆和鑒定方法見分子克隆實驗指南(第三版)(中譯版)黃培堂等 譯，科學出版社，2002年9月出版》)。
將所述質粒通過電擊的方法轉入農(nóng)桿菌(JgroSa"eWMm ^me/ac/era)株系EHA105 (本實驗室制備，參照《植物基因工程》，王關林、方宏筠， 科學出版社，2004年，第2版等))中轉化水稻。采用農(nóng)桿菌介導的轉化 方法導入矮稈突變體&W-3中。具體步驟如下 (1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導。 將去殼的水稻矮稈突變體/MW-3種子經(jīng)70%乙醇表面消毒3 min后， 用30% NaClO溶液攪拌消毒40分鐘，無菌水沖洗4-5次，浸泡過夜后用
濾紙吸干。將滅菌后的成熟胚直接接種于N6D2培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，于
25-26°C,暗培養(yǎng)4-7天后就可從盾片處誘導出初生愈傷組織。同時用鑷子 去掉胚上長出的胚芽。期間每隔十天繼代一次，至長出胚性愈傷。
(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。將構建好的/ C^kffi"〃W-7I/D/重組質粒和空 載體/ C4MB/^/3W ，分別用1800v電壓，2秒電擊轉化EHA105農(nóng)桿菌感 受態(tài)細胞(本實驗室制備，參照《植物基因工程》，王關林、方宏筠，科 學出版社，2004年，第2版等))，在含有50mg/L潮霉素的YEB平板培 養(yǎng)基(表2)上28 。C培養(yǎng)48小時。挑取農(nóng)桿菌單克隆接種于20 ml YEB 液體培養(yǎng)基中，28X:搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期；取0.5ml活化后的菌種轉 接至50mlYEB培養(yǎng)基(50mg/L潮霉素)中，28 。C培養(yǎng)至OD6。o為0.5 左右。
(3)共培養(yǎng)及轉化、篩選、分化。首先收集轉入pC^kffi/J^M-TI/D/ 重組質粒或轉入空載體的培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌體，4°C， 4， OOOg， 10 min離 心，等體積AAM-AS培養(yǎng)基(表2)中重懸，將預培養(yǎng)4天的&W-3胚 性愈傷組織浸入此AAM-AS菌液，侵染20 min。然后將愈傷組織轉移到 N6D2C培養(yǎng)基(表2)(培養(yǎng)基上鋪一張無菌濾紙)，25。C暗培養(yǎng)3天后， 用無菌水(300 mg/L頭孢霉素)洗滌愈傷組織4-5遍，無菌濾紙吸干后轉 愈傷組織至N6D2S,培養(yǎng)基(表2)上，進行篩選。兩周后，轉移至N6DasS2 (表2)培養(yǎng)基上進行第二代篩選(2周/代)，重復此步驟一次。經(jīng)3代篩 選生長旺盛的抗性愈傷組織轉移至預分化培養(yǎng)基上，在分化培養(yǎng)箱(12 小時光周期，白天28。C，夜晚25。C)中培養(yǎng)7天。分化培養(yǎng)基上轉接一 次后，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。再生植株在生根壯苗培養(yǎng)基上 生根壯苗，待小苗長至10cm左右，打開封口膜，煉苗2-3天后，將小苗 移入試驗田,進行表型鑒定。在轉基因植株成長到抽穗期時，比較轉入野生 基因植株和轉入pCMS/i:"空載體(空載體轉化方法與野生7T/Z)/基因方法相同)植株發(fā)現(xiàn)，轉入7I/Z)/基因的^W-3突變體植株恢復到正常
野生植株高度，粒形也恢復正常大小，而只轉入空載體的^W-3突變體植 株株高和粒形未發(fā)生改變，表明TUD1能夠在突變體中實現(xiàn)功能互補，證 明TUD1發(fā)生功能失活突變，會導致水稻植株變矮化且粒形變小。結果見 圖6。
表2農(nóng)桿菌介導轉化水稻所用培養(yǎng)基
愈傷組織誘導、繼代及抗性愈傷組織培養(yǎng)
N6鹽分和維生0.5g/l酪蛋白水解物，30g/l蔗糖， 2mg/l 2,4-D, 8g/IAgar (Sigma) , pH5.8
N6D2, 25mg/l潮霉素B (Roche), 400~600mg/l羧芐青霉素 (carbiciline)
N6Dq.5, 50mg/l潮霉素B, 200 300mg/l羧節(jié)青霉素
5 g/L蛋白胨,1 g/l酵母提取物,5 g/l牛肉浸膏，5 g/l蔗糖，2誦o1/1 MgS04, pH7.0
3g/LK2HP(Xl g/LNaH2P04,1 g/LNH4CI,300mg/LM gS。4.7H20,150mg/ LKCI, 10mg/LCaCh,2.5mg/LFeSO4.7H2O,5g/L葡萄糖，pH7.0
