專利名稱：：安全性改善的表達載體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了包含可用于表達目的蛋白的內(nèi)部啟動子的表達載體。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含增強子缺失型U3區(qū)的反轉錄病毒載體。
背景技術：
：基因轉移涉及將遺傳物質轉移到細胞內(nèi)，通常用于轉錄和表達。該方法適合于蛋白表達以及治療用途。已知各種轉移方法，例如DNA轉染和病毒轉導。由于轉移效率高、轉基因表達水平高、以及需要時可通過自然親和力或假型化而耙向特定受體和/或細胞類型的潛力，病毒介導的基因轉移有吸引力。具體而言，由于反轉錄病毒載體可整合到細胞基因組內(nèi)，它們可用于更長時間的表達。基于鼠白血病病毒(MLV)的載體是最常見的反轉錄病毒載體，其具有適合多數(shù)應用場合的許多骨架質粒和包裝細胞系(例如參見MillerandButtimore,M/.Ce〃.歷o/.6:2895(1986))。與所有的"簡單"反轉錄病毒例如只編碼結構病毒蛋白和酶病毒蛋白且不使用病毒輔助蛋白的反轉錄病毒一樣，MLV載體只可整合到處于分裂的細胞中。其他可能適合于用作載體的簡單反轉錄病毒包括哺乳動物C型病毒的其他成員(例如鼠干細胞病毒、Harvey鼠肉瘤病毒和脾臟壞死病毒)、B型病毒(例如小鼠乳腺瘤病毒)和D型病毒(例如MasonPfizer猴病毒)。適合用作本發(fā)明反轉錄病毒載體的其他反轉錄病毒包括禽反轉錄病毒(例如勞斯肉瘤病毒)、泡沫病毒(spumaviruses)(例如泡沫病毒)和HTLV-BLV病毒(例如HTLV-1)。慢病毒是反轉錄病毒的一個亞類，它們表達病毒輔助蛋白，并可感染和整合入未分裂細胞以及分裂細胞。源自慢病毒的載體是向耙細胞傳遞外源基因的理想工具，因為它們可穩(wěn)定地整合到分裂細胞和未分裂細胞的基因組并介導長期基因表達((Gilbert等人,5bwa/.CW/Mo/.2(5:83(2001);Mitrophanous等人，7Tz^:6:1808(1999);Naldini等人，Sc/ewce272:263(1996);Sauter等人，Som"f.Ce〃Mo/.26:99(2001))。業(yè)已從許多脊椎動物物種分離出慢病毒，其中包括靈長類例如人和猿猴免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2，SIV)以及非靈長類例如貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、馬感染病毒(EIAV)、山羊關節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)和綿羊髓鞘脫落病毒。HIV和SIV是這些病毒中目前了解最多的病毒。在非靈長類慢病毒載體中，源自FIV(Curran等人，Cwr.7b;.M'cra&o/./mww"o/.2^:75(2002))和EIAV(美國專利2001/0044149)的載體了解最多。反轉錄病毒基因治療領域有兩個主要安全方面受到相當大的關注，不論載體是基于鼠白血病病毒(MLV)還是慢病毒。具體而言它們是指復制型反轉錄病毒的出現(xiàn)和插入誘變的發(fā)生率。通過開發(fā)載體和包裝基因組之間不含重疊病毒序列的最小尺寸反轉錄病毒載體，前一問題已得到明顯的改進。但是后一可能性近來引起了嚴重關注，主要是因為在X-SCID人試驗(Hacein-Bey-Abina等人，Sc/e"ce302:415(2003))中發(fā)現(xiàn)三例白血病患者。前兩例白血病患者的回顧分析揭示白血病可能源于整合到染色體上的反轉錄病毒以及隨后被長末端重復(LTR)活化的LM02基因，該基因緊鄰整合位點。盡管有人認為由于該疾病及其基因的特殊性，這種載體介導的腫瘤發(fā)生可能只限于X-SCID基因治療患者，但現(xiàn)在已清楚反轉錄病毒載體的安全性需要進一步改善，以成為現(xiàn)實世界可行的治療方式。已有幾種降低載體介導的腫瘤發(fā)生幾率的方法。一種方法是除去LTR的U3區(qū)(Yu等人，尸rac.7Vfl"t/W53:3194(1986);Hawley等人.,尸roc.Ato/.爿cad.W:2406(1987);Yee等人，iVoc.^cad5W.C/WW:5197(1987))。反轉錄病毒的LTR由U3、R和U5區(qū)組成，而U3區(qū)含有調(diào)控基因表達的增強子和啟動子序列(Sun等人JWra/.(^:4941(1995);Wahlers等人Mo/.77^.6:313(2002))。因此，除去U3區(qū)可降低載體引發(fā)的插入激活。在該情況下，需向載體提供附加的啟動子以驅動耙基因的表達，因為缺失U3的載體的LTR不再含有啟動子序列。正如前述，U3失活的反轉錄病毒載體需要用于靶基因表達的內(nèi)部啟動子。反轉錄病毒載體最常使用的內(nèi)部啟動子之一是人巨細胞病毒(HCMV)的即時早期(IE)啟動子(Jaalouk等人，Wra/./3:27(2006);來自BDBiosciences的pQCXIN)或相關內(nèi)部啟動子例如CA(HCMVIE增強子/雞P-肌動蛋白啟動子)(Ramezani等人，Mo/.7%"":245(2006))。但是，HCMVIE啟動子己知在人原代細胞中會快速失活，而且對某些基因不起作用(Herweijer等人.，《/Ge"eMW.3:280(2001))。因此，業(yè)已表明常用的啟動子會在某些細胞類型中失活，從而降低異源基因的表達，并可潛在活化LTR驅動的轉錄，所有這些均會降低反轉錄病毒載體的安全性和有效性。最后，由于常用啟動子例如CMV和SV40的啟動子抑制效應，該效應會降低用于包裝的基因組RNA的轉錄，U3失活的反轉錄病毒載體的滴度極低(Jaalouk等人Wra/.J3:27(2006))。事實上，與具有完整U3區(qū)的類似MLV載體相比，基于MLV的缺失U3的載體的滴度低了甚至4個數(shù)量級(Olson等人JFro/.6&7060(1994))。因此，如果能夠找到既可驅動異源基因高水平轉錄又可產(chǎn)生高病毒滴度的啟動子，將是令人驚訝的。因此，需要開發(fā)新的啟動子，以用作反轉錄病毒載體的內(nèi)部啟動子。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含異源內(nèi)部啟動子的表達載體。在一個實施方式中，所述載體包含一包含5'LTR和3'LTR的核苷酸序列。在另一實施方式中，3'LTR或3'LTR和5'LTR兩者的U3區(qū)的增強子元件被缺失。在一個實施方式中，所述載體是質粒載體。在另一實施方式中，所述載體是反轉錄病毒載體，其包含一個或多個增強子缺失型U3區(qū)，其還包含可操作連接到異源基因的內(nèi)部啟動子，使得所述反轉錄病毒載體可產(chǎn)生高病毒滴度和所述異源基因的高水平轉錄。正如在反轉錄病毒載體的
技術領域：
內(nèi)眾所周知，這類載體還包含反轉錄、包裝等所需的順式作用元件。在另一實施方式中，所述載體編碼包含一個或多個增強子缺失型U3區(qū)的反轉錄病毒載體。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述內(nèi)部啟動子是真核、原核或病毒啟動子。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子是哺乳動物細胞基因啟動子。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子選自RPL10啟動子(SEQIDNO:8)、LENG8啟動子(SEQIDNO:9)、SNX3啟動子(SEQIDNO:10)、UQCRQ啟動子(SEQIDNO:17)或ITGB4BP啟動子(SEQIDNO:16)。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子是所述全長啟動子的片段或變體，并可驅動異源基因的高水平轉錄，而包含該啟動子的載體可產(chǎn)生高病毒滴度。在一個實施方式中，包含所述啟動子片段或變體的載體基本保留與包含野生型啟動子的載體相同的能力，即產(chǎn)生高病毒滴度和高水平的轉錄。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子基本由TATA盒組成。在一些實施方式中，所述內(nèi)部啟動子還包含用于高水平基因表達的剪接位點。在另一實施方式中，所述載體是還包括附加序列的反轉錄病毒載體，例如本領域熟知的聚腺苷酸化位點、絕緣子序列、剪接位點、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和其他的轉錄和翻譯效應物序列。在另一實施方式中，所述載體是包含編碼反轉錄病毒載體的DNA的質粒，該反轉錄病毒載體包含一個帶有增強子缺失型U3區(qū)的3'LTR。在另一實施方式中，所述質粒編碼在5'LTR和3'LTR均帶有增強子缺失型U3區(qū)的載體。在另一實施方式中，提供了封裝載體RNA的感染性反轉錄病毒顆粒，其中該載體RNA的兩個LTR均包含增強子缺失型U3區(qū)。在另一實施方式中，所述載體或為RNA形式或為DNA形式，其一個或兩個U3區(qū)的增強子被缺失。在另一實施方式中，所述異源基因編碼目的轉錄物。在另一實施方式中，所述目的轉錄物是具有生物活性的轉錄物，例如但不限于小分子干擾RNA、核酶、反義RNA或誘佴RNA。在另一實施方式中，所述異源基因編碼多肽。所述多肽可為任何所需的蛋白質，例如治療用蛋白質或標記蛋白質。在一個實施方式中，所述異源基因編碼eGFP或gp91。本發(fā)明還提供了包含所述載體和適宜載劑的組合物。所述組合物可適合于體內(nèi)施用。提供了包含本發(fā)明所述載體的細胞，其中包括以所述載體轉化的靶細胞，或包含所需載體和附加序列的生產(chǎn)細胞，其中附加序列編碼生成感染性顆粒所需的因子，例如反轉錄病毒的em;和g"g-po/以及其他所需因子。所述靶細胞和生產(chǎn)細胞可為任何適宜的真核細胞類型，例如哺乳動物細胞。在另一實施方式中，所述細胞可源自人、靈長類或鼠類。所述細胞可為原代細胞或細胞系。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生感染性反轉錄病毒顆粒的方法，其包括培養(yǎng)含有上述反轉錄病毒載體或編碼所述反轉錄病毒載體的質粒的生產(chǎn)細胞，收集上清，過濾培養(yǎng)基以得到不含細胞的病毒上清。用于構建生產(chǎn)細胞系的包裝細胞系可為本領域目前已知的任何細胞系，或可為經(jīng)轉移編碼必需病毒蛋白質的基因至細胞系而得到的細胞系，使得包含包裝信號的反轉錄病毒載體一旦在細胞內(nèi)轉錄，所述反轉錄病毒載體即被包裝到感染性顆粒內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種轉導靶細胞的方法，其包括以上述制備的包含依據(jù)本發(fā)明的感染性反轉錄病毒顆粒的病毒上清接觸所述細胞。正如上述，所述靶細胞可為但不限于為哺乳動物細胞、人細胞、靈長類細胞或鼠類細胞。所述靶細胞可為原代細胞或細胞系。本發(fā)明還提供了一種治療對象的方法，其包括施用包含本發(fā)明所述載體和適宜載劑的組合物，其中所述異源基因編碼可用于治療的多肽或轉錄物。在另一實施方式中，所述方法用于治療遺傳疾病、增殖疾病或感染性疾病。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述多核苷酸和載體的試劑盒。附圖簡述圖1是增強子缺失型U3反轉錄病毒載體pMT和pI-D的示意圖。圖2是增強子缺失型U3反轉錄病毒載體pI-ND的示意圖。圖3是增強子缺失型U3反轉錄病毒載體pI-LND-n的示意圖。圖4顯示了包含所示啟動子的增強子缺失型U3反轉錄病毒載體的異源基因(gp91)表達水平。對照為MT-gp91-n載體。圖5顯示了用于GAPDH的啟動子序列(SEQIDNO:7)。圖6顯示了用于RPL10的啟動子序列(SEQIDNO:8)。圖7顯示了用于LENG8的啟動子序列(SEQIDNO:9)。圖8顯示了用于SNX3的啟動子序列(SEQIDNO:IO)。圖9顯示了用于ITGB4BP的啟動子序列(SEQIDNO:16)。圖10顯示了用于UQCRQ的啟動子序列(SEQIDNO:17)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含異源內(nèi)部啟動子的表達載體。在一個實施方式中，所述載體是在一個或兩個LTR包含增強子缺失型U3區(qū)的反轉錄病毒載體，該載體具有可操作連接到異源基因的異源啟動子，該反轉錄病毒載體可高水平轉錄異源基因和產(chǎn)生高病毒滴度。在另一實施方式中，所述載體編碼在一個或兩個LTR包含增強子缺失型U3區(qū)的反轉錄病毒載體。載體正如本文使用，術語"反轉錄病毒"系指在其復制周期內(nèi)利用反轉錄酶的RNA病毒。反轉錄病毒的基因組RNA被反轉錄酶轉化為雙鏈DNA。這種雙鏈DNA形式的病毒可被整合到受感染細胞的染色體上；一旦整合，該病毒被成為"原病毒"。所述原病毒作為RNA聚合酶II的模板，指導RNA分子的表達，這些RNA分子編碼結構蛋白質和產(chǎn)生新病毒顆粒所需的酶。正如本文使用，術語"載體"系指任何遺傳學元件，例如質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體、反轉錄病毒、病毒體等，它們與適宜的調(diào)控元件結合時可進行復制，還可在細胞間轉移基因序列。因此，該術語包括克隆和表達載體以及RNA或DNA形式的病毒載體?？墒褂帽绢I域知曉的許多載體來操縱核酸和將應答元件和啟動子整合到基因內(nèi)等?？赡艿妮d體包括例如質?；蛐揎棽《?，其中包括噬菌體如入衍生物或質粒如pBR322或pUC質粒衍生物，或Bluescript載體。病毒載體特別是反轉錄病毒載體己被用于細胞以及活實驗動物的許多類型的基因傳遞場合。可使用的病毒載體包括但不限于反轉錄病毒、腺相關病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純性皰疹病毒、EB病毒、腺病毒、雙生病毒和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質粒、脂質體、荷電脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質復合物和生物聚合體。真核生物載體的實例包括但不限于來自Stratagene的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG;來自AmershamPharmaciaBiotech的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL;和來自Clontech的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito和pCMV-EGFP。許多其他載體是眾所周知的，可從市面購得?？蓪⑦m宜的DNA片段連接到具有互補粘性末端的選定的載體上，從而將對應于應答元件和啟動子的DNA片段插入到適宜的載體上?；蛘撸墒褂妹感揎桪NA分子的末端，或將核苷酸序列(連接體)連接到DNA末端上產(chǎn)生任意位點。這類載體可經(jīng)改造含有選擇性標記基因，以選擇己將標記基因整合到細胞基因組上的細胞。這類標記基因允許鑒定和/或選擇摻入和表達所述標記基因編碼的蛋白質的宿主細胞。正如前述，本發(fā)明所述的反轉錄病毒載體或由本發(fā)明載體編碼的所述反轉錄病毒載體可基于簡單的反轉錄病毒，例如MLV、慢病毒如fflV、或任何其他反轉錄病毒。這些載體保留了生成感染性顆粒所需的順式元件。這類元件包括緊鄰反轉錄病毒基因組5'LTR的包裝信號，病毒RNA進入病毒殼體或顆粒的衣殼化過程需要該包裝信號。幾種反轉錄病毒載體使用病毒基因組包殼所需的最短包裝信號(也被稱為psi[V)/]序列)。附加的順式元件為本領域熟知，例如引物結合位點、聚嘌呤區(qū)和其他序列，它們被納入在所述反轉錄病毒載體上。但是，從載體上除去了編碼病毒蛋白質的序列，以使沒有全長的病毒蛋白質得到表達。通過包裝構建體反式提供了生成感染性顆粒所需的任何病毒蛋白質。所述載體還可包含序列如多腺苷酸化序列、絕緣子序列、剪接位點、IRES和其他轉錄和翻譯效應物序列。本文使用的術語"聚腺苷酸化位點"、"polyA位點"或"polyA序列"系指一段指導新生RNA轉錄物終止和多聚腺苷酸化的DNA序列。重組轉錄物的有效多聚腺苷酸化作用是理想的，因為缺乏polyA尾的轉錄物不穩(wěn)定，很快便會被降解。本載體使用的polyA信號可為"異源的"或"內(nèi)源的"。內(nèi)源polyA信號是天然存在于基因組中某個基因編碼區(qū)域3'末端的polyA信號。異源polyA信號是分離自一個基因并置于另一基因3'端的polyA信號。通常使用的異源polyA信號為SV40polyA信號。所述SV40polyA信號被包含在一段237bp的BamHI/BcII限制酶切片段上，可同時指導終止和多聚腺苷酸化。本發(fā)明的適宜多聚腺苷酸化序列還包括但不限于牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸化信號、p-球蛋白polyA位點和單純性皰疹病毒的胸苷激酶的polyA《立點(Sambrook等人"A/b/ecM/arC7om'打gv」丄a60ra/07Afo"w"/,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,pp.16.7-16.8(1989))。本發(fā)明所述載體還可含有附加的核酸序列，例如內(nèi)含子序列、剪接序列、定位序列或信號序列，以足以使細胞有效加工所述載體核酸表達的蛋白質。內(nèi)含子序列的實例包括p-球蛋白內(nèi)含子和人EF-loc內(nèi)含子(美國專利7,049,143)。剪接信號介導從原始RNA轉錄物上除去內(nèi)含子，其由一個剪接供體位點和一個剪接受體位點組成(Sambrook等人，A/o/ecw/wC/ow/rtg:^丄a6onato;^Afawwa/,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,pp.16.7-16.8(1989》。正如本文使用，術語"內(nèi)部核糖體進入位點"或"IRES"系指一段位于多個多順反子基因之間的序列，其可通過雙順反子mRNA翻譯的內(nèi)部起始允許生成源自第二基因的表達產(chǎn)物。內(nèi)部核糖體進入位點的實例包括但不限于源自口蹄疫病毒(FDV)、腦心肌炎病毒、脊髓灰質炎病毒和RDV的內(nèi)部等人，所oc/ze肌76:801(1994);Meyer等人，R>o/.69:2819(1995);Jang等人，/PW62:2636(1998);Haller等人/FW.66:5075(1995))。正如本領域所知，可組裝摻有IRES的載體。例如，含有多順反子序列的載體可含有下列可操作連接的元件內(nèi)部啟動子、異源基因、內(nèi)部核糖體進入位點和第二異源基因。這類附加序列被插入到所述載體上，這樣若需轉錄時，它們與啟動子序列可操作地連接在一起，或若需翻譯和加工時，它們可另外再與啟動和加工序列可操作地連接在一起?；蛘?，可將插入序列置于載體上的任何位置。用于構建本發(fā)明所述載體的標準技術為本領域普通技術人員所熟知，可見于參考文獻如Sambrook等人，Afo/ecw/arC7o"z'wg:^丄"60rato7^Ma"w"/，2nded,,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,(1989)。可使用許多策略連接DNA片段，其選擇取決于DNA片段末端的性質，本領域技術人員可容易地作出這類選擇。還預見了包含本發(fā)明所述表達載體和適宜載劑的組合物。這類載劑為本領域熟知，其系指施用治療藥物時使用的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。這類適宜的載劑可為無菌液體，例如水和油，其中包括石油、動物、植物和合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水是靜脈內(nèi)施用組合物時的優(yōu)選載劑。鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液體載劑，尤其是對于可注射溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如需要，所述組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液劑、懸浮劑、乳化劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋劑等形式。所述組合物可配制為栓劑，其中加入傳統(tǒng)的粘合劑和載劑如甘油三酸酯。口服制劑可包括標準的載劑例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。E.W.Martin在"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述了適宜載劑的實例。這類組合物應含有有效治療量的本發(fā)明所述反轉錄病毒載體以及適宜量的載劑，以提供適宜施用于患者的形式。所述制劑應符合給藥方式的要求。U3區(qū)正如上文討論，所述反轉錄病毒基因組在其基因組的5'末端和3'末端包含長末端重復(LTR)，其含有反轉錄病毒生命周期期間復制所需的重要序列。U3區(qū)的啟動子和增強子元件對于反轉錄病毒基因組在復制期間生成全長轉錄物是重要的。在反轉錄期間，3'LTR的一部分作為3'LTR以及5'LTR的模板，因此3'LTR的序列被復制到5'LTR中。因此，U3區(qū)的缺失或突變被復制到5'LTR，使得兩個U3區(qū)基本失活。3'LTR的這種復制允許載體序列在包裝期間含有未改變的5'U3區(qū)，以允許從待生成和包裝的5'LTR生成全長轉錄物。但是，在復制期間，由于包含增強子缺失型U3區(qū)的3'U3區(qū)被復制到5'LTR中，5'U3被丟失。這樣生成了包裝用的全長轉錄物，但由于一輪復制后兩個LTR的轉錄均被沉默，所述載體發(fā)生自身失活?；蛘?，兩個LTR的U3區(qū)均可以是增強子缺失型的，可使用異源啟動子生成全長基因組轉錄物。本文使用的"增強子缺失型"系指這樣的U3區(qū)，其中通過在增強子內(nèi)部和/或周圍進行缺失、添加和/置換使得U3區(qū)內(nèi)的增強子整個或部分被改變，以使所述增強子基本失活。當增強子的改變足以基本消除U3驅動的轉錄物時，則認為增強子基本失活。在一個實施方式中，與內(nèi)部啟動子驅動的基因表達相比，不到P/。的全部反轉錄病毒轉錄物受LTR的U3區(qū)驅動。在一個實施方式中，不到0.P/。的全部轉錄物受LTR的U3區(qū)驅動。在另一實施方式中，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的U3驅動的轉錄物。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過缺失U3區(qū)的部分或全部增強子和啟動子，增強子缺失型U3區(qū)基本失活。在另一實施方式中，通過在U3區(qū)置換或插入核苷酸，所述U3區(qū)基本失活。在又一實施方式中，整個U3區(qū)被缺失。適合用于本發(fā)明的已知反轉錄病毒載體以及野生型反轉錄病毒載體的U3區(qū)為本領域熟知，并可容易地辨識出來(Coffin，JM,F柳Jamewto/Fi>o/og>;,pp.798-800，F(xiàn)ields等人.eds"3rdEd"Lippincott-RavenPubl.(1996》。內(nèi)部啟動子本發(fā)明提供了啟動子，其在增強子缺失型U3反轉錄病毒載體環(huán)境下可產(chǎn)生高病毒滴度和高水平的基因表達。在一個實施方式中，所述內(nèi)部啟子對載體而言是異源的，即不存在于自然界發(fā)現(xiàn)的載體上。測試了各種啟動子，其中包括HCMVIE啟動子(SEQIDNO:l)、MLVU3區(qū)(SEQIDNO:2)、CMV增強子/泛素啟動子(SEQIDNO:3)、巨細胞病毒增強子/雞|3-肌動蛋白(CAG)啟動子(SEQIDNO:4)、人延伸因子la(EF-la)啟動子(SEQIDNO:5)、人p-肌動蛋白(ACTB)啟動子(SEQIDNO:6)、人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子(SEQIDNO:7)、人核糖體蛋白L10(RPL10)啟動子(SEQIDNO:8)、人白細胞受體簇成員8(LENG8)啟動子(SEQIDNO:9)、人分選連接蛋白3(SNX3)啟動子(SEQIDNO:10)、人CCR4-NOT轉錄復合物，亞基3(CNOT3)啟動子(SEQIDNO:ll)、humancopineI(CPNE1)啟動子(SEQIDNO:12)、人假設蛋白(HYPO)啟動子(SEQIDNO:13)、人先天性角化不良1，角化不良蛋白(DKCl)啟動子(SEQIDNO:14)、人囊泡蛋白分選72(VPS72)啟動子(SEQIDNO:15)、整聯(lián)蛋白卩-4結合蛋白(ITGB4BP)啟動子(SEQIDNO:16)和泛醇-細胞色素c還原酶，復合物III亞基VII(UQCRQ)啟動子(SEQIDNO:17)。發(fā)現(xiàn)UQCRQ、SNX3、ITGB4BP、GAPDH、RPL10和LENG8啟動子可產(chǎn)生高病毒滴度和高水平的基因表達。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的細胞啟動子可驅動增強子缺失型U3反轉錄病毒載體的基因表達。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述內(nèi)部啟動子可為上面列出的啟動子的片段或變體，其可產(chǎn)生高病毒滴度和高水平基因表達。正如本文使用，"啟動子的片段"系指一段包含與天然全長啟動子相同但短于天然全長啟動子的多核苷酸。在一個實施方式中，所述片段具有全長啟動子至少約20%(例如約30、40、50、60、70、80、85、90或95%)的轉錄活性?？墒褂玫钠伟ǖ幌抻赗PL10啟動子的片段，其包含約-50至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約951至1143位核苷酸)、約-100至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約卯l至1143位核苷酸)、約-200至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約801至1143位核苷酸)、約-350至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約651至1143位核苷酸)、約-500至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約501至1143位核苷酸)、約-1000至約+143的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約1至1143位核苷酸)或約-350至約+1的核苷酸序列(SEQIDNO:8的約651至1001位核苷酸)或由上述核苷酸序列組成；以及LENG8啟動子的片段，其包含約_50至約+305的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約970至1325位核苷酸)、約-100至約+305的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約920至1325位核苷酸)、約-200至約+305的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約820至1325位核苷酸)、約-385至約+305的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約635至1325位核苷酸)、約-1020至約+305的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約1至1325位核苷酸)或約-385至+1的核苷酸序列(SEQIDNO:9的約635至1020位核苷酸)(其中每個啟動子的轉錄起始位點被認為是+l)。正如本文使用，"啟動子的變體"系指一段多核苷酸，其包含與天然啟動子序列至少約70%(例如至少約80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)相同的序列，并具有天然啟動子至少20%(例如約30、40、50、60、70、80、85、90或95%)的轉錄活性。啟動子的變體也可是該啟動子的片段。本文使用的"高病毒滴度"意指增強子缺失型U3反轉錄病毒載體與在兩個LTR上均具有功能性的未改變的U3區(qū)的相同載體相比產(chǎn)生至少10%的含有所述載體的感染性反轉錄病毒顆粒。在其他實施方式中，與U3功能性載體相比，增強子缺失型U3載體的滴度至少為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%或更多?？梢詭追N方式進行這類滴度的比較，例如通過報道基因如GFP或熒光素酶在轉導細胞內(nèi)的表達，采用載體表達的選擇性標記物選擇轉導細胞，或通過載體表達治療基因。用于測量病毒滴度的許多這類方法為本領域所熟知。"高水平異源基因轉錄"或"高水平基因表達"包括異源基因的轉錄或表達至少占反轉錄病毒載體產(chǎn)生的總轉錄物的70%(例如至少80、90、95、96、97、98或99%)，以及異源基因的轉錄或表達至少是相同載體上相同基因的10%的轉錄或表達，其中該相同載體在兩個LTR均具有功能性的未改變的U3區(qū)。在其他實施方式中，與U3功能性載體上的相同基因相比，增強子缺失型U3載體上的異源基因的轉錄或表達至少為20。/。、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180°/。、190%、200%或更多?？赏ㄟ^例如測量報道基因的表達或通過分析異源轉錄物或蛋白質的量進行這類比較，其中該分析是通過例如標準分子生物學技術如RNA印跡分析、RTPCR、蛋白質印跡分析、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進行的。本發(fā)明的啟動子可包含源自真核生物、原核生物或病毒的啟動子，其足以指導位于遠側的序列(與啟動子序列3'末端連接的序列)在細胞內(nèi)的轉錄。所述內(nèi)部啟動子應驅動與其可操作連接的異源基因的高水平轉錄，同時還允許通過在生產(chǎn)細胞系內(nèi)生成和包裝基因組RNA實現(xiàn)高病毒滴度。所述啟動子還可包括增強子元件。啟動子和增強子由短排列的DNA序列組成，它們與參與轉錄的細胞蛋白質發(fā)生特異相互作用(Maniatis等人5We"ceW6:1237(1987))。已從酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等各種真核生物來源和病毒(原核生物也發(fā)現(xiàn)有類似調(diào)控元件)分離得到啟動子和增強子元件。特定啟動子和增強子的選擇取決于用于表達目的蛋白的細胞類型。啟動子、增強子和其他調(diào)控元件可為組織特異性的或細胞特異性的。應用于調(diào)控元件的術語"組織特異性"系指可指導異源基因在特定類型的組織(如肝臟)內(nèi)選擇性表達的調(diào)控元件，其中異源基因在該特定類型組織中的表達大于相同目的核苷酸序列在不同類型組織(如肺)中的表達。正如本文使用，"組織特異性"(例如肝臟特異性)是不需要絕對表達特異性的相對術語。換而言之，術語"組織特異性"不需要一種組織有極高水平的表達而另一組織沒有表達。一種組織的表達大于另一種組織即可。相反，"嚴格"或"絕對"的組織特異性表達意指在單一組織類型(如肝臟)內(nèi)的表達，而其他組織沒有可檢測的表達。同樣，應用于調(diào)控元件的術語"細胞類型特異性"系指可指導目的核苷酸序列在特異類型的細胞中選擇性表達的調(diào)控元件，其中目的核苷酸序列在該特異類型細胞中的表達大于相同目的核苷酸序列在相同組織內(nèi)不同類型細胞(例如過度增殖細胞如癌細胞)中的表達。應用于調(diào)控元件的術語"細胞類型特異性"還意指可促進目的核苷酸序列在單一組織的某個區(qū)域選擇性表達的調(diào)控元件。盡管本發(fā)明設想了可產(chǎn)生高水平轉錄以及允許高病毒滴度的任何內(nèi)部啟動子，在一個實施方式中，所述內(nèi)部啟動子是細胞啟動子。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子選自RPL10啟動子(SEQIDNO:8)、LENG8啟動子(SEQIDNO:9)、SNX3啟動子(SEQIDNO:IO)、UQCRQ啟動子(SEQIDNO:17)或ITGB4BP啟動子(SEQIDNO:16)。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子是全長啟動子的變體，可驅動異源基因的高水平轉錄，而包含該啟動子的載體可產(chǎn)生高病毒滴度。在另一實施方式中，所述內(nèi)部啟動子基本由TATA盒組成。在一些實施方式中，所述內(nèi)部啟動子還包含一個或多個用于高水平基因表達的剪接位點。