與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用培養(yǎng)基
,m AA鹽分和氨基酸，MS維生素，0.5g/l酪蛋白水解物，36g/l葡萄糖，
68.5g/l蔗糖，100~400 ti mol/l乙酰丁香酮，pH5.2
N6D2, 10g/l葡萄糖,100-400 u mol/l乙酰丁香酮(用時現(xiàn)加)，pH5.2
N6D2C
抗性愈傷組織分化用培養(yǎng)基
MS鹽分和維生素，0.3g/l酪蛋白水解物，30g/l蔗糖，2mg/1 6-BA, 0.2mg/l NAA, 0.2mg/l玉米素(Zeatin), 0.5mg/l KT, 2.5g/l Phytagel, MSR pH5.8, 50mg/I潮霉素B, 200mg/l頭孢霉素
再生小苗生根壯苗用培養(yǎng)基
1/2MS ( M麗hige和Skoog, 1962)鹽分，MS維生素,30g/l蔗糖， 1/2MSq 50mg/l潮霉素，8g/l Agar, pH5.8
注繼代和篩選用培養(yǎng)基，潮霉素及羧芐青霉素等的濃度同N6D2d和N6D2C2。
N6D2
N6D2S1
N6D0.5S2
農(nóng)桿菌培養(yǎng)
YEB實施例3:野生型7M^植株、tud1-3突變體植株、轉7M 7基因植株的TUD1 蛋白表達
為了驗證野生型7^W植株、tudl-3突變體植株、轉7Z/Z^基因植株 的TUD1蛋白表達情況，我們將野生型TUD1植株、tudl-3突變體植株、轉 TUD1基因植株中的7Z/W全長編碼序列克隆入蛋白表達載體pGEX-6P1
(Amersham Biosciences公司)。PCR擴增引物為5'-CGGGATCC ATGCCGCAGTACCAGGAGC-3'(下劃線為 fcoR I 酶切位點)和 5'-CAGTCGACTCACTGGATTGTCTTCGTAA-3'(下劃線為5"W I酶切位點)?？?隆方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(中譯版)黃培堂等譯，科學 出版社，2002年9月出版》。經(jīng)測序鑒定野生型TUD1植株、tudl-3突變 體植株、轉TUD1基因植株中的71/貝全長編碼序列，分別與蛋白表達載體 pGEX-6Pl正確融合后，用這三個重組表達質粒分別轉化(42攝氏度熱激 法，參照《分子克隆實驗指南》(第三版)(中譯版)黃培堂等譯，科學出 版社，2002年9月出版，)表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)(本實驗室制備，
《分子克隆實驗指南》(第三版)(中譯版)黃培堂等譯，科學出版社，2002 年9月出版》)。挑上述轉入重組質粒的單菌落，在LB培養(yǎng)液中加0. 5 mM 的IPTG誘導表達，37"C下誘導4h，然后離心收集全菌體。將所述菌體 加100 W的2倍蛋白加樣緩沖液(2xSDS(十二垸基硫酸鈉)蛋白加樣緩 沖液(loadingbuffer)成分0.5M Tris'Cl (pH6.8) 12.5ml, 20。/。SDS(十二烷基 硫酸鈉)11.5ml,Glycerin (甘油)10m1,2。/。， Blue-Bromo-phenol (溴芬蘭) 2.5ml,卩-mercaptoethanol (卩巰基乙醇)5.0ml力口 H20至總體積50 ml，分 裝(3-mercaptoethanol在臨用前加入)，IO(TC沸水中煮5 min。最后，經(jīng) SDS-PAGE電泳鑒定(參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(中譯版)黃培 堂等譯，科學出版社，2002年9月出版》)在蛋白分子量70KD左右，在 野生型TUD1植株和轉7Z/貝基因植株中得到了 GST-TUD1重組蛋白，而在 tudl-3突變體植株中沒有得到重組蛋白，說明在該突變體中，由于7Z/"7 基因發(fā)生了突變，其未表達出該重組蛋白。(結果見圖7)。參考文獻
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<160> 2
<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 2472
<2I2〉 DNA
<213〉 水稻
<■〉 1 tggct,tggacC3g8tCtC3C3ttttttgUC3gtttCtCtcca.cgccscc3CtCCCtCCt60
ccctcttcctcttccccttcCtCCtC3CCtCCC3ttCCCtcag3tcttccCCC3t3tCtC120
tctgtctcgccgcagtccgcctxccaatctg3gg3gCtUtcttcagctcaagc"ttcttg180
ctcgctt.gctctctactatctctccttttga.ctcgtggcca.agctgcagaggaaacccaa240