為了降低內(nèi)部啟動子引起的插入激活的概率，可使用絕緣子序列阻斷內(nèi)部啟動子對鄰近基因的活化效應(Ramezani等人，iWo/.77er/4:245(2006))。另一種方法是通過插入附加的多聚腺苷酸化信號來修飾載體，以抑制內(nèi)部啟動子的通讀(Ramezani等人，Mo/,777er":245(2006))。異源基因術語"可操作連接"用于描述基因序列與啟動子或其他調(diào)控或加工序列的連接，該連接使得該基因序列的轉錄受可操作連接的啟動子序列的指導。術語"基因"系指包含產(chǎn)生多肽或轉錄物所必需的調(diào)控和編碼序列的DNA序列。該術語還包括結構基因的編碼區(qū)域，并包括距離編碼區(qū)域5'末端和3'末端各端約1kb或以上的鄰近序列，使得該基因對應于全長mRNA的長度。位于所述編碼區(qū)域5'末端并出現(xiàn)在mRNA上的所述序列被稱為5'末端未翻譯序列。位于所述編碼區(qū)域3'末端或下游并出現(xiàn)在mRNA上的所述序列被稱為3'末端未翻譯序列。術語"基因"同時包括基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有被名為"內(nèi)含子"或"干擾區(qū)域"或"干擾序列"的非編碼序列中斷的編碼區(qū)域。內(nèi)含子是被轉錄到核RNA(hnRNA)上的基因片段；內(nèi)含子可含有調(diào)控元件如增強子。內(nèi)含子從核轉錄物或初始轉錄物上被除去或"剪切掉"，因此信使RNA(mRNA)轉錄物不含內(nèi)含子。mRNA在翻譯期間起著確定新生多肽的氨基酸序列或次序的功能。本文可互換使用的術語"多核苷酸"或"核酸分子"系指任意長度例如兩個或多個的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核苷酸類似物(包括修飾的磷酸鹽部分、堿基或糖)、或可被適宜酶如DNA聚合酶或RNA聚合酶摻入到聚合物中的任何底物。正如會被本領域技術人員所理解，插入的目的多核苷酸的核苷酸序列可為任意的核苷酸序列。例如，多核苷酸序列可為報道基因序列或選擇性標記基因序列。正如本文使用，報道基因序列是表達時可產(chǎn)生其存在或活性可被監(jiān)測的蛋白質的任意基因序列。報道基因的實例包括但不限于熒光素酶(例如參見deWet等人，Mo/.CW/.說'o/.7:725(1987)和美國專利6,074,859、5,976,796、5,674,713、和5'618，682;所有這些通過引用并入本文)、綠色熒光蛋白(例如GenBank收錄號U43284;可從CLONTECHLaboratories,PaloAlto，Calif購買得到的許多GFP變體)、氯霉素乙酰轉移酶、卩-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶?；蛘?，所述報道基因序列可為表達產(chǎn)生影響細胞生理的基因產(chǎn)物的任意基因序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可包括一個或多個己具有一個或多個啟動子、起始序列或加工序列的基因序列。報道基因序列可為選擇性標記物，它是可表達蛋白質的任意基因序列，其中該蛋白質的存在允許選擇性增殖含有該蛋白質的細胞。選擇性標記物可為"顯性的"，顯性選擇性標記物編碼可在任何真核細胞系檢測到的酶活性。顯性選擇性標記物的實例包括但不限于賦予哺乳動物細胞抗藥物G418抗性的細菌氨基葡糖苷3'磷酸轉移酶基因(也被稱為neo基因)、賦予抗潮霉素抗性的細菌潮霉素G磷酸轉移酶(hyg)基因和賦予在霉酚酸存在下生長的能力的細菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(也被稱為gpt基因)。其他選擇性標記物不是顯性的，因為它們必須與缺乏相關酶活性的細胞系聯(lián)用。非顯性選擇性標記物的實例包括與tk—細胞系聯(lián)用的胸苷激酶(tk)基因、與CAD缺陷型細胞聯(lián)用的CAD基因和與hprt'細胞系聯(lián)用的哺乳動物次黃嘌呤鳥嘌呤.磷酸核糖轉移酶(hprt)基因。Sambrook,J等人在Mo/ecw/arC/o"/"g:^丄a6orato^yMawwfl/,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYorkpp.16.9-16.15(1989)中提供了用于哺乳動物細胞系的選擇性標記物的綜述。報道基因序列足以允許識別或選擇正常細胞內(nèi)的載體。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述報道基因可編碼哺乳動物細胞通常缺乏的酶或其他蛋白質，因此它們的存在可最終確定載體在該細胞中的存在。本發(fā)明所述的反轉錄病毒載體用于將異源基因摻入病毒顆粒，從而提供了一種擴增含有異源核酸的受感染宿主細胞數(shù)目的方法。異源基因的摻入促進了該異源基因在病毒顆粒內(nèi)的復制以及病毒顆粒內(nèi)異源轉錄物或蛋白質的隨后生成。如果一個基因沒有天然存在于用于遞送該基因至細胞的野生型載體上，即被稱為異源的。正如本文使用，術語"異源基因"意指核酸分子。所述異源基因還可包括所需產(chǎn)物的編碼序列，例如適宜的生物活性蛋白質或多肽、免疫原性或抗原性蛋白質或多肽、或有治療活性的蛋白質或多肽。所述多肽可補充宿主細胞內(nèi)源蛋白質的缺陷表達或不表達。這類基因序列可源自許多來源，其中包括DNA、cDNA、合成DNA、RNA或它們的組合。這類基因序列可包括基因組DNA，其可包括或可不包括天然存在的內(nèi)含子。而且，可獲得與啟動子序列或多聚腺苷酸化序列結合的這類基因組DNA。本發(fā)明所述的基因序列優(yōu)選為cDNA。基因組DNA或cDNA可以任意數(shù)目的方式獲得?；蚪MDNA可通過本領域熟知的方法從適宜細胞提取和純化。或者，mRNA可從細胞分離并以反轉錄或其他方法制備為cDNA?；蛘撸龆嗪塑账嵝蛄锌砂cRNA序列互補的序列，例如反義RNA序列，該反義序列可施用給個體以抑制互補多核苷酸在該個體細胞內(nèi)的表達。所述異源基因的表達可提供免疫原性或抗原性蛋白質或多肽，以實現(xiàn)抗體應答?？蓮膭游矬w液如血液、血清或腹水收集如此產(chǎn)生的抗體。所述異源基因還可為可轉錄的任何目的核酸。外源基因一般編碼多肽。優(yōu)選情況下所述多肽具有一些治療益處。所述多肽可補充宿主細胞內(nèi)源蛋白質的缺陷表達或不表達。所述多肽可賦予宿主細胞新的屬性，例如嵌合信號轉導受體，參見美國專利5,359,046。普通技術人員根據(jù)本文教導和本領域知曉的技術可確定異源基因的適宜性。例如，該技術人員會知道異源基因是否具有用于包殼的適宜大小以及該拜源基因產(chǎn)物是否得到合適地表達?？捎糜诒景l(fā)明的特定異源基因不是本發(fā)明的關鍵之處。但是，在一個實施方式中，所述異源基因編碼細胞因子、趨化因子、激素、抗體、遺傳工程化的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、核酶、RNA外部指導序列、靶蛋白的反式顯性負性突變體、毒素、條件性毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白或它們的變體。在又一實施方式中，所述異源基因可編碼多肽，其包括但并不限于免疫球蛋白、促紅細胞生成素、a-干擾素、(x-l蛋白酶抑制劑、血管生成素、抗凝血酶III、p-酸脫羧酶、人生長激素、牛生長激素、豬生長激素、人血清白蛋白、P-干擾素、小牛腸堿性磷酸酶、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白、因子VIII、因子IX、因子X、胰島素，乳鐵蛋白、組織纖溶酶原激活物、髓鞘堿性蛋白、胰島素、胰島素原、促乳素、乙型肝炎抗原，免疫球蛋白片段(例如FABs)、單克隆抗體CTLA4Ig、Tag72單克隆抗體、Tag72單鏈抗原結合蛋白、蛋白C、細胞因子及其受體例如腫瘤壞死因子cx和P、其受體及其衍生物；腎素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；促卵泡激素；降鈣素；黃體化激素；胰高血糖素；血管性血友病因子；心房利鈉因子；肺表面活性物質；尿激酶；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腦啡肽酶；人巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-l-a),血清白蛋白如苗勒管抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；P-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子受體；整合蛋白；蛋白A或D;類風濕因子;神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4和NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長因子，如NGF-p;血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉化生長因子(TGF)如TGF-a和TGF-P，其中包括TGF-pi、TGF-p2、TGF-P3、TGF-p4或TGF-(35;胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II);des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19;骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP);干擾素如a-、P-和Y-干擾素；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白細胞介素(IL)，例如IL-1到IL-12;超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜蛋白的一部分；運輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；嵌合蛋白例如免疫粘合素，以及任何上述所列多肽的片段或融合物。在又一實施方式中，所述異源基因編碼氧化酶，特別是NAPDH氧化酶，例如NADPH氧化酶的gp91亞基。這些蛋白的核酸和蛋白序列可從公共數(shù)據(jù)庫例如GenBank獲得。當特定蛋白具有多于一個的亞基時(例如免疫球蛋白)，編碼該序列的基因可在載體上排列成多順反子序列，以一個或多個IRES元件隔開?；蛘?，編碼蛋白不同亞基的基因可在不同的載體上引入宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明，編碼目的蛋白的所述基因優(yōu)選包含一個或多個內(nèi)含子。內(nèi)含子可為正常情況下與該基因連接的內(nèi)含子，或可為合成或外源內(nèi)含子。在一些實施方式中，所述基因可包含少于其正常數(shù)目的內(nèi)含子。例如，可除去該基因上一些天然存在的內(nèi)含子，同時保留其他內(nèi)含子，或一個或多個天然存在的內(nèi)含子可被一個或多個外源內(nèi)含子取代。所謂"野生型"或天然的，意指核苷酸或氨基酸序列與天然存在的序列相同。所謂"變體"意指包括基本類似的序列。因此，對于核苷酸序列或氨基酸序列，變體包括功能等同的序列，例如保留至少20%(例如30、40、50、60、70、80或90%)野生型序列的一種或多種活性。變體核苷酸序列還包括通過例如定向誘變生成的但仍保留天然序列功能的合成核苷酸序列。一般而言，本發(fā)明的核苷酸序列變體或氨基酸序列變體具有與其各自天然核苷酸序列至少70%，一般為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性。技術人員會理解公開的核酸構建體的許多保守變動會得到功能相同的構建體。特定核酸序列的保守變動系指編碼與基本相同的序列相同或基本相同的氨基酸序列的這些核酸，或所述核酸不編碼氨基酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任意給定的多肽。例如，由于遺傳密碼的簡并性，"沉默置換"(例如不會引起所編碼多肽變化的核酸序列的置換)是編碼氨基酸的每個核酸序列的隱含特點。同樣，"保守氨基酸置換"，即以性質高度類似的不同氨基酸取代包裝構建體或可包裝構建體的氨基酸序列的一個或幾個氨基酸，也被容易地鑒定為高度類似于公開的構建體。例如，密碼子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都編碼精氨酸。因此，在密碼子所指定的每處精氨酸位置，該密碼子可被變動為任何描述的對應密碼子，而不改變編碼的多肽。這類核酸變動是"沉默變動"，是"保守修飾變動"的一類。本文每個編碼多肽的核酸序列還描述了每種可能的沉默變動。技術人員會認識到可經(jīng)標準技術修飾核酸的每個密碼子(AUG除外，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)以生成功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個"沉默變動"暗含在任何描述的序列中。而且，技術人員會認識到通過變更、添加或缺失編碼序列的單個氨基酸或少量的氨基酸(典型情況下小于5%，更典型情況下小于1%)而作出的個別置換、缺失或添加是"保守修飾變動"，其中這些變更導致氨基酸被化學性質類似的氨基酸置換。提供功能類似的氨基酸的保守置換表為本
技術領域：
熟知。下列6組每組含有互為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另外參見Creighton(1984)ProteinsW.H.FreemanandCompany。最后，添加不改變核酸分子活性的序列如非功能性序列是該基本核酸的保守修飾。每個公開序列的這類保守性置換變動是本發(fā)明的一個特點。就用于本發(fā)明載體體系的各種全長或成熟多肽的氨基酸序列而言，變體包括源自天然多肽的這些多肽，其中通過在天然多肽的N末端和/或C末端缺失(即所謂的截短)或添加一個或多個氨基酸、在天然多肽上的一個或多個位點處缺失或添加一個或多個氨基酸、或在天然多肽的一個或多個位點處置換一個或多個氨基酸從天然多肽衍生得到這些多肽。這類變體可源自例如遺傳多態(tài)性或人工操作。用于這類操作的方法一般為本領域知曉。技術人員會識別出在給定核酸構建體上產(chǎn)生變更的許多方式。這類熟知的方法包括定向誘變、采用簡并寡核苷酸進行的PCR擴增、將含有所述核酸的細胞暴露于誘變劑或輻射、所需寡核苷酸的化學合成(例如聯(lián)用連接和/或克隆以生成大核酸)和其他熟知的技術。天然核苷酸序列或天然多肽的變體與天然序列或天然多肽基本相同。變體的不同之處可少至1到10個氨基酸殘基，例如6-10、少至5、少至4、3、2或甚至1個氨基酸殘基。核苷酸序列的變體的不同之處可少至1到30個核苷酸，例如6到20、少至5、少至4、3、2或甚至1個核苷酸殘基。所謂"序列相同性"意指當變體的核苷酸序列或氨基酸序列的一段指定的連續(xù)片段與參照序列的核苷酸序列或氨基酸序列進行比對和比較時，發(fā)現(xiàn)變體序列與參照序列有相同的核苷酸或氨基酸殘基。用于序列比對的方法和用于測定序列間相同性的方法為本領域熟知。就兩個核苷酸序列的最佳比對而言，與參照核苷酸序列相比，變體核苷酸序列的連續(xù)片段可具有附加的核苷酸或缺失的核苷酸。同樣，就兩個氨基酸序列的最佳比對的目的而言，與參照氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的連續(xù)片段可具有附加的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。用于與參照核苷酸序列或與參照氨基酸序列比較的連續(xù)片段應包括至少20個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基，并可為30、40、50、100或更多的核苷酸或氨基酸殘基。可通過指定空位罰分來校正變體核苷酸序列或氨基酸序列因含有空位而增加的序列相同性。細胞還包括了包含本發(fā)明所述表達載體的細胞。在一個實施方式中，還包括了包含增強子缺失型U3反轉錄病毒載體的細胞。以本發(fā)明所述表達載體轉導的靶細胞可為不論位于體外還是體內(nèi)均可被轉導的任何真核細胞類型，其中包括哺乳動物細胞、禽細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、魚細胞和昆蟲細胞。在一個實施方式中，所述靶細胞是哺乳動物細胞，特別是人細胞。所述靶細胞可為原代細胞或細胞系。在一個實施方式中，本發(fā)明包括生產(chǎn)細胞系，其還包含產(chǎn)生含本發(fā)明載體的感染性反轉錄病毒顆粒必需的反式病毒蛋白。這類生產(chǎn)細胞系產(chǎn)生反轉錄病毒的殼體，并轉錄反轉錄病毒載體，隨后通過包裝信號將該反轉錄病毒載體募集到病毒殼體。構建生產(chǎn)細胞系所需的包裝細胞系為本領域所知曉，一般包含反轉錄病毒的gag-;o/和e"v基因，這些基因提供了感染性反轉錄病毒顆粒所需的酶(例如反轉錄酶)和結構蛋白(例如Gag和Erw)。已知許多這類包裝細胞，例如PG13、vCRIP、PA317、GP+erwAm12、FLYA13、FLYRD18、Phoenix-Ampho、Phoenix畫Eco、Phoenix-GALV、PE501、GP+E86、PT67、BING、BOSC23、ProPak-A和其他包裝細胞以及慢病毒包裝細胞系(Logan等人,JF"/ra/.7&8421-8436(2004))。而且，包裝細胞系可被瞬時轉染以供短期使用，或具有整合到其基因組上的病毒基因以供長期使用。許多包裝細胞系采用反轉錄病毒的天然包膜蛋白，所述反轉錄病毒載體即基于反轉錄病毒。還有可能通過使用來自另一密切相關病毒的包膜蛋白基因改變本發(fā)明所述病毒載體可感染的細胞宿主范圍。換而言之，通過利用某些病毒包膜蛋白可參與其他病毒包殼的能力，有可能擴大本發(fā)明所述反轉錄病毒載體的宿主范圍。源自反轉錄病毒的基因的實例包括但不限于水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓內(nèi)源病毒RD114、勞斯肉瘤病毒(RSV)、雙嗜性莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、親嗜性莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、10A1鼠白血病病毒、莫洛尼貂致細胞灶病毒(MCFV)、Musdunni內(nèi)生性病毒(MDEV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和人免疫缺陷病毒(fflV)。所有這些病毒包膜蛋白有效地形成具有其他病毒基因組和基質組分的假型病毒體。正如本文使用，術語"假型"系指含有一種病毒的核酸和另一種病毒包膜蛋白的病毒顆粒。一般而言，VSV-G或GaLV假型載體具有很寬的宿主范圍，可通過超速離心沉淀成高濃度的滴度，同時仍保留高水平的感染性。本發(fā)明的方法
技術領域：
：本發(fā)明還提供了產(chǎn)生包含本發(fā)明所述反轉錄病毒載體的感染性反轉錄病毒顆粒的方法，其包括培養(yǎng)上述的生產(chǎn)細胞系、收集細胞培養(yǎng)的上清以及過濾上清以獲得不含細胞的病毒上清。本領域技術人員應可容易地優(yōu)化獲得良好病毒滴度的條件，例如使用適宜的培養(yǎng)基，確定最佳的收集時間段和培養(yǎng)物的細胞密度。本文還提供了一種轉導靶細胞的方法，其包括以上述制備的包含依據(jù)本發(fā)明的感染性反轉錄病毒顆粒的病毒上清接觸所述細胞。正如上述，所述靶細胞可為但不限于為哺乳動物細胞、人細胞、靈長類細胞或鼠類細胞。所述靶細胞可為原代細胞或細胞系。所述方法還可包括加入物質以增加對病毒上清的轉導，例如聚凝胺、Retronectin和減硫酸精蛋白。此外，所述方法還可包括施加病毒上清后低速離心細胞。這些以及其他轉導優(yōu)化技術是本領域熟知且常規(guī)的技術。本發(fā)明還提供了一種通過施用以本發(fā)明所述反轉錄病毒載體轉導的細胞來治療對象的方法，其中所述異源基因編碼可用于治療的多肽或轉錄物。在一個實施方式中，體外或離體轉導細胞。本發(fā)明還提供了一種治療對象的方法，其包括施用包含本發(fā)明所述表達載體和適宜載劑的組合物，其中所述異源基因編碼可用于治療的多肽或轉錄物。在一個實施方式中，所述目的核酸編碼治療劑。術語"可用于治療的"取其普通意義，包括處理劑、預防劑和置換劑。如果治療劑改善或預防疾病或疾患的至少一種癥狀，則該治療劑可視為有治療效果?？梢员景l(fā)明載體和/或方法治療的遺傳疾病包括期望長期表達治療性核酸的這些疾病。在另一實施方式中，所述方法用于治療遺傳疾病、增殖疾病或感染性疾病。另一實施方式包括治療一種或多種疾病、障礙或疾患的方法，這些疾病、障礙或疾患包括但不限于神經(jīng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、肌肉疾病、生殖疾病、胃腸道疾病、肺疾病、心血管疾病、腎疾病、增殖疾病和/或癌性疾病或疾患。另外的實施方式包括治療需取代、上調(diào)或下調(diào)目的基因的神經(jīng)退行性疾病或病癥、阿爾茨海默氏病、精神分裂癥、癲癇、新生物、癌和AIDS或其他疾病。施用本發(fā)明所述表達載體的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。所述載體或組合物可以任何方便的途徑施用，例如輸注或彈丸注射、經(jīng)上皮或粘膜層(例如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜等)吸收，并可與其他生物活性劑一同施用。施用可為全身或局部的。此外，通過任何適宜的途徑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)引入本發(fā)明所述載體或組合物是理想的，這些途徑包括腦室內(nèi)注射或鞘內(nèi)注射；可以例如連接到囊(reservoir)如Ommaya囊的腦室內(nèi)導管促進腦室內(nèi)注射。也可使用肺部給藥，例如通過使用吸入器或霧化器和含氣霧劑的制劑。試劑盒本發(fā)明的另一目的是提供一種包含用于上述方法的載體的試劑盒或藥物輸送系統(tǒng)。施用靶向反轉錄病毒顆粒所需的全部必需材料和試劑可組裝在一個試劑盒內(nèi)(例如包裝細胞構建體或細胞系)。該試劑盒的組分可以多種配方提供。本發(fā)明所述的一種或多種反轉錄病毒載體可與一種或多種藥劑(例如化學治療劑)配制成單一的藥用組合物或不同的藥用組合物。這些試劑盒或藥物輸送系統(tǒng)的組分還可為干燥或凍干形式。當試劑或組分以干燥形式提供時，一般通過加入也可提供在另一容器裝置中的適宜溶劑進行重建。本發(fā)明所述試劑盒還可包括劑量和/或給藥信息方面的說明。本發(fā)明所述的試劑盒或藥物輸送系統(tǒng)一般還包括一種商業(yè)銷售用的封閉容納小瓶的裝置，例如容納所需小瓶的注射容器或吹塑塑料容器。不管使用多少容器或使用何種類型容器，所述試劑盒還可包含或包裝有一種輔助注射/施用或置放最終復合組合物到對象體內(nèi)的儀器。這類儀器可為敷料器、吸入器、注射器、吸量管、鑷子、量匙、滴眼瓶或準予在醫(yī)學上使用的任何輸送媒介。必須注意的是，正如本說明書和所附權利要求所使用，除非上下文清楚表明其他含義，單數(shù)形式的"一"(a、an)、"所述(the)"等包括復數(shù)引用。因此，例如提及"一多核苷酸"包括多個多核苷酸，而提及"一個細胞"則包括多個細胞。正如本文使用，術語"體外"系指人工環(huán)境和發(fā)生在人工環(huán)境內(nèi)的過程或反應。體外環(huán)境可由試管和細胞培養(yǎng)組成，但不限于此。術語"體內(nèi)"系指天然環(huán)境(例如動物或細胞)和發(fā)生在天然環(huán)境內(nèi)的過程或反應。下列實施例用于例示而非限制本發(fā)明所述方法。對醫(yī)學治療和制藥業(yè)通常碰到的各種條件和參數(shù)進行的其他適宜修改和改動對本領域技術人員是顯而易見的，它們位于本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實施例1本實施例提供了各種啟動子的構建過程。1)人巨細胞病毒(HCMV)即時早期(正)啟動子(SEQIDNO:1)HCMV正啟動子得自pCN質粒(Lee等人.，A'o;/^.Aes.Gommww.272:230(2000))。2)MLV(SEQIDNO:2)的U3MLVLTR的U3區(qū)含有強增強子和啟動子序列。以MLV載體MT作為模板經(jīng)PCR擴增MLV3'LTR的U3區(qū)(Hong等人，/Meaf.6:724(2004);美國專利6,451,595)。下列引物對被用于PCR。ME5:ACGCGTGCAAGGCATGGAAAAA(SEOIDNO:18)MMMP3:ACGCGTAGATCTGAATTCTACCCGGGCGACGCAGT(SEOIDNO:19)MlulBglIIEcoRI采用Expend高保真PCR體系(Ca估92351824,Roche)對含有200ng質粒DNA模板和每種引物各1pi(10pmol4il)的100jilPCR反應液進行35個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95X:變性30秒，55X:退火30秒，72'C聚合30秒。擴增出的455bp片段被克隆到pGEMTeasy載體上(Ca估A1360，Promega，WI，USA)，生成pGEMT-MTU3。3)CMV/泛素啟動子(SEQIDNO:3)A.CMV增強子以pCK(PCT/KR99/00855)作為模板經(jīng)PCR擴增CMV增強子。下列引物對被用于PCR。CMV5:ACGCGTTGACATTGATTATTG(SEQIDNO:20)MMKMD1:TCTAGAGCCAAAACAAACTCCCAT(SEQIDNO:21)Xbal采用Expend高保真PCR體系對含有200ng質粒DNA模板和每種弓I物各2jil(5pmol/pl)的50plPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件94。C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72"C聚合1分鐘。擴增片段被克隆到pGEMTeasy載體上，生成pGEMT-Enh。核苷酸序列經(jīng)測序確認。B.人聚泛素C啟動子(Gill等人G"e"e77^&1539(2001))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人聚泛素C啟動子(-333~+877)。下列引物對被用于PCR。KMD4:GCTAGCGGCCTCCGCGCCGGGTTT(SEQIDNO:22)NhelKMD5:ACGCGTAGATCTGAATTCGTCTAACAAAAAAGCCAA(SEOIDNO:23)MlulBglIIEcoRI采用Expend高保真PCR體系對含有200ngDNA模板和每種引物各2Ml(5pmol/jil)的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件94'C變性1分鐘，55。C退火l分鐘，72。C聚合l分半鐘。擴增出的1230bp片段被克隆到pGEMTeasy載體上，生成pGEMT-UbC。核苷酸序列經(jīng)測序確認。C，CMV增強子/UbC啟動子為了構建由CMV增強子和UbC啟動子組成的雜合啟動子，從pGEMTEasy-Enh切割下Sall-Xbal片段，將其插入到pGEMTEasy-UbC的Sall-Xbal位點，以生成pGEMTEasy-Enh+UbC。4)CAG(巨細胞病毒增強子，雞(3-肌動蛋白啟動子)啟動子(SEQIDNO:4)為了獲得CAG啟動子(巨細胞病毒增強子，雞(3-肌動蛋白啟動子)啟動子(SEQIDNO:4)，將來自pAxCAwt(TakaraBio，Otsu，Japan)以Klenow片段處理的Sall-Swal片段克隆到pGEMTeasy(Promega，WI,USA),以生成pGEMTeasy-CAG。核苷酸序列經(jīng)測序確認。5)人延伸因子la(EFl-a)啟動子(SEQIDNO:5)(Kim等人，6fe"eW:217(1990))以分離自HT1080細胞(人纖維肉瘤細胞系，ATCCCCL-121)的基因組DNA作為模板擴增人延伸因子la(EFl-a)啟動子(-341+1007)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下EEF1A1F:ACGCGTGTAAGCCAGCAATGGTAGAGGGAAGATTCTGCACGMlul(SEQIDNO:24)EEF1A1R:GGATCCTTTTGGCTTTTAGGGGTAGTTTTCACGACACCBamHI(SEQIDNO:25)采用Expend高保真PCR體系(Cat弁92351824,Roche)對含有500ng基因組DNA模板、各1pl的每種引物(IOpmol/pl)和550plPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95t:變性l分鐘，55t:退火l分鐘，72"C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-EF。核苷酸序列經(jīng)測序確認。6)人p-肌動蛋白啟動子(SEQIDNO:6)(Nakajima-Iijima等人,尸roc.Ato/.爿cadt/5L482:6133(1985);Miyamoto,A^c/ez.c爿c/AA仏":9095(1987》以分離自K562細胞(人髓系細胞系，ATCCCCL-243)的基因組DNA作為模板擴增人p-肌動蛋白啟動子(-387+944)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下BApF:ACGCGTGAGATGTCCACACCTAGGATGTCC(SEQIDNO:26)MMBApR:GGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCCG(SEQIDNO:27)BamHI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmol小l)和5^DMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95"C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-BA。核苷酸序列經(jīng)測序確認。7)人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子(SEQIDNO:7)(Ercolani等人，編.逾15335(1988))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子(-350+315)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下GAPDHF:ACGCGTTTCATCCAAGCGTGTAAGGG(SEQIDNO:28)MMGAPDHR:GTTTAAACGGTGTCTGAGCGATGTGGCT(SEQIDNO:29)Pmel采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1^(10pmol4d)和5jxlDMSO的50PCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95。C變性l分鐘，55。C退火l分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-GAPDH。核苷酸序列經(jīng)測序確認。8)人核糖體蛋白L10(RPLIO)啟動子(SEQIDNO:8)(NCBI收錄號:NIvl—006013，NT—011726;Bignon等人，5!'oc/ze肌5/0/7/7;^.Cow附w".7組165(1992))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人RPL10(核糖體蛋白L10)啟動子(-350+143)(SEQIDNO:8的651到1143位核苷酸)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下RPLF:ACGCGTAGGCCCACCTAGGGTACTTTCCTTT(SEQIDNO:30)MMRPLR:GGATCCGGCGACACCAGGATCTTCAGTGGCT(SEQIDNO:31)BamHI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmoi41l)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95。C變性l分鐘，55。C退火l分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-RPL。核苷酸序列經(jīng)測序確認。