aattccaaga3S3gC33Caggtcaagaaagagggaa,agctaaggtgagaggagatgggag300
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UccgtctcgCCCgCC3gtgcgctggtaaaagggcctcgccgtccgtccgtccggccggc420
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cttgccacaatgCCgC3gt.3ccagg3gcttccctgcggcgggcaggtgctcgacatcgac540
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sgc:gct ccgcCgtiCttCC3Cggccgggc:cgccgagctcgt.ccacgcgctc960
CgCggC3CggCCgtCCCg33gaggc3gcccCtC33gggtC3ggccagggtagccgcgctc1020
cgggagctgcggtccctcgccgccgcccacca.gtccgtgaccaaggccatcgccgsggcc1080
ggcggcgtcgggctgttgacctccctcctcggcccctt,cacgt,cacacgccgtggggtcc1140g3ggCggtCgccattcttg"tgagcggcgtgccgctcgacgccgacgccaa ggccgcattg1200
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3 3g3tC3 3Ct:gcgtccgcctC3tCCgC3t3ctcatggsggaga.aaggcttccggccggac1320
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<210> 2
<211> 459
<212〉 PRT
<213> 水稻
<400〉 2
Met Pro Gin Tyr Gin Glu Leu Pro Cys Gly Gly Gin Val Leu Asp lie 15 10 15
Asp Thr Ala Leu Lys Asp Gly lie Leu Gly Gly Gly Pro Glu Leu Gly 20 25 30
Asp A]a Ala Ala Glv Asp Glv Gl、' Lys Gin Pro Val G]ii Leu Arg Lvs 35 40 45
Met Met Asp Glu Leu Asp /Ua Ala Glv Asp Glv Gly Glv Asp Glu Ala 50 55 60Val Pro Ala Val Phe lie Cys Pro lie Ser Leu Glu Pro Met Val Asp 65 70 75 80
Pro Val Thr Leu Cvs Thr Gly Gin Thr T\r Glu Ser Ala Asn lie Ser 85 90 95
Arg Trp Leu Ala Leu Gly His Arg Thr Cys Pro Thr Thr Met Gin Glu 100 105 110
Leu 丁rp Asp Val 丁hr Pro lie Pro Asn Thr Thr Leu Arg Gin Leu lie 115 120 125
Ala Ala Trp Phe Ser Arg Arg Tyr 丁hr Arg Phe Lys lys Arg Ser Ala. 130 135 140
Asp Phe His G]v Arg A〗a Ala Glu Leu Va] His Ala Leu Arg Gly Thr 150 155 160
A]a Val Pro Us Arg Gin Pro Leu Us Gly Gin Ala. Arg Val Ala Ala 165 17b 175
Leu Arg G]u Leu Arg Ser Leu Ala Ala Ala His Gin Ser Val Thr Lys 180 185 190
Ala lie Ala Glu Ala Gly Gly Val Gly Leu Leu Thr Ser Leu Leu Gly 195 200 205
Pro Phe Thr Ser His Ala Val Glv Ser Glu Ala Val Ala lie Leu Val 210 215 220
Ser Glv Val Pro Leu Asp Ala Asp Ala Lys Ala Ala Leu Met Gin Pro 225 230 235 240
Ala Lys Val Ser Leu Leu Val Asp Met Leu Asn Glu Gly Ala Val Asp 245 250 255