9)人白細胞受體簇成員8(LENG8)啟動子(SEQIDNO:9)(NCBI收錄號:AL834532，NT—011109;Cooper等人，Ge"ome/饑(2006》以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人LENG8(白細胞受體簇(LRC)成員8)啟動子(-385~+305，+1908~+2121)(SEQIDNO:9的635到1538位核苷酸)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下LENG8F1:ACGCGTAGAA丁TGTTTGAACCCAGGAGGCGG(SEQIDNO:32)30MMLENG8R1:GTTTAAACAAAGTAGAAGACGACGGCGCACGCGPmeI(SEQIDNO:33)EENG8F2:GTTTAAACCCACACCCAGAACTCTTCAGATCCTPmel(SEQ1DNO:34)LENG8R2:GAATTCCTGGACCTTGGGGTATAAGGGGTGG(SEQIDNO:35)EcoRI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pl(10pmoll)和5plDMSO的50plPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95"C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上，分別生成pGEMTeasy-LENGl和pGEMTeasy-LENG2。確認其核苷酸序列后，pGEMTeasy-LENGl的Mlul-Pmel片段被克隆到pGEMTeasy-LENG2的Mlul-Pmel位點上，以生成pGEMTeasy-LENG8。10)人分選連接蛋白3(SNX3)啟動子(SEQIDNO:10)(NCBI收錄號:NM—152828,NT_025741;Haft等人，Mo/.Ce〃.所o/./&7278-87(1998))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人SNX3(分選連接蛋白3)啟動子(-353~+338)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下S鵬F:GAATTCAATCCAGACGCGTGTCTGGTGCAA(SEQIDNO:36)EcoRISNX3R:GGATCCTTCGCTGTAGCTGCTG(SEQIDNO:37)Bamffl采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmol/nl)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95'C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-SNX。核苷酸序列經(jīng)測序確認。11)人CNOT3(SEQIDNO:l1)(CCR4-NOT轉錄復合物，亞基3)啟動子(NCBI收錄號:NM一014516;Albert等人,M/c/e/c2S:809(2000))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人CNOT3(CCR4-NOT轉錄復合物，亞基3)啟動子(-350+654,+5076~+5266)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1nl(10pmol/nl)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95'C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上，分別生成pGEMTeasy-CNOTl和pGEMTeasy-CNOT2。確認其核苷酸序列后，pGEMTeasy-CNOTl的MluI-BamHI片段被克隆到pGEMTeasy-CNOT2的MluI-BglII位點上，以生成pGEMTeasy-CNOT3。12)人CPNE1(copineI)啟動子(SEQIDNO:12)(NCBI收錄號:NM一152926;Creutz等人，/Oze/n.273:1393(1998))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人CPNE1(copineI)啟動子(-300~+489,+5612+5999)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>BamHI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1^(10pmol4d)和5DMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95-C變性l分鐘，55。C退火l分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上，分別生成pGEMTeasy-CPNEF和pGEMTeasy-CPNER。確認其核苷酸序列后，pGEMTeasy-CPNEF的MluI-BamHI片段被克隆到pGEMTeasy-CPNER的MluI-BglII位點上，以生成pGEMTeasy-CPNE1。13)人HYPO(假設蛋白)啟動子(SEQIDNO:13)(NCBI收錄號:AF351613)以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人HYPO(假設蛋白)啟動子(--350~+66)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下HYPOF:ACGCGTTCTTTTACACGTTTGGTTTTATGGT(SEQIDNO:46)MlulHYPOR:GGATCCGGCTGCAACAGGCCAGGAAACCTTC(SEQIDNO:47)BamHI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1^(10pmol/pl)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95t:變性l分鐘，55i:退火l分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-HYPO。核苷酸序列經(jīng)測序確認。14)人DKC1(先天性角化不良1，角化不良蛋白)啟動子(SEQIDNO:14)(NCBI收錄號:BC009928;Strausberg等人，/Voc.iVa"5W.t/W卯:16899(2002》以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人DKCl(先天性角化不良l，角化不良蛋白)啟動子(-473+91)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下DKC1F:ACGCGTGCACACTACTCCTATTGGCfSEOIDNO:48)MlulDKCR:GAATTCGTTACCCTGCACCGCGTGC(SEQIDNO:49)EcoRI采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmol/pl)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95'C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-DKCl。核苷酸序列經(jīng)測序確認。15)人VPS72(囊泡蛋白分選72)啟動子(SEQIDNO:15)(NCBI收錄號:NM—005997;Horikawa等人，所o;^p.Ccwww".(1995》以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人VPS72(囊泡蛋白分選72)啟動子(-466~+43)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下VPS72F:ACGCGTACAAAAATTAGTTGGGCAT(SEQIDNO:50)MMVPS72R:GAATTCACCGCCTACCGAGACTGCG(SEQIDNO:51)EcoRI釆用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmol/iil)和5piDMSO的50^PCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95。C變性l分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-VPS72。核苷酸序列經(jīng)測序確認。16)人ITGB4BP(InTeGrinBeta4結合蛋白)啟動子(SEQIDNO:16)(NCBI收錄號:BCOl1845,NT—028392;Strausberg等人.，/Vw.Ato/.JcW.*SW.園狄l6899(2002))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人ITGB4BP(InTeGrinBeta4結合蛋白)啟動子(—350~+304)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下-ITGB4BPF:ACGCGTTCTGTCCCTCAAGGCACAGCT(SEQIDNO:52)Mlul34ITGB4BPR:GTTTAAACGAGGCCTAGGGGCGGCGGAGGCGGGAGTTCAAPmel(SEQIDNO:53)采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1^(10pmol/nl)和5piDMSO的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95'C變性1分鐘，55'C退火1分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-ITGB4BP。核苷酸序列經(jīng)測序確認。17)人UQCRQ(泛醇-細胞色素c還原酶，復合物III，亞基VII)promoter(SEQIDNO:17)(NCBI收錄號:BC090048,NT—034772;Strausberg等人，/Voc.AW/,^c"d5W.6^4P久16899(2002))以分離自HT1080細胞的基因組DNA作為模板擴增人UQCRQ(泛醇-細胞色素c還原酶，復合物III，亞基VII)啟動子(-350+217)。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下UQCRQF:ACGCGTGTCACCTTTTTGTTCCCTCCC(SEQIDNO:54)MlulUQCRQR:GTTTAAACTGTGGCGGCGGCCCTGCAGG(SEQIDNO:55)Pmel采用Expend高保真PCR體系對含有500ng基因組DNA模板、每種引物各1pi(10pmol/nl)和5^DMSO的50^PCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95。C變性l分鐘，55。C退火l分鐘，72°C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-UQCRQ。核苷酸序列經(jīng)測序確認。實施例2在本實施例中，比較了實施例1制備的所述啟動子對表達載體上增強型綠色熒光蛋白(eGFP)基因表達的效應。l.eGFP表達載體的構建首先，通過PCR從pAxCAwt(TakaraBio，Japan)獲得兔P-球蛋白的polyA序列。用于PCR的引物的核苷酸序列如下RGpAF:GGATCCTTTTCCCTCTGCCAAA(SEQIDNO:56)BamHIRGpAR:ACTAGTATAAGAGAAGAGGGACAGC(SEQIDNO:57)Spel采用Expend高保真PCR體系對含有100ngpAxCAwtDNA模板(lpl)、每種引物各1pi(10pmol/inl)和5pidNTP(10mM)的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95t)變性l分鐘，50'C退火1分鐘，72'C聚合1分半鐘。擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-RGpA。核苷酸序列經(jīng)測序確認。隨后，來自pC-LND-GFP-n、pG-LND-GFP-n、pR-LND-GFP-n、pL-LND-GFP-n、pIT-LND-GFP-n和pU-LND-GFP-n(參見實施例7)的MluI-BglII片段被克隆到pGEMTeasy-RGpA的MluI-BamHI位點，生成pC-GFP-RGpA、pG畫GFP-RGpA、pR-GFP-RGpA、pL-GFP-RGpA、pIT-GFP-RGpA和pU-GFP-RGpA。為了構建pS-GFP-RGpA，將pS-LND-GFP-n的EcoRI-XhoI片段變?yōu)槠蕉耍S后將其克隆到pGEMTeasy-RGpA的平端BamHI位點。2.eGFP表達的分析根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用FuGene6將含有eGFP基因的表達載體轉移到293T細胞。通過流式細胞術分析測量GFP的表達水平。流式細胞術按如下方法進行轉染48小時后，收集293T細胞，以含0.1M疊氮化鈉(FACS緩沖液)的磷酸緩沖鹽水洗滌一次。隨后細胞被重新懸浮于PBS，借助CellQuest(BectonDickinson)數(shù)據(jù)采集和分析軟件以FACSort(BectonDickinson,LosAngeles,CA,USA)分析細胞。表1給出了該結果。表1.GFP表達的比較啟動子相對平均熒光強度CMV100GAPDH102.5RPL1081.9LENG866.6SNX336.4ITGB4BP76.4UQCRQ47.13這些數(shù)據(jù)顯示HCMV和GAPDH啟動子產(chǎn)生了可比較的GFP表達水平。其他啟動子例如RPLIO、LENG8和ITGB4BP也產(chǎn)生了顯著的GFP表達，表明它們有可能用作真核基因表達體系的啟動子。實施例3從實施例1制備的各種啟動子中選擇RPL10和LENG8啟動子進行進一步的鑒定，以分析基因表達所需的啟動子序列。1.一系列RPL10啟動子的構建l)一系列RPL10啟動子的構建通過PCR產(chǎn)生各種長度的RPL10啟動子。以HT1080的基因組DNA作為模板擴增RPL啟動子。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下-RPLF50:A￡2Q0IACGCGCGCAGACAGACCGCCTATATAAGCCATMlul(SEQIDNO:58)RPLF100:A￡eCeiTGACGTCTGACAGAGCGTCCACCCGTCTTCGMlul(SEQIDNO:59)RPLF200:ACGCGTCTGGCCGCCCGCGGCCCTGGTACCCGGTCACCMlul(SEQIDNO:60)RPLF500:ACGCGTGTCTCCCCCTCCGGCCTCCCGGGTTGACAAAGGMlul(SEQIDNO:61)RPLF1000:ACGCGTGTGCGCTCGAGCAGGATTTCCTCCCGTCCTTCCMlul(SEQIDNO:62)RPLR:OQAI￡￡GGCGACACCAGGATCTTCAGTGGCT(SEQIDNO:31)BamHIRPLRTSS:fiQAIQ￡GCGCTCCTCCGCCTGCGCATGGCTTATATABaraHI(SEQIDNO:63)采用Expend高保真PCR體系對含有1基因組DNA模板、各1pi的每種引物(IOpmol/nl)和5pidNTP(10mM)的50piPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件95t:變性l分鐘，6(TC退火1分鐘，72-C聚合1分半鐘。實施例1(8)描述了RPL啟動子(-350~+143)(SEQIDNO:8的651到1143位核苷酸)。RPL50啟動子(-50+143)(SEQIDNO:8的951到1143位核苷酸)以引物對RPLF50和RPLR擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPL50。RPL100啟動子(-100~+143)(SEQIDNO:8的901到1143位核苷酸)以引物對RPLF100和RPLR擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPL100。RPL200啟動子(-200+143)(SEQIDNO:8的801到1143位核苷酸)以引物對RPLF200和RPLR擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPL200。RPL500啟動子(-500~+143)(SEQIDNO:8的501到1143位核苷酸)以引物對RPLF500和RPLR擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPL500。RPL1000啟動子(-1000+143)(SEQIDNO:8的1到1143位核苷酸)以引物對RPLF1000和RPLR擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPL1000。RPLTSS啟動子(-350~-1)(SEQIDNO:8的651到1000位核苷酸)以引物對RPLF和RPLRTSS擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pRPLTSS。核苷酸序列經(jīng)測序確認。2)含有RPL啟動子的一系列eGFP表達載體的構建通過將來自pGemTeasy-GFP(參見實施例4)的BamHI片段插入到pGemTeasyRGpA(參見實施例2)的Bamffl位點，構建pGemTeasy-GFP-RGpA。隨后，pGemTeasy-pRPL啟動子的MluI-BamHI片段被克隆到pGemTeasy-GFP-RGpA的MluI-BamHI位點上，生成pRPL-、pRPL50-、pRPLlOO-、pRPL200-、pRPL500-、pRPLlOOO-和pRPLTSS-GFP-RGpA。2.—系列LENG8啟動子的構建1)一系列LENG8啟動子的構建正如實施例1(9)描述，通過連接2個片段(LENG1和LENG2)產(chǎn)生LENG8啟動子。為了產(chǎn)生各種長度的LENG8啟動子，通過PCR獲得一系38列的LENG1片段。隨后，LENG1片段被連接到實施例1(9)描述的LENG2片段上，以生成最終的LENG啟動子。HT1080的基因組DNA被用作模板。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下LENGF50:ACGCGTGTGACGTCAGGACGCCGCGGTCAGG(SEQIDNO:64)MlulLENGF100:ACGCGTTGGCGTTCATTGGCTGTGCAGGGCC(SEQIDNO:65)MlulLENGF200:ACGCGTTTGTCCCCTCGGGGCCACCGTCCCC(SEQIDNO:66)MlulLENGF1000:ACGCGTTTGTATCAGAGTCCTGGACGGAAAC(SEQIDNO:67)MlulLENG8R1:GTTTAAACAAAGTAGAAGACGACGGCGCACGCG(SEQIDNO:33)PmelLENGRTSS:GTTTAAACCTCTGGTCTTCTTTGGCTTCGACGT(SEQIDNO:68)Pmel采用Expend高保真PCR體系對含有1基因組DNA模板、各1pl的每種引物(IOpmol4d)和5pldNTP(10mM)的50plPCR反應液進行30個循環(huán)的PCR擴增反應。每次循環(huán)條件94'C變性1分鐘，55。C退火l分鐘，72'C聚合2分鐘。L50啟動子(-50~+305)(SEQIDNO:9的970到1325位核苷酸)以引物對LENGF50和LENG8R1擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pU0。L100啟動子(-lOO+305)(SEQIDNO:9的920到1325位核苷酸)以引物對LENGF100和LENG8R1擴增，并被克隆到pGEMTeasy,生成pGemTeasy-pL100。L20O啟動子(-200+305)(SEQIDNO:9的820到1325位核苷酸)以引物對LENGF200和LENG8R1擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pL200。L1000啟動子(-1020~+305)(SEQIDNO:9的1到1325位核苷酸)以引物對LENGF1000和LENG8R1擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGEMTeasy-pL1000。隨后，pGEMTeasy陽pL50、-pL歸、-pL200和-pL1000的Mlul-Pmel片段被克隆到實施例1(9)描述的pGEMTeasy-LENG2的Mlul-Pmel位點，以生成pGEMTeasy-pLENG50P、-pLENG100P、-pLENG200P和-pLENGlOOOP。LENGTSS啟動子(-385~-1)(SEQIDNO:9的635到1019位核苷酸)以引物對LENGF和LENGRTSS擴增，并被克隆到pGEMTeasy，生成pGemTeasy-pLENGTSS。實施例1(9)描述了LENG8啟動子(-385+305,+1908~+2121)(SEQIDN0:9的635到1538位核苷酸)。2)含有LENG啟動子的一系列eGFP表達載體的構建為了構建含有eGFP基因的表達載體，將pGEMTeasy-pLENG啟動子的MluI-EcoRI片段(EcoRI位點變?yōu)槠蕉?克隆到pGemTeasy-GFP-RGpA的MluI-BamHI位點(BamHI位點變?yōu)槠蕉?，生成pLENG-、pLENG50-、pLENG100-、pLENG200-和pLENG1000-GFP隱RGpA。將pGemTeasy-pLENGTSS的Mlul-Pmel片段克隆到pGemTeasy-GFP-RGpA的MluI-BamHI位點(BamHI位點變?yōu)槠蕉?，生成pLENGTSS-GFP-RGpA。3.eGFP表達的分析根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用FuGene6(Roche，Germany)以eGFP表達載體轉染293T細胞，培養(yǎng)48小時。通過流式細胞術分析測量GFP的表達水平。流式細胞術按如下方法進行轉染48小時后，收集293T細胞，以含0.1%疊氮化鈉的PBS洗滌一次。隨后細胞被重新懸浮在PBS中，借助CellQuest數(shù)據(jù)采集和分析軟件以FACSort分析細胞。表2給出了該結果。表2.eGFP表達的比較A.RPL10啟動子相對平均熒光強度RPL-GFP100RPL50-GFP20RPL跳GFP40RPL200-GFP70RPL500-GFP150RPL1000-GFP210RPLTSS-GFP2040<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>最短的啟動子RPL50或LENG50可驅動顯著高于背景的GFP表達，表明轉錄起始位點上游50bp的存在足以具有基本活性。但是，對于RPL10和LENG8啟動子，使用更長的啟動子進行基因表達時，eGFP表達更高。最長的RPL10啟動子RPL1000可驅動比RPL500或其他啟動子更高水平的eGFP表達。在各種LENG啟動子中，最長的LENG8啟動子LENG1000也表現(xiàn)出最高的啟動子活性。而且，當包括位于轉錄起始位點(TSS)和翻譯起始位點之間的元件時，啟動子的活性會更佳。實施例4在本實施例中，所述內(nèi)部啟動子被克隆到反轉錄病毒載體上，并比較了它們對病毒滴度和eGFP基因表達水平的效應。1.表達eGFP的反轉錄病毒載體的構建1)反轉錄病毒載體的構建1-1)I-D構建了缺失U3的反轉錄病毒質粒。首先，以pMT(Hong等人《/.6:724(2004);US6，451，595)作為模板擴增MLV的正常3，LTR。用于PCR的引物對的核苷酸序列如下SCV3LB:GGATCCCTCGAGCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCBamHIXhol(SEQIDNO:69)SCV3LRI:GAATTCGTCGACTGAAAGACCCCCGCTGACGG(SEQIDNO:70)EcoRISail擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-3'LTR。以pMT為模板擴增缺失形式的3'LTR。用于PCR的引物的核苷酸序列如下3，LTR-1:GCTAGCCCCTGTGCCTTATTTGAA(SEQIDNO:71)NhelSCV3LRI:GAATTCGTCGACTGAAAGACCCCCGCTGACGG(SEQIDNO:70)EcoRISail擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy,生成pGEMTeasy-3，dLTR-l。Nhel-Sall片段被克隆到pGEMTeasy-3，LTR的Nhel-Sall位點，生成pPreSIN2。來自pPreSIN2的BamHI-Sall片段被克隆到pMT的BamHI-Sall位點，生成I-D。1-2)I-ND為了促進克隆，將新的多克隆位點(MCS)引入到反轉錄病毒質粒I-D上。在沒有模板的情況下通過聚合酶反應生成新MCS的52bp長的片段。使用了下列引物對NEWMCSF:ACGCGT丁TAAACCGCGGAATTCGGATCCACATCGTG.MlulSacIIB咖HI(SEQIDNO:72)NEWMCSR:CTCGAGATCTAGGCCTCACGATGTGGATCCGAATTCXholStulDraIIIEcoRI(SEQIDNO:73)含有MIuI、Pmel、SacII、EcoRI、BamHI、DraIII、Stul、BglII和Xhol限制酶切位點的擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy。確認核苷酸序列后，將Mlul-Xhol片段克隆到I-D的Mlul-Xhol位點，生成I-ND。2)含eGFP基因的反轉錄病毒載體的構建2-l)eGFP基因為了構建表達eGFP基因的反轉錄病毒載體，采用下列引物對從pIRES2-EGFP(CLONTECHLaboratory,PaloAlto,CA，USA，Cat.#6029-l)擴增eGFP基因eGFP5:ACGCGTGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG3,MMBamHI(SEQIDNO:74)eGFP3:CTCGAGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTC3，(SEQIDNO:75)XholBglII擴增的eGFP被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-eGFP。BamHI-Bgin片段被克隆到反轉錄病毒載體pI-D的BamHI位點，生成pI-D-GFP;BamHI-BglII片段被插入到反轉錄病毒載體I-ND的Bamffl位點，生成I-ND-GFP。2-2)含eGFP基因的反轉錄病毒載體的構建通過將pGEMTeasy-eGFP的BamHI-BglII片段插入到含有野生型LTR的反轉錄病毒載體pMT的BamHI位點，構建pMT-GFP(Kim等人版C。mm肌343:1017(2006》。對于帶有缺陷型LTR的反轉錄病毒載體，實施例1的各種內(nèi)部啟動子分別被克隆到含有GFP序列的反轉錄病毒載體上。來自pCN質粒的MluI-BamHI片段即HCMV正啟動子被克隆到pI-D-GFP的MluI-BamHI位點，生成pC-D-GFP。來自pGEMTEasy-MTU3的Mlul片段被插入到pI-D-GFP的Mlul位點，生成pM-D-GFP。來自pGEMTEasy-Enh+UbC的Mlul片段被插入到pI-D-GFP的Mlul位點，生成pCU-D-GFP。來自pCN質粒的MluI-BamHI片段即HCMVIE啟動子被克隆到pI-ND-GFP的MIuI-Bamffl位點，生成C-ND-GFP。來自pAxCAwt(TakaraBio,Otsu，Japan)的以Klenow片段處理的Sall-Swal片段被克隆到pI-ND-GFP的Pmel位點，生成pCA-ND-GFP。來自pGEMTeasy-EF的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pE-ND-GFP。來自pGEMTeasy-BA的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pB-ND-GFP。來自pGEMTeasy-GAPDH的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-ND-GFP的Mlul-Pmel位點，生成pG-ND-GFP。來自pGEMTeasy-RPL的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pR-ND-GFP。來自pGEMTeasy-LENG8的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-EcoRI位點，生成pLe-ND-GFP。來自pGEMTeasy-SNX的EcoRI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的EcoRI-BamHI位點，生成pS-ND-GFP。來自pGEMTeasy-CNOT3的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pCo-ND-GFP。來自pGEMTeasy-CPNEl的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pCP-ND-GFP。來自pGEMTeasy-HYPO的MluI-BamHI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-BamHI位點，生成pHY-ND-GFP。來自pGEMTeasy-DKCl的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-EcoRI位點，生成pD-ND-GFP。來自pGEMTeasy-VPS72的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-ND-GFP的MluI-EcoRI位點，生成pV-ND-GFP。來自pGEMTeasy-ITGB4BP的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-ND-GFP的Mlul-Pmel位點，生成pIT-ND-GFP。來自pGEMTeasy-UQCRQ的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-ND-GFP的Mlul-Pmel位點，生成pU-ND-GFP。2.eGFP表達的分析以含有eGFP基因的相應反轉錄病毒載體以及雙嗜性包裝構建體pVM-GP和pVM-AE(Yu等人7T^J0:706(2003))轉染293T細胞，隨后培養(yǎng)48小時。以0.45pm濾紙過濾培養(yǎng)上清，制備不含細胞的病毒，將其用于分別轉導2xl05的HT1080細胞和2xl05的K562細胞。溫育細胞48小時，隨后收集細胞進行檢測。通過FACS分析(參見表3和表4)測量GFP陽性細胞的比例和GFP表達的水平(平均熒光強度)。FACS分析按如下方法進行:轉導48小時后，收集HT1080細胞和K562細胞，以含O.P/o疊氮化鈉(FACS緩沖液)的磷酸緩沖鹽水洗漆一次。隨后細胞被重新懸浮于PBS，借助CellQuest(BectonDickinson)數(shù)據(jù)采集和分析軟件以FACSort(BectonDickinson,LosAngeles，CA，USA)分析細胞。首先，比較帶有缺陷型LTR的反轉錄病毒載體的GFP表達和含有野生型LTR的反轉錄病毒載體MT-GFP的GFP表達。正如表3所示，C-D-GFP載體的表現(xiàn)與MT-GFP同樣好。在HT1080細胞中，來自C-D-GFP載體的GFP陽性細胞的比例高于來自MT-GFP載體的GFP陽性細胞比例，而在K562細胞中也超過來自MT-GFP載體的GFP陽性細胞比例的80°/。。在HT1080細胞中，C-D-GFP載體驅動的GFP表達水平高于MT-GFP載體驅動的GFP表達水平，而在K562細胞中約為MT-GFP載體驅動的GFP表達水平的70%。從這些實驗我們證實了HCMV啟動子對GFP表達有良好效果。但是，我們沒有發(fā)現(xiàn)與HCMV啟動子效果一樣好的其他啟動子。CMV7泛素的雜合啟動子也產(chǎn)生了高病毒滴度和高水平的GFP表達，不過比HCMV啟動子低。