Thr Lys lie Asn Cys Val Arg Leu lie Arg lie Leu Met Glu Glu Lys 260 265 270
Glv Phe Arg Pro Asp Thr V" Ala Ser Leu Ser Leu Leu Val Gly Val 275 280 285
Met, Arg Leu Val Arg Asp Us Arg His Pro Asp Gly Val Ala Ala Glv 290 295 300
l,eu Glu L,eu Leu Asn Ser lie Cys Ala Val His Lys Pro Ala Arg Ser 305 310 315 320
Leu lie Val Ser lie Gly Ala Val Pro Gin Leu Val Glu Leu Leu Pro 325 330 335
Glu Pro Thr Glu Cys Val Glu Pro Ala. Asp lie Leu Asp Ala 340 345 350
UnAla A〗a VaPro Glu Glv Arg lie Ala Leu Us Asp Cys Pro Arg 355 360 365Thr lie Thr Asn Ala Val Arg Leu Leu Met Arg Val Ser Glu Ala Cys 370 375 380
丁hr Arg Arg Ala Leu Ser Met Leu Trp Val Val Cys Arg Met A〗a Pro 385 390 395 400
Glu Glu Cvs Ala Pro Ala Ala Leu Asp Ala Glv Leu Gly Ala Lys Leu 405 410 415
Leu Leu Val lie Gin Ser Gly Cys Gly Pro Glu Leu Lys Gin Gin Ala 420 425 430
Ser Glu Leu Leu Lys Leu Cys 丁hr Met Asn Cys Thr Ser 丁hr Val Phe 435 440 445
lie Ser Lvs Cvs Lys Leu 丁hr Lys Thr lie Gin .450 45權利要求
1、一種控制水稻株高和種子大小基因TUD1編碼的蛋白質，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入而獲得的仍具有控制水稻株高和種子大小功能的類似物，或者與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少55％的同源性的功能類似物。
2、 根據(jù)權利要求1所述的蛋白質，它具有SeqlDNo.2所示的氨基酸序列。
3、 一種編碼權利要求1所述的蛋白質或其功能類似物的基因。
4、 根據(jù)權利要求3所述的基因，它具有Seq.ID.No.l所示的核苷酸序列。
5、 一種基因，其是在權利要求3或4所述基因的核苷酸序列中通過取代， 插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
6、 一種含有權利要求3， 4或5所述的基因或其片段的載體。
7、 權利要求6所述的載體，其為植物表達載體。
8、 權利要求7所述的載體，其為/7C^kffi"/3W。
9、 一種宿主細胞，該細胞含有權利要求3， 4或5所述的基因或其片段。
10、 一種宿主細胞，該細胞含有權利要求6-8任一項所述的載體。
11、 根據(jù)權利要求9或10的宿主細胞，該細胞選自大腸桿菌細胞、農(nóng)桿 菌細胞或植物細胞。
12、 一種在植物中調控株高和種子大小的方法，包括用權利要求6-8任一 項所述的載體轉化植物細胞，和將轉化的植物細胞培育成植株。
13、 按照權利要求12所述的方法，其中所述的轉化包括農(nóng)桿菌介導法或 基因槍法。
14、 根據(jù)權利要求12或13所述的方法，其中所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制水稻株高和種子大小的基因及其編碼蛋白，本發(fā)明還公開了包含所述基因及其片段的載體，宿主細胞，本發(fā)明還公開了在植物中調控株高和種子大小的方法，所述方法包括用包含所述基因的表達載體轉化植物細胞，和將轉化的植物細胞培育成植株。本發(fā)明的基因在揭示水稻株高和種子大小形成機理具有重要理論意義，對于水稻分子株型和產(chǎn)量設計育種，塑造適宜的水稻產(chǎn)量因子，有效地提高水稻產(chǎn)量也具有極強的可操作性。
文檔編號C12N15/82GK101544691SQ20081010279
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月26日 優(yōu)先權日2008年3月26日
發(fā)明者胡興明, 薛勇彪, 郭龍彪, 前 錢 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所;中國水稻研究所