44表3.GFP表達的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>作為下一個步驟，除HCMV啟動子外我們還測試了含有其他各種內(nèi)部啟動子的更多反轉錄病毒載體。表2給出了該結果。表4.GFP表達的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>正如表4所示，HCMV啟動子在HT108細胞和K562細胞均產(chǎn)生最高水平的基因表達(參見平均熒光強度)和大量的GFP陽性細胞。但是，LENG8和RPL10啟動子在HT1080細胞和K562細胞均產(chǎn)生了最高的病毒滴度(被轉導細胞的比例)。這兩種啟動子驅動的GFP表達水平在HT1080細胞中相對較低，但在K562細胞中，與HCMV啟動子相比高于30%。因此，LENG8和RPL10啟動子可用于反轉錄病毒載體體系在某些細胞類型中的基因表達。此外，GAPDH、UQCRQ、ITGB4BP和SNX3啟動子產(chǎn)生了相對較高的病毒滴度(CMV啟動子的80%以上)。CA-ND-GFP和E-ND-GFP載體在K562細胞內(nèi)產(chǎn)生了最高水平的GFP表達，但是源自這些載體的病毒滴度極低，因此難以應用這些載體。實施例5在本實施例中，比較了內(nèi)部啟動子對病毒滴度和gp91基因表達水平的效應。1.表達gp91的反轉錄病毒載體的構建1)gp91-phox基因(NCBI收錄號:NMJ)00397)為了構建表達人gp91-phox的反轉錄病毒載體，通過RT-PCR從人外周血淋巴細胞的總RNA克隆gp91cDNA。用于該步驟的引物核苷酸序列如下GP91F:GGATCCATGGGGAACTGGGCTGTGAAT(SEQIDNO:76)BamHIGP91R:GGATCCCTCGAGTTAGAAGTTTTCCTTGTTGAAAABamHIXhol(SEQIDNO:77)擴增片段起初被克隆到pGEMTeasy上以生成pGEMTeasy-gp91，并確認了該擴增片段的核苷酸序列。2)pPromoter-ND來自pCN質粒的MluI-BamHI片段即HCMVIE啟動子被克隆到pI-ND的MluI-BamHI位點，生成pC-ND。來自pGEMTeasy-GAPDH的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-ND的Mlul-Pmel位點，生成pG-ND。來自pGEMTeasy-RPL的MM-BamHI片段被克隆到pI-ND的MluI-BamHI位點，生成pR-ND。來自pGEMTeasy-LENG8的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-ND的MluI-EcoRI位點，生成pL-ND。來自pGEMTeasy-SNX的EcoRI-BamHI片段被克隆到pI-ND的EcoRI-BamHI位點，生成pS-ND。來自pGEMTeasy-ITGB4BP的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-ND的Mlul-Pmel位點，生成pIT-ND。3)表達gp91的反轉錄病毒載體的構建通過將pGEMTeasy-gp91的BamHI片段插入到pMT，構建MT-gp91載體。通過將來自pGEMTeasy-gp91的BamHI-XhoI片段插入到pC-ND、pG-ND、pR-ND、pL-ND、pS-ND和pIT-ND的BamHI-XhoI位點，分別生成pC-ND-gp91、pG-ND畫gp91、pR-ND-gp91、pL-ND-gp91、pS-ND-gp91和pIT-ND-gp91，構建gp91-phox表達受內(nèi)部啟動子驅動的反轉錄病毒載體。實施例7(3)描述了反轉錄病毒載體pR-LND-gp91-phox-n、pR1000-LND-gp91-n和pR1000-LND-gp91-pA-n-rev的構建過程。2.gp91表達的分析采用含有gp91基因的相應反轉錄病毒載體以及包裝構建體pVM-GP和pVM-GeR(Kim等人.，說oc/zew.所qp/2".Commw".3":1017(2006))以磷酸鈣沉淀方法轉染293T細胞，隨后培養(yǎng)48小時。以0.45濾紙過濾培養(yǎng)上清，制備不含細胞的病毒，將其用于轉導K562細胞。對于K562細胞的轉導，轉導前一天在6孔板上每孔接種2.5x105個細胞。在8嗎/ml聚凝胺的存在下每孔加入相同體積的病毒上清，培養(yǎng)板在32。C下以2800rpm離心90分鐘(Eppendorfcentrifiige5810R)。轉導后，細胞在37°C的C02培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2天。通過流式細胞術分析gp91的蛋白表達。轉導2天后，收集K562或PLB-985/gp91;細胞，以PBS洗滌。細胞隨后被重新懸浮在100plPBS中，以1pl抗-gp91的抗體(7D5;MBL,Japan)在4°C下染色30分鐘。隨后細胞以PBS洗滌兩次，重新懸浮于100^PBS，再以1^結合FITC的山羊抗小鼠抗體(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc，Birmingham,AL,USA)在4°C下染色30分鐘。隨后細胞以PBS洗滌3次，重新懸浮于500pl的PBS。借助CellQuest(BD)數(shù)據(jù)采集和分析軟件以FACSort(BD,SanJose,CA)進行流式細胞術。首先，比較來自反轉錄病毒載體MT-gp91、C-ND-gp91、G-ND-gp91、R-ND-gp91、L-ND-gp91、S-ND-gp91和IT-ND-gp91的gp91表達。表5給出了該結果。在各種缺失U3的反轉錄病毒載體當中，R-ND-gp91和S-ND-gp91產(chǎn)生了比其他反轉錄病毒載體更高的病毒滴度(達到MT-gp91在K562細胞中的70%以上)。在K562細胞中，R-ND-gp91載體驅動的gp91表達比S-ND-gp91載體驅動的gp91表達高。C-ND-gp91載體沒有產(chǎn)生gp91陽性細胞，不過ND-eGFP可產(chǎn)生高水平的eGFP表達(表4)。表5.gp91表達的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在實施例3中觀察到與短形式的RPL10啟動子相比，更長形式的RPL10啟動子可驅動更高水平的GFP基因表達。我們檢測了該觀察結果是否適用于gp91的表達。我們構建了含有最長RPL10啟動子即RPL1000(pR1000-LND-gp91-n)并表達gp91的反轉錄病毒載體，證實了其對gp91基因表達的效應。我們還構建了反轉錄病毒載體pR1000-LND-gp91-n-rev，其中受RPL1000啟動子驅動的gp91基因表達盒以反向插入，并比較了gp91的基因表達。表6給出了該結果。表6.gp91表達的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>與R-LND-gp91-n載體相比，R1000-LND-gp91-n載體可產(chǎn)生可比較量的病毒滴度(gp91+細胞的百分數(shù))和更高水平的gp91基因表達(相對平均熒光強度)。R1000-LND-gp91-n-rev載體可驅動最高水平的gp91基因表達，盡管來自它的病毒滴度只是R-LND-gp91-n的一半。實施例6本發(fā)明的反轉錄病毒載體可用于離體基因傳遞。從對象體內(nèi)收集CD34+造血干細胞。CD34+細胞的來源可為骨髓抽吸物或動員的外周血。收集的CD34+細胞以無血清培養(yǎng)基(CdlGro，Germany)在Vudife培養(yǎng)袋(37r，5。/。C02)中培養(yǎng)兩天，該培養(yǎng)基含有300ng/ml的人干細胞因子(SCF)、300ng/ml的人FLT-3L、100ng/ml的人血小板生成素(TPO)和20ng/ml的人IL-3(預刺激)。采用預包被人纖連蛋白CH296片段(Retronectin，TaKaRaBio)的Vuelife培養(yǎng)袋進行轉導。預剌激的細胞被轉移到包被retronectin的Vuelife培養(yǎng)袋，2天內(nèi)分3次加入反轉錄病毒的上清。細胞隨后收集，鹽水洗滌3次，重懸浮于輸注溶液(含1%人血清白蛋白的鹽水)，再輸注給對象。實施例7在本實施例中，考察了內(nèi)部啟動子對包裝細胞系PG13內(nèi)病毒滴度和基因表達水平的效應。1.表達eGFP的反轉錄病毒載體的構建l)反轉錄病毒載體的構建l-l)pI-LND缺失U3的反轉錄病毒載體不能在第一輪反轉錄病毒轉導后被動員，因為轉導后5'LTP和3'LTR均成為缺陷型。因此，通過以pDNA轉染反轉錄病毒的包裝細胞，以使所述載體穩(wěn)定整合到反轉錄病毒的包裝細胞的基因組上，從而建立了穩(wěn)定的生產(chǎn)細胞系。載體DNA的線性化對于所有轉染子在其染色體上含有適宜的DNA排列是重要的。為了構建便于線性化的反轉錄病毒載體，將用于線性化的兩個限制酶切位點引入到反轉錄病毒質粒pI-ND。通過將片段Ll插入到5'LTR之前約200bp處引入限制酶切位點中的一個，并將L2插入到3'LTR之后引入另一位點。在沒有模板的情況下通過聚合酶反應產(chǎn)生Ll片段。以pUC18(Promega,WI,USA)作為模板擴增L2片段。引物的核苷酸序列如下L1F:5，GCTCTTCCGCTCACGTGTGATCAATTTAAATTTCGAASaplPmIBellSwalBstBI(SEQIDNO:78)L1R:5，AGCGGAAGAGCTTCGAAATTTAAATTGATCACACGTGSaplBstBISwalBellPmll(SEQIDNO:79)L2F:5，AGGCCTGGTCACCGGCCATTATGGCCACGTGATCATTTAAATTTGStulBstEIISfilBellAAGCATTTATCAGGGTTA(SEQIDNO:80)L2R:5，TATTCGCGCGTTTCGGTGATGAATATT(SEQIDN0:81)Sspl含有SapI、Pmll、Bcll、Swal、BstBI和Sapl限制酶切位點的擴增LI片段起初被克隆到pGEMTeasy(Promega，WI,USA),生成pGemTeasy-Ll。確認核苷酸序列后，將pGemTeasy-Ll釋放的Sapl片段插入到pI-ND的Sapl位點，生成pI-LlND。含有Stul、BstEII、Sfil、Pmll、Bcll、Swal和Sspl限制酶切位點的擴增L2片段起初被克隆到pGEMTeasy(Promega,WI，USA)，生成pGemTeasy-L2。確認核苷酸序列后，將pGemTeasy-L2釋放的Stul-Sspl片段克隆到pI-LIND的Sspl位點，生成pI-LND。1-2)pI-LND-n為了構建具有高病毒滴度的生產(chǎn)細胞系，選擇含有反轉錄病毒載體DNA的轉染子是很重要的。出于該目的，通常使用抗藥性基因。但是，抗藥性基因位于載體基因組內(nèi)不是有利的，因為如果抗藥性基因被包括在載體的基因組上，該基因會在體內(nèi)表達。因此，我們制備了在反轉錄病毒基因組外攜帶有抗藥性基因的載體構建體。首先，我們使用新霉素抗性基因，用于選擇轉染子。為了表達新霉素抗性基因，將人P-肌動蛋白啟動子和多聚腺苷酸化序列連接到細菌的Neo編碼序列。使用來自K562的基因組擴增人用于PCR的引物的核苷酸序列如下BApF:5'G丁CGACATTAATGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAASailPshBI(SEQIDNO:82)BApR:5，GGATCCGGTGGCGCGTCGCGCCGCTGGGTTTT(SEQIDNO:83)BamHI擴增片段被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-pBA。50使用peDNA3.1(Invitrogen,CA,USA)擴增細菌的Neo編碼基因。用于PCR的引物的核苷酸序列如下NeoF:5，AGATCTATGGGATCGGCCATTGAACAA(SEQIDNO:84)BglIIpAR:5，CATATGTCATAATCAGCCATACCACATTT(SEQIDNO:85)Ndel擴增片段被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-Neo。使用pTet-On(Cbntech，TAKARAbio，Japan)擴增多聚腺苷酸化信號序列。用于PCR的引物的核苷酸序列如下SVpAF:CTCGAGATGGGATCGGCCATTGAACAA(SEQIDNO:86)XholSVpAR:CATATGAGTAATCAGCCATACCACATTT(SEQIDNO:87)Ndel擴增片段被克隆到pGEMTeasy上，生成pGEMTeasy-pA。確認核苷酸序列后，pGEMTeasy-pA釋放的Xhol-Ndel片段被插入到pGEMTeasy-Neo的Xhol-Ndel位點，生成pGEMTeasy-NeopA。BglII-Ndel片段被克隆到pGEMTeasy-pBA的BamHI-Ndel位點，生成pGEMTeasy-pBA-Neo-pA。MM-EcoRI-Klenow處理的片段被克隆到pI-LND的Sspl位點，生成pI-LND-n。2)含eGFP基因的反轉錄病毒載體的構建2-l)pI-LND-GFP-npGemTeasy-eGFP(參見實施例2)釋放的BamHI-BglII片段被克隆到pI-LND-n的Bamffl位點，生成pI-LND-GFP-n。2-2)含eGFP基因的反轉錄病毒載體的構建實施例1的各種內(nèi)部啟動子分別被克隆到含有GFP序列的反轉錄病毒載體。來自pCN質粒的MluI-BamHI片段即HCMV正啟動子被克隆到pI-LND-GFP-n的MluI-BamHI位點，生成pC-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-GAPDH的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND-GFP-n的Mlul-Pmel位點，生成pG-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-RPL的MluI-BamHI片段被克隆到pI-LND-GFP-n的MluI-BamHI位點，生成pR-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-LENG8的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-LND-GFP-n的MluI-EcoRI位點，生成pL-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-SNX的EcoRI-BamHI片段被克隆到pI-LND-GFP-n的EcoRI-BamHI位點，生成pS-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-ITGB4BP的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND-GFP-n的Mlul-Pmel位點，生成pIT-LND-GFP-n。來自pGEMTeasy-UQCRQ的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND-GFP-n的Mlul-Pmel位點，生成pU-LND-GFP-n。3)含gp91-phox基因的反轉錄病毒載體的構建3-l)pPromoter-LND實施例1的各種內(nèi)部啟動子被克隆到pI-LND。來自pCN質粒的MluI-BamHI片段即HCMV正啟動子被克隆到pI-LND的MluI-BamHI位點，生成pC-LND。來自pGEMTeasy-GAPDH的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND的Mlul-Pmel位點，生成pG-LND。來自pGEMTeasy-RPL的MluI-BamHI片段被克隆到pI-LND的MluI-BamHI位點，生成pR-LND。來自pGEMTeasy-LENG8的MluI-EcoRI片段被克隆到pI-LND的MM-EcoRI位點，生成pL-LND。來自pGEMTeasy-SNX的EcoRI-BamHI片段被克隆到pI-LND的EcoRI-BamHI位點，生成pS-LND。來自pGEMTeasy-ITGB4BP的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND的Mlul-Pmel位點，生成pIT-LND。來自pGEMTeasy-UQCRQ的Mlul-Pmel片段被克隆到pI-LND的Mlul-Pmel位點，生成pU-LND。來自pGEMTeasy-pR1000的Mlul-Bamffl片段被克隆到pI-LND的MluI-BamHI位點，生成p詣00-LND。3-2)pPromoter-LND-n來自pGEMTeasy-pBA-Neo-pA的MluI-EcoRI-Klenow處理的片段被克隆到pC-LND、pG-LND、pR-LND、pL-LND、pS-LND、pIT-LND、pU-LND和pR1000-LND的Sspl位點，生成pC-LND-n、pG-LND-n、pR-LND-n、pL-LND-n、pS-LND-n、pIT-LND-n、pU-LND-n和pR1000-LND-n。3-3)含gp91-phox基因的反轉錄病毒載體的構建來自pGEMTeasy-gp91的BamHI片段被克隆到pC-LND-n、pG-LND-n、pR-LND-n、pL-LND-n、pS-LND-n、pIT-LND-n、pU-LND-n和pR1000-LND-n的BamHI位點，生成pC-LND-gp91-phox-n、pG-LND-gp91-phox-n、pR-LND-gp91-phox-n、pL-LND-gp91-phox-n、pS-LND-gp91-phox-n、pIT-LND-gp91-phox-n、pU-LND-gp91-phox-n和pR1000-LND-gp91-phox-n。還構建了gp91基因表達盒反向插入的反轉錄病毒載體。pC-LND-gp91-pA-n-rev按如下步驟構建；i)將來自pC-LND-gp91-n的MluI-BamHI片段插入到pI-LND-n的BamHI-StuI位點，生成pC-LND-n-rev;ii)將pGemTeasy-gp91的BamHI片段插入到pC-LND-n-rev的BamHI位點，生成pC-LND-gp91-n-rev;iii)隨后將pGEMTeasy-RGpA的EcoRI片段插入至!jpC-LND-gp91-n-rev的PmeI位點，生成pC-LND-gp91-pA-n-rev。pR1000-LND-gp91-pA-n-rev按如下步驟構建；i)將來自pR1000-LND-gp91-n的MluI-BamHI片段插入到pI-LND-n的BamHI-StuI位點，生成pR1000-LND-n-rev;ii)將pGemTeasy-gp91的BamHI片段插入到pR1000-LND-n-rev的BamHI位點，生成pR1000-LND-gp91-n-rev;iii)隨后將pGEMTeasy-RGpA的EcoRI片段插入到pR1000-LND-gp91-n-rev的PmeI位點，生成pRl000-LND-gp91-pA-n-rev。將MluI-EcoRI片段插入到pMT-gp91的Sapl位點，構建作為對照的pMT-gp91-n。2.生產(chǎn)細胞系的構建1)反轉錄病毒載體的線性化為了線性化含有eGFP或gp91的反轉錄病毒載體，10pg的反轉錄病毒質粒以限制性內(nèi)切酶(SwaI)處理16小時。含有反轉錄病毒載體的DNA片段從瓊脂凝膠上洗脫，沉淀，重懸浮于30pl的蒸餾水。測量DNA濃度后，其被用于電穿孔。2)電穿孔PG13細胞系被用于電穿孔。將含有7.5x105個細胞的0.5ml無血清DMEM培養(yǎng)基加入到0.4-cm的電轉杯(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，細胞與10pi(1j^g^l)的線性化反轉錄病毒質粒一同溫育5min，隨后進行電穿孔。使用GenePulserXcell(Bio-Rad)以200V電壓進行20msec的電穿孔。電穿孔后，懸浮液立即鋪板到含10。/4寺級FBS的DMEM培養(yǎng)基。3)篩選電穿孔后使用G-418(終濃度1)ig/ml)篩選抗新霉素的細胞。篩選10天53后，獲得帶有整合質粒的細胞。3.eGFP表達的分析PG13生產(chǎn)細胞系的5xl(^個細胞被鋪板到100mm培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)基為含10%特級FBS的DMEM培養(yǎng)基。48h后，收集上清，以0.45|nm濾膜過濾。這些上清分別被用于實時PCR測量病毒滴度和轉導HT1080細胞和K562細胞。溫育細胞48小時，隨后收集細胞進行檢測。通過FACS分析測量GFP陽性細胞的比例和GFP的表達水平(平均熒光強度)。4.gp91表達的分析PG13生產(chǎn)細胞系的5xl(^個細胞被鋪板到100mm培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)基為含10%特級FBS的DMEM培養(yǎng)基。48h后，收集含有病毒的上清，以0.45(im濾膜過濾。這些上清被用于轉導K562細胞。對于K562細胞的轉導，轉導前一天在6孔板上每孔接種2.5x105個細胞。在8pg/ml聚凝胺的存在下每孔加入相同量的病毒上清，培養(yǎng)板在32°C下以2800rpm離心90分鐘(Eppendorfcentrifiige5810R)。轉導后，細胞在37°C的C02培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2天。進行FACS定量分析gp91的蛋白表達。收集K562細胞，PBS洗滌。細胞隨后重新懸浮在100piPBS中，以1^抗-gp91的抗體(7D5)在4°C下染色30分鐘。隨后細胞以PBS洗滌兩次，重新懸浮于100plPBS，再以lpl結合PE的山羊抗小鼠抗體(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc，Birmingham,AL，USA)在4°C下染色30分鐘。隨后細胞以PBS洗滌3次，重新懸浮于500nl的PBS。借助CdlQuest數(shù)據(jù)采集和分析軟件以FACSort進行流式細胞術。圖4給出了該結果。該圖顯示了gp91陽性細胞的比例和平均熒光強度(括號內(nèi)的數(shù)值)。正如圖4所示，R1000啟動子可驅動高水平的gp91基因表達。而且，當表達盒反向插入時，R1000啟動子可產(chǎn)生更高的病毒滴度和更高水平的基因表達。事實上，含有反向R1000啟動子的載體所產(chǎn)生的病毒滴度比具有野生型MLVLTR的MT-gp91-n更高(參見gp91陽性細胞比例)。以0.5WDMF(二甲基甲酰胺，C3H7NO)處理細胞，誘導細胞分化，隨后通過二羥羅丹明-123(DHR)測定測量NADPH氧化酶的活性水平。細胞在DMF的存在下溫育6天，隨后收集進行檢測。收集的細胞以磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌2次。細胞以PBS懸浮，隨后與1.8piDHR(MolecularProbes,USA，29mM)混合。37。C溫育5分鐘后，細胞以10pl的乙酰肉豆蔻佛波醇(PMA，1昭/ml)進行刺激。隨后通過FACS分析測量活性吞噬細胞的比例及其氧化酶活性。至此已充分地描述了本發(fā)明，因此本領域的普通技術人員應理解，在不影響本發(fā)明或其任意實施方式范圍的情況下可在寬泛和等價范圍內(nèi)的條件、配方和其他參數(shù)下進行本發(fā)明。本文引用的所有專利、專利申請和出版物均通過引用的方式整體并入本文。權利要求1.一種表達載體，其包含異源內(nèi)部啟動子，所述異源內(nèi)部啟動子選自LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子或它們的片段或變體。2.如權利要求1所述的表達載體，其中所述載體包含一包含5'長末端重復(LTR)和3'LTR的核苷酸序列。3.如權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子是LENG8或其片段或變體。4.如權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子是UQCRQ或其片段或變體。5.如權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子是SNX3或其片段或變體。6.如權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子是ITGB4BP或其片段或變體。7.如權利要求1所述的表達載體，其中所述啟動子是RPL10或其片段或變體。8.如權利要求1所述的表達載體，其中所述片段具有所述全長LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子至少20%的轉錄活性。9.如權利要求8所述的表達載體，其中所述片段具有所述全長LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子至少40%的轉錄活性。10.如權利要求9所述的表達載體，其中所述片段具有所述全長LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子至少60%的轉錄活性。11.如權利要求1所述的表達載體，其中所述變體與所述LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子的序列具有至少70%的相同性。12.如權利要求11所述的表達載體，其中所述變體與所述LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子的序列具有至少80%的相同性。13.如權利要求12所述的表達載體，其中所述變體與所述LENG8、UQCRQ、SNX3、ITGB4BP或RPL10啟動子的序列具有至少90%的相同性。14.如權利要求3所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-385到約-1的序列(SEQIDNO:9的約635到1019位核苷酸)。15.如權利要求3所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-50到約+305和約+l卯8到約+2121的序列(SEQIDNO:9的約970到1538位核苷酸)。16.如權利要求15所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-100到約+305和約+1908到約+2121的序列(SEQIDNO:9的約920到1538位核苷酸)。17.如權利要求16所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-200到約+305和約+1908到約+2121的序列(SEQIDNO:9的約82G到1538位核苷酸)。18.如權利要求17所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-385到約+305和約+1908到約+2121的序列(SEQIDNO:9的約635到1538位核苷酸)。19.如權利要求18所述的表達載體，其中所述片段包含相對于LENG8轉錄起始位點約-1020到約+305和約+1908到約+2121的序列(SEQIDNO:9的約1到1538位核苷酸)。20.如權利要求7所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-350到約-1的序列(SEQIDNO:8的約651到1000位核苷酸)。21.如權利要求7所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-50到約+143的序歹U(SEQIDNO:8的約951到1143位核苷酸)。22.如權利要求21所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPU0轉錄起始位點約-100到約+143的序列(SEQIDNO:8的約901到1143位核苷酸)。23.如權利要求22所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-200到約+143的序列(SEQIDNO:8的約801到1143位核苷酸)。24.如權利要求23所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-350到約+143的序列(SEQIDNO:8的約651到1143位核苷酸)。25.如權利要求24所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-500到約+143的序列(SEQIDNO:8的約501到1143位核苷酸)。26.如權利要求25所述的表達載體，其中所述片段包含相對于RPL10轉錄起始位點約-1000到約+143的序歹iJ(SEQIDNO:8的約1到1143位核苷酸)。27.如權利要求1-26任一項所述的表達載體，其中所述載體是質粒載體。28.如權利要求1-27任一項所述的表達載體，其中所述載體編碼增強子缺失型反轉錄病毒載體。29.如權利要求1-27任一項所述的表達載體，其中所述載體是增強子缺失型反轉錄病毒載體。30.如權利要求28或權利要求29所述的表達載體，其中所述載體包含一包含5'LTR和3'LTR的核苷酸序列，其中所述3'LTR的U3區(qū)的增強子元件被缺失。31.如權利要求30所述的表達載體，其中所述5'LTR的U3區(qū)的增強子元件被缺失。32.如權利要求1-31任一項所述的表達載體，其中所述內(nèi)部啟動子是所述啟動子的片段或變體，其中包含所述片段或變體的所述載體基本保留與所述野生型啟動子相同的產(chǎn)生高病毒滴度或高轉錄水平的能力。33.如權利要求1-32任一項所述的表達載體，其中所述啟動子包含一個或多個剪接位點。34.如權利要求28-31任一項所述的表達載體，其中所述載體是基于致癌反轉錄病毒的反轉錄病毒載體。35.如權利要求34所述的表達載體，其中所述基于致癌反轉錄病毒的反轉錄病毒載體是基于MLV的反轉錄病毒載體。36.如權利要求28-31任一項所述的表達載體，其中所述載體是基于慢病毒的反轉錄病毒載體。37.如權利要求1-36任一項所述的表達載體，其中所述載體包含與所述異源內(nèi)部啟動子可操作連接的目的多核苷酸，其中含有所述內(nèi)部啟動子的所述載體可產(chǎn)生高病毒滴度和所述目的多核苷酸的高水平轉錄。38.如權利要求37所述的表達載體，其中所述目的多核苷酸編碼多肽。39.如權利要求38所述的表達載體，其中所述多肽是治療用蛋白質或報道蛋白質。40.如權利要求39所述的表達載體，其中所述多肽是eGFP。41.如權利要求39所述的表達載體，其中所述多肽是gp91。42.如權利要求37所述的表達載體，其中所述目的多核苷酸編碼RNA、反義RNA、小分子干擾RNA或核酶。43.如權利要求37所述的表達載體，其中所述目的多核苷酸還包含多聚腺苷酸化序列、IRES、絕緣子序列、剪接序列或它們的一些組合。44.包含權利要求1-43任一項所述的表達載體和適宜的載劑的組合物。45.包含權利要求1-43任一項所述的表達載體的細胞。46.如權利要求45所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。47.如權利要求46所述的細胞，其中所述細胞是人細胞。48.如權利要求46所述的細胞，其中所述細胞是生產(chǎn)細胞系。49.一種產(chǎn)生感染性反轉錄病毒顆粒的方法，其包括在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)權利要求48所述的生產(chǎn)細胞系、收集培養(yǎng)基和過濾培養(yǎng)基以獲得不含細胞的病毒上清。50.—種轉導哺乳動物細胞的方法，其包括以權利要求49所述的不含細胞的病毒上清溫育所述哺乳動物細胞。51.—種向對象輸送目的多核苷酸編碼的目的多肽或轉錄物的方法，其包括施用權利要求44所述的組合物。52.—種向對象輸送目的多核苷酸編碼的目的多肽或轉錄物的方法，其包括施用權利要求45所述的細胞。53.—種治療對象的方法，其包括施用權利要求44所述的組合物，其中所述表達載體包含編碼可用于治療的多肽或轉錄物的目的多核苷酸。54.—種治療對象的方法，其包括施用權利要求45所述的細胞，其中所述表達載體包含編碼可用于治療的多肽或轉錄物的目的多核苷酸。55.如權利要求51-54任一項所述的方法，其中所述目的多核苷酸編碼gp91。56.包含權利要求1-43任一項所述的表達載體的試劑盒。全文摘要本發(fā)明涉及內(nèi)部啟動子在哺乳動物表達載體上的應用，其中這些表達載體包括質粒載體和增強子缺失型反轉錄病毒載體。所述反轉錄病毒載體具有改善的安全性和最佳的轉基因表達水平和載體滴度。文檔編號C12N15/64GK101522899SQ200780037879公開日2009年9月2日申請日期2007年10月10日優(yōu)先權日2006年10月10日發(fā)明者李準臺,金善榮,金水晶申請人:百療醫(yī)